星點設計-效應面法優(yōu)化精白霧化吸入液提取工藝

杜 陽， 夏新華*， 賀蘭芝， 曾建國， 劉艷科

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南長沙410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙410004）

?

星點設計-效應面法優(yōu)化精白霧化吸入液提取工藝

杜 陽1， 夏新華1*， 賀蘭芝1， 曾建國2， 劉艷科2

（1.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南長沙410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙410004）

摘要：目的 用星點設計-效應面法優(yōu)選精白霧化吸入液的最佳提取工藝。方法 在單因素試驗的基礎上，以浸泡時間、加水量、提取時間為自變量，以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為評價指標，用效應面法選擇最佳提取工藝。結果 確定精白霧化吸入液的最佳提取工藝為加水浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分別為10、8倍，提取時間分別為2.5、2.0 h。結論 星點設計-效應面法優(yōu)選出的提取工藝簡單、穩(wěn)定，預測性良好，可為精白霧化吸入液的工業(yè)化生產提供實驗依據。

關鍵詞：精白霧化吸入液；多糖；浸膏；星點設計-效應面法；提取工藝

精白霧化吸入液由黃精、白及兩味中藥組成，具有益肺、殺蟲、化瘀新生之功效，臨床以霧化吸入方式給藥，對治療肺結核具有一定療效。方中黃精、白及所含多糖為本制劑的主要活性成分，其藥理作用已有大量文獻報道［1 -3］，具有增強免疫力、抗衰老、抗炎、抗菌、抗病毒等作用。為提高本制劑的質量，確保臨床治療效果，本實驗根據多糖的性質，采用水煎煮法進行提取，并以多糖提取率和浸膏提取率的綜合評分為指標，用星點設計-效應面法對提取工藝進行了優(yōu)選。

1 材料

1.1 儀器與設備 TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；DK-98 -Ⅱ型水浴鍋、98 -1 -B型電子調溫電熱套（天津市泰勒特儀器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵、RE-52型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6020AB型真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；YD601N型電子天平（上海恒平科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201205）。黃精、白及（湖南三湘中藥飲片有限公司）。水為蒸餾水；所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 多糖得率的測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品33.6 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取提取液1 mL，加無水乙醇5 mL，搖勻，離心30 min（轉速3 500 r/min），沉淀加水溶解，置于50 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的建立 精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，加蒸餾水至2 mL，搖勻，在冰浴中緩慢滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置沸水中水浴10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻至室溫，取出，以相應試劑為空白，按照紫外可見分光光度法，在502 nm波長處測定吸光度。以吸光度對濃度進行線性回歸，得回歸方程Y=0.044 2X+0.055 6（R2=0.999 4），表明無水葡萄糖在3.36～20.16 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密量取對照品溶液0.5 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3”項下方法測定其吸光度，連續(xù)測定6次。結果，RSD為0.22％，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3”項下方法，在室溫下每隔15 min測定1次光密度，從0 h開始，連續(xù)測定6次。結果，RSD為0.95％，表明供試品溶液在1.5 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復性試驗 精密量取6份同批供試品溶液，每份0.5 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，按“2.1.3”項下方法分別測定其吸光度。結果，RSD為1.67％，表明重復性良好。

2.1.7 加樣回收率 精密量取6份含有量已知的同批供試品溶液，每份0.5 mL，分別精密加入質量濃度為66.73 μg/mL的葡萄糖對照品溶液0.5 mL，混勻按“2.1.3”項下方法分別測定其光密度。結果，平均回收率為107.2％，RSD為1.93％。

2.1.8 總多糖得率的測定 精密量取供試品溶液0.5 mL，置于10 m L具塞試管中，按“2.1.3“項下方法測定光密度，計算多糖得率。

2.2 浸膏得率的測定 精密量取水提液25 mL，置于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃下干燥3 h，轉移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計算浸膏得率。

2.3 綜合評分的計算 采用加權平分法，按多糖得率與浸膏得率的權重比（8∶2）計算綜合評分，綜合評分=［（多糖得率/最大多糖得率）×0.8 +（浸膏得率/最大浸膏得率）×0.2］×100。

2.4 單因素試驗

2.4.1 浸泡時間考察 取黃精、白及各25 g，共5份，加入10倍量水，分別浸泡0、0.5、1、1.5、2 h，回流提取2 h，提取1次，收集提取液，按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率，結果見圖1。

