指紋圖譜測定方法及研究進(jìn)展

劉健

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧沈陽110161）

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·研究綜述·

指紋圖譜測定方法及研究進(jìn)展

劉健

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，遼寧沈陽110161）

摘要：本文綜述了指紋圖譜的測定方法，重點(diǎn)介紹了薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀；并且對指紋圖譜信息處理的主要技術(shù)聚類分析法和主成分分析法進(jìn)行了概述，為指紋圖譜技術(shù)在作物上的應(yīng)用提供了參考。

關(guān)鍵詞：指紋圖譜；薄層色譜；高效液相色譜法；氣相色譜；分析方法

指紋圖譜技術(shù)是運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)得到的能夠標(biāo)示某些復(fù)雜天然植物的色譜或光譜的圖譜，最終用于評價(jià)其質(zhì)量的科學(xué)方法［1］，是近年來伴隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)及信息技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的在復(fù)雜物質(zhì)的質(zhì)量控制中具有廣泛應(yīng)用的1項(xiàng)新技術(shù)，是對物質(zhì)或者樣品進(jìn)行全面的、定量的物質(zhì)鑒定和質(zhì)量控制的1種手段，以真實(shí)性、同質(zhì)性來評價(jià)產(chǎn)品質(zhì)量及穩(wěn)定性，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品等很多領(lǐng)域。

1　指紋圖譜的測定方法

指紋圖譜通常通過使用色譜和光譜等儀器獲得。色譜法包括傳統(tǒng)的薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）和高速逆流色譜（HSCCC）等，光譜法包括紫外光譜法、紅外光譜法、X射線衍射法和近紅外光譜法等，還有其它波譜方法，如核磁共振法、質(zhì)譜等［2］。現(xiàn)階段，TLC、HPLC和GC色譜技術(shù)為公認(rèn)的3種常規(guī)的分析手段，是目前研究指紋圖譜優(yōu)先考慮的方法［3］。

1.1薄層色譜（TLC）指紋圖譜

薄層色譜（TLC）因其具有操作簡單、快速可靠、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)成為常用的測定指紋圖譜的方法，它利用中藥各成分性質(zhì)上的差異在薄層上分離后相對位移值的不同進(jìn)行鑒別［4］。TLC的優(yōu)勢是能夠提供直觀形象的可見光或熒光圖像，配合色譜掃描或數(shù)碼處理后可得到不同層次的輪廓圖譜和相應(yīng)積分?jǐn)?shù)據(jù)。但由于TLC是1種開放的色譜系統(tǒng)，受外界因素影響較多，因此重現(xiàn)性與精密度差，不能完全滿足指紋圖譜研究的要求，所以目前有關(guān)薄層色譜指紋圖譜的研究較少。

周漩等［5］用乙酸乙酯提取不同產(chǎn)地高良姜樣品黃酮類有效成分并以薄層色譜法進(jìn)行分離分析，建立其TLC特定指紋圖譜，以薄層色譜掃描法對色譜圖進(jìn)行定量的掃描，結(jié)果用主成分分析法進(jìn)行處理，并從整體上比較各特定指紋圖譜的差異。研究表明，TLC指紋圖譜可有效對高良姜進(jìn)行產(chǎn)地鑒別及質(zhì)量評價(jià)。關(guān)明［6］等運(yùn)用TLC對不同地理群居的大蒜進(jìn)行了比較分析，通過分析TLC指紋圖譜的相似度，發(fā)現(xiàn)不同地理環(huán)境條件下的大蒜在活性成分的相對含量上有不同程度的差異（基本分為5類），同時(shí)TLC指紋圖譜可作為分析大蒜來源和質(zhì)量控制的重要依據(jù)。

1.2高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜

高效液相色譜（HPLC）適合分析復(fù)雜體系，通過與不同檢測器聯(lián)用，有針對性地檢測分析復(fù)雜體系中的不同化學(xué)成分，具有高速、高效、高靈敏度、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，且不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制。大多數(shù)成分均可在HPLC上進(jìn)行分析檢測，因此HPLG成為指紋圖譜中應(yīng)用最廣的一類。

張聰［7］等采用HPLC指紋圖譜法對不同品種的中國紅參和高麗紅參進(jìn)行了對比研究，發(fā)現(xiàn)不同品種的中國紅參和高麗紅參的色譜峰重疊率低，僅為60%左右，故用HPLC指紋圖譜可作為區(qū)分不同的紅參品種的重要依據(jù)。游松等［8］采用HPLC法對銀杏葉注射劑進(jìn)行了指紋圖譜研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有參數(shù)均符合國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于中藥注射劑的技術(shù)要求。

