疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥水平影響研究

邢美榮　袁　紅　張玉林　靳文勛　李茹茹

河北省保定市腦血管病醫(yī)院(保定 071000)

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疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥水平影響研究

邢美榮袁紅△張玉林靳文勛李茹茹

河北省保定市腦血管病醫(yī)院(保定 071000)

摘要目的：探討疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠缺血性腦損傷的保護(hù)和作用機(jī)制，為二者聯(lián)合應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。方法：將100只大鼠，隨機(jī)分成5組，每組20只。A組：單獨(dú)疏血通治療組；B組：單獨(dú)依達(dá)拉奉治療組；C組：疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉治療組；D組：陰性對照組(注射相同劑量生理鹽水)；E組：假手術(shù)組(注射相同劑量生理鹽水)。各組大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注手術(shù)缺血2 h后，進(jìn)行靜脈給藥。后行神經(jīng)行為學(xué)評分，腦組織中SOD活性和MDA含量的測定，ELISA法測定大腦組織IL-1β和TNF-α含量水平。結(jié)果：神經(jīng)行為學(xué)評分可見E組與其他組評分有明顯差異，評分很低；陰性對照組D組與3組治療組對照差異也有明顯性，評分較高；聯(lián)合用藥C組與A組、B組比較得分明顯較低，差異有顯著性。腦組織中SOD活性，GSH和MDA含量以及IL-1β、TNF-α的測定，可見C組患者情況明顯好于A組、B組情況。結(jié)論：疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對防治腦缺血疾病具有更好的療效。

主題詞腦缺血@疏血通動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)大鼠

在缺血性腦血管的康復(fù)治療中，恢復(fù)缺血區(qū)的血流供應(yīng)是避免腦組織缺血損傷的首要條件，但與此同時(shí)帶來的再灌注損傷也是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[1]。疏血通注射液主要用于治療缺血性腦血管病患者，其主要成分為水蛭和地龍，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)的作用，在臨床治療中取得了一定療效。已經(jīng)被日本的權(quán)威機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)通過治療中風(fēng)患者的依達(dá)拉奉(Edaravone)是一種新型羥自由基清除劑，能夠抑制脂質(zhì)過氧化，防止神經(jīng)元遲發(fā)性損傷。大量已發(fā)表的體內(nèi)及體外研究表明疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對治療缺血性腦血管疾病中的作用，對腦卒中、腦梗塞等具有良好的療效。故本研究在整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平的基礎(chǔ)上建立大鼠腦缺血再灌注模型，探討疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對大鼠缺血性腦損傷的保護(hù)和作用機(jī)制，為二者聯(lián)合應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1材料1.1局灶性腦缺血再灌注大鼠模型(MCAO)的制作先用10%水合氯醛(300 mg/kg)于大鼠腹腔注射將其麻醉，然后固定于鼠臺(tái)，行頸正中切口，依次分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。在大鼠ECA近端備線，用無損傷動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉其遠(yuǎn)端，CCA分叉處做一切口，插入4-0尼龍線，推進(jìn)17～20 mm時(shí)可感阻力，表明栓線頭端已經(jīng)通過大腦中動(dòng)脈(MCA)的起始處，阻斷MCA部分血流來源。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同上。

1.2動(dòng)物100只大鼠隨機(jī)分成5組，每組20只。A組：單獨(dú)疏血通治療組；B組：單獨(dú)依達(dá)拉奉治療組；C組：疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉治療組；D組：陰性對照組(注射相同劑量生理鹽水)；E組：假手術(shù)組(注射相同劑量生理鹽水)。各組大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)再灌注手術(shù)缺血2 h后，進(jìn)行靜脈給藥。

2實(shí)驗(yàn)方法2.1大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分大鼠局灶性腦缺血再灌注24 h后，觀察存活大鼠的行為變化，參考Zea-longa的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，得分越高說明大鼠神經(jīng)損傷導(dǎo)致的行為障礙越嚴(yán)重：行為正常，無神經(jīng)功能損傷的為0分；對側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能損傷的為1分；行走時(shí)，向癱瘓側(cè)不停轉(zhuǎn)圈的為2分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒及不能站立為3分；不能行走，完全喪失意識(shí)的為4分；死亡的為5分。