圖1　浸泡時間的考察

2.4.2 加水量考察 取黃精、白及各25 g，共5份，浸泡時間均為1 h，提取2次，加水量分別為6（4，2）、10 （6，4）、14（8，6）、18（10，8）、22（12，10）倍，提取時間為3.5（2，1.5）h，收集提取液，按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率，結果見圖2。

圖2　加水量的考察

2.4.3 提取時間考察 取黃精、白及各25 g，共5份，加水浸泡1 h，提取2次，加水量為14（8，6）倍，提取時間分別為1.5（1，0.5）、2.5（1.5，1）、3.5（2，1.5）、4.5（2.5，2）、5.5（3，2.5）h，收集提取液，按上述方法分別測定多糖得率與浸膏得率，結果見圖3。

圖3　提取時間的考察

2.5 星點設計-效應面法優(yōu)選

2.5.1 試驗設計［4-6］在單因素試驗基礎上，以浸泡時間、加水量、提取時間為考察因素，每個因素設計五個水平進行星點設計試驗，以綜合評分為指標進行工藝優(yōu)選。因素水平見表1，試驗安排及結果見表2。

表1　精白霧化吸入液提取工藝星點設計-效應面法因素水平表

表2　精白霧化吸入液提取工藝星點設計-效應面法設計及結果

2.5.2 模型擬合 運用Design-Expert 7.0軟件，以綜合評分為因變量（Y）對各因素進行多元回歸和二項式擬合，所得多元線性方程為Y=74.79 +4.40A+2.52B+12.02C （P＜0.05，R2=0.792 6）；多元二項式擬合方程為Y= 78.19 +4.40A+2.52B+12.02C-1.02AB+4.81AC-0.36BC-3.97A2+0.13B2-1.06C2（P＜0.01，R2= 0.943 9）。由兩種模型的R2可知，多元二項式模型擬合的效果優(yōu)于多元線性回歸模型，方差分析見表3。

表3　效應面二次模型方差分析

由表3可知，各因素對提取工藝影響的大小順序為C＞A＞B。其中，C（提取時間）和A（浸泡時間）的二次項A2影響極顯著（P＜0.01），交互因素AC影響顯著，而因素B、交互因素AB與BC、二次項B2與C2均無顯著性影響。

2.5.3 工藝優(yōu)選與預測 Design-Expert 7.0軟件處理，各因素對提取工藝的影響見圖4～6。由圖可知，綜合評分較高的提取工藝區(qū)間A為0.42～1.58 h，B為9.38～18.62倍，C為2.35～4.65 h，然后在以上區(qū)間內的效應值中選擇極大值，所得最佳提取工藝參數為浸泡時間1.58 h，加水量18.62倍，提取時間4.65 h。根據二次回歸模型方程所得理論值，得到多糖得率11.95％，浸膏得率38.20％，綜合評分95.57。

考慮到生產實際和操作，將上述優(yōu)選工藝條件修正為加水浸泡1.5 h，回流提取2次，加水量分別為10、8倍，提取時間分別為2.5、2 h。

2.5.4 驗證試驗 根據以上優(yōu)選的工藝條件，取黃精、白及各25 g，共3份，進行最優(yōu)工藝驗證試驗，并對試驗結果取平均值，然后與擬合方程的預測值進行比較。結果，實測值與預測值相近，表明上述預測模型擬合度良好，見表4。

表4　3批樣品最佳工藝驗證試驗

圖4　浸泡時間與加水量對提取的影響

圖5　浸泡時間與提取時間對提取的影響

圖6　加水量與提取時間對提取的影響

2.6 提取次數的考察 在上述星點驗證試驗提取2次的基礎上，取藥渣加8倍量水，進行第3次提取，提取時間為2.0 h，將藥液定容至500 mL，分別測定總多糖含有量和浸膏得率，并計算綜合評分。結果表明，第3次提取液中各指標值占3次提取液各指標值總和的百分比均＜10％。因此，從降低生產成本角度考慮，確定以提取2次為宜。

3 討論

方中黃精、白及均含有大量多糖，具有免疫增強作用［7］，能加快肺結核的痊愈過程。同時，當多糖濃度達到15～20 mg/mL時，抑菌效果甚至優(yōu)于50 ppm的鏈霉素［8-9］，故本實驗以多糖得率為評價指標具有一定合理性。