1.3氣相色譜（GC）及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/ MS）指紋圖譜

GC是1種以氣體為流動(dòng)相的柱色譜法，多用于揮發(fā)性物質(zhì)的分離檢測，具有高效、高專屬性、高靈敏度、分析速度快等特點(diǎn)。GC不僅可以分析有機(jī)物，還可以分析部分的無機(jī)物，具體應(yīng)用時(shí)多與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，即氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）。

黃天來等［9］研究了生姜所含揮發(fā)油成分的GC指紋圖譜。結(jié)果表明，生姜揮發(fā)油成分指紋圖譜由5組峰群組成，各組峰群清晰可辨，分離度較好。該方法準(zhǔn)確簡單，為生姜的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供了依據(jù)。劉偉等［10］采用GC法建立了懷菊花揮發(fā)性成分的指紋圖譜，共確定了27個(gè)共有峰，為懷菊花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了有效的方法。曹慧等［11］在桂花品種香氣成分的GC-MS指紋圖譜研究中發(fā)現(xiàn)金桂中的香氣組分最多，丹桂中最少，3個(gè)桂花品種均含有的香氣組分為順-羅勒烯、乙酸-4-己烯酯、順-芳樟醇氧化物、反-芳樟醇氧化物、β-芳樟醇、α-紫羅酮和β-紫羅酮。運(yùn)用相似度評價(jià)法和主成分分析法對桂花香氣成分的GC-MS指紋圖譜進(jìn)行判別分析可準(zhǔn)確歸類鑒別出不同品種的桂花樣本。

2　指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理方法

對指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理必須依靠統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)方法，海量、多維的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件的分析才能得到適合的、能充分反應(yīng)差異以及統(tǒng)一性的結(jié)論。因此，在得到樣品的指紋圖譜信息后如何計(jì)算各圖譜間的相似度、量化他們之間的差異是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前，用于指紋圖譜信息處理的主要技術(shù)有聚類分析法、主成分分析法等。

2.1聚類分析法

聚類分析是把未進(jìn)行信息分類的資料按相似程度歸類。聚類分析所用的方法大致分為兩類：系統(tǒng)聚類法和非系統(tǒng)聚類法。對同一數(shù)據(jù)選用不同的聚類方法進(jìn)行分析得到的結(jié)果很有可能不同，只有選用合適的聚類分析方法才能得到理想的處理結(jié)果［12］。邢旺興等［13］對紅曲基原菌的鑒別采用了GC—模糊聚類分析法，具有一定的實(shí)用價(jià)值。李玉鋒等［14］利用HPLC法分析測定了11種貝母樣品，根據(jù)得到的HPLC圖譜對不同化學(xué)組分的保留時(shí)間、相對峰面積采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法計(jì)算相鄰兩個(gè)色譜峰分離的程度和質(zhì)量，并進(jìn)行聚類分析。結(jié)果證實(shí)聚類分析的結(jié)果與其植物學(xué)分類是相一致的。

2.2主成分分析法

在研究中會(huì)經(jīng)常遇到多指標(biāo)問題，指標(biāo)間往往存在一定相關(guān)性，直接分析可能會(huì)導(dǎo)致多元共線性而不能得出正確結(jié)論。主成分分析利用降維思想通過線性變換將原始數(shù)據(jù)中的多個(gè)指標(biāo)組合成相互獨(dú)立并能充分反映總體樣本信息的幾個(gè)少數(shù)指標(biāo)，既不丟掉主要信息又能避免共線性的問題。主成分分析只能作為中間手段，提取出的主成分只要能包含主要信息即可，便于進(jìn)一步分析，不一定有準(zhǔn)確的實(shí)際意義［12］。

曹慧等［11］在桂花品種香氣成分的GC-MS指紋圖譜研究中以特征峰的相對峰面積作為參量，分別利用指紋圖譜相似度評價(jià)法和主成分分析法對桂花樣本進(jìn)行歸類和鑒別，對我國桂花資源開發(fā)利用提供了重要的科學(xué)根據(jù)。

植物指紋圖譜技術(shù)已有許多成功應(yīng)用的先例。隨著儀器分析及指紋圖譜技術(shù)的日漸成熟，借助指紋圖譜技術(shù)對作物進(jìn)行質(zhì)量控制和定位就顯得尤為重要。因此，對作物中芳香類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的研究及致香物質(zhì)對作物質(zhì)量穩(wěn)定性控制的方法研究，定將成為作物品質(zhì)判斷及風(fēng)格特色定位等領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

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