2.2大鼠腦組織中SOD活性和MDA含量的測定缺血再灌注24 h后，大鼠斷頭處死，測SOD活性和MDA含量。SOD活力檢測采用黃嘌呤氧化法，SOD活力以每毫克組織蛋白中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)表示，單位為U/mg prot；用硫代巴比妥酸顯色法測定腦組織MDA含量，單位nmol/mg prot。嚴(yán)格按照試劑盒操作測定。

2.3大鼠腦部炎癥因子檢測拔線再灌注24 h后，各組大鼠立即斷頭，剝離大腦，提取組織總RNA，RT-PCR法檢測IL-1β、TNF-α等相關(guān)炎癥基因表達(dá)水平，ELISA法測定大腦組織IL-1β和TNF-α含量水平。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS11.0軟件分析，計(jì)量資料治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，均選取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3結(jié)果3.1神經(jīng)行為學(xué)評分可見假手術(shù)組E組與其他組評分有明顯差異，評分很低；陰性對照組D組與3組治療組對照差異也有明顯性，評分較高；聯(lián)合用藥C組與A組、B組比較得分明顯較低，差異有顯著性。

3.2腦組織中SOD活性GSH和MDA含量以及IL-1β、TNF-α的測定，可見C組患者情況明顯好于A組、B組情況。

4討論缺血性腦損傷的復(fù)雜性和某些環(huán)節(jié)的尚不確定性都說明了藥物神經(jīng)保護(hù)的困難性，靶點(diǎn)單一的神經(jīng)保護(hù)劑不能完全阻斷復(fù)雜的缺血級聯(lián)反應(yīng)。因此，有學(xué)者提出雞尾酒療法，即作用于腦缺血級聯(lián)不同環(huán)節(jié)的神經(jīng)保護(hù)劑聯(lián)合應(yīng)用，例如自由基清除劑和谷氨酸拮抗劑的聯(lián)合使用，聯(lián)合用藥的優(yōu)點(diǎn)還在于減少藥物的使用劑量和毒副作用[2]。

中藥在腦缺血的預(yù)防和治療方面有獨(dú)特的作用，且越來越受到人們的重視。中藥及一些復(fù)方制劑主要是通過活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)等方法多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的發(fā)揮作用，而腦缺血再灌注損傷的機(jī)制復(fù)雜[3-5]，也是多種因素共同作用的，二者相契合。目前臨床上常用且有肯定療效的主要有丹參、川芎、水蛭、葛根素、銀杏制劑及一些復(fù)方制劑等[6]。疏血通注射液主要成分為水蛭和地龍，具有活血化瘀，通經(jīng)活絡(luò)等作用，臨床上主要用于治療腦梗死患者，且已取得了一定的療效[7]。Meta分析結(jié)果顯示，疏血通注射液治療腦梗死在短期改善總有效率指標(biāo)上優(yōu)于對照組藥物，能更好的降低身價(jià)功能缺損評分值，同時(shí)在改善血液流變學(xué)指標(biāo)的程度上也強(qiáng)于對照組藥物。另外在安全性方面，疏血通注射液不良反應(yīng)較少，并且不良反應(yīng)較為輕微，主要表現(xiàn)為過敏，一般不需要特殊處理[8]。

缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多種因素共同作用的病理過程，在缺血級聯(lián)反應(yīng)的每一過程中均存在可干預(yù)的途徑。因此如何有效地阻斷腦缺血的級聯(lián)反應(yīng)是目前神經(jīng)保護(hù)劑治療的研究重點(diǎn)[9-11]。依達(dá)拉奉作為自由基清除劑在臨床治療急性腦梗塞已具有很好的療效，而上述研究已證實(shí)疏血通具有顯著的抗免疫炎癥、抗氧化作用和神經(jīng)保護(hù)作用，提示我們疏血通聯(lián)合依達(dá)拉奉對防治腦缺血疾病具有更好的療效。

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(收稿2016-01-28；修回2016-03-05)

【中圖分類號】R722.15

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.06.053

△河北大學(xué)附屬醫(yī)院病案室(保定 071000)