星點設計是國外常用的實驗設計方法，近年來國內也有將其用于優(yōu)化處方或成型工藝的報道［10-14］。本實驗在進行星點設計之前，對擬考察的因素進行了單因素試驗，其結果可為星點設計中各因素水平中心點與極值點（試驗范圍）的確定提供實驗依據，避免因盲目選擇試驗點造成試驗區(qū)域遠離較優(yōu)區(qū)，導致試驗設計不能達到優(yōu)化工藝條件的目的，同時也避免了因試驗失敗造成的各種損失。在星點設計中，各因素的中心點一般可結合專業(yè)知識，選擇單因素試驗中效應值最大的點（水平）或其相近的點，這將有助于提高試驗模型預測的準確度。

星點設計是一種新型的試驗設計方法，在藥學應用上成效顯著。與國內運用廣泛的均勻設計和正交設計相比，它是通過非線性模型擬合來得出最佳條件，具有試驗精度高、預測性好等特點［15］。本實驗進行了6次中心點重復試驗，較好地保證了精度，同時根據二次回歸模型方程，得到的理論值分別為多糖得率11.95％，浸膏得率38.20％，綜合評分95.57。然后按照模型優(yōu)選出的最佳工藝進行了驗證試驗，將結果與理論值比較，發(fā)現(xiàn)偏差為3.42％，說明該模型預測性良好。

另外，通過方差分析和三維效應面圖，可以直觀看出各因素間的交互作用以及其影響藥材浸出效果的規(guī)律，有助于選擇試驗的最優(yōu)方案。

參考文獻：

［1］ 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究［J］.食品科學，2007，28（8）：55-57.

［2］ 張庭廷，夏曉凱，陳傳平，等.黃精多糖的生物活性研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2006，12（7）：42-45.

［3］ 王愛民，王永林，鄭 林，等.白及藥材中多糖的含量測定［J］.中國中藥雜志，2009，34（22）：2963-2965.

［4］ 李攀登，張崇禧，李金玲，等.星點設計-效應面法優(yōu)化刺五加葉提取工藝［J］.藥物分析雜志，2010，30（6）：1064-1068.

［5］ 涂瑤生，紹 林，孫冬梅，等.星點設計-效應面法優(yōu)選苦參提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（5）：34-37.

［6］ 白艷杰，孫國祥，王 平.星點設計-效應面法優(yōu)化小檗堿β-環(huán)糊精包合物制備工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（4）：63-68.

［7］ 方積年，丁 侃.天然藥物—多糖的主要生物活性及分離純化方法［J］.中國天然藥物，2007，5（5）：338-347.

［8］ 董治程，謝昭明，黃 丹，等.黃精資源、化學成分及藥理作用研究概況［J］.中南藥學，2012，10（6）：450-453.

［9］ 鄭春艷，汪好芬，張庭廷.黃精多糖的抑菌和抗炎作用的研究［J］.安徽師范大學學報，2010，33（3）：272-275.

［10］ 孫 磊，王玉蓉.星點設計-效應面法優(yōu)選遠志的提取工藝［J］.中成藥，2006，28（3）：328-331.

［11］ 楊 濤，盛歡歡，李 巖，等.星點設計-效應面法優(yōu)化穿心蓮提取工藝［J］.中國藥學雜志，2011，46（3）：208-213.

［12］ 鄒小艷，魏立新，杜玉枝，等.星點設計-效應面法優(yōu)化川西獐牙菜提取工藝［J］.中草藥，2008，39（5）：692-696.

［13］ 陳海亭，尹蓉莉，陳金玉，等.星點設計-效應面法優(yōu)化山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片處方［J］.中成藥，2011，33（10）：1688-1692.

［14］ 吳云娟，沙先誼，李 嬋，等.星點設計效應面優(yōu)化法優(yōu)化三七總皂苷鼻腔用粉霧劑［J］.中成藥，2005，27（1）：10-15.

［15］ 劉艷杰，項榮武.星點設計效應面法在藥學試驗設計中的應用［J］.中國現(xiàn)代應用藥學雜志，2007，24（6）：455-457.

*通信作者：夏新華（1962—），男，博士，教授，博士生導師，從事中藥新制劑、新劑型、新技術及制劑質量標準的研究。Te1：（0731）88458305，E-mai1：xiaxinhua001@163.com

作者簡介：杜 陽（1987—），女，碩士生，從事中藥新制劑及制劑質量標準的研究。Te1：18975895818，E-mai1：328540252@qq.com

基金項目：國家科技重大專項（2013ZX10005004 -003 -001）

收稿日期：2014-09-23

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.044

中圖分類號：R284.2

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）01-0184-04

網絡出版日期：2015-03-18

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20150318.0952.001.htm1