人類未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)研究進(jìn)展

胡燎燎，張 靜，鄭月慧

(南昌大學(xué)a.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心； b.第一附屬醫(yī)院生殖中心；c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，南昌 330006)

人類未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)研究進(jìn)展

胡燎燎a，張 靜b，鄭月慧c

(南昌大學(xué)a.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心； b.第一附屬醫(yī)院生殖中心；c.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，南昌 330006)

隨著人類生育年齡的推遲及二胎政策的全面放開(kāi)，不孕癥、卵巢早衰、卵巢儲(chǔ)備功能不足等女性生殖疾病罹患率也呈逐年上升趨勢(shì)。人類未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養(yǎng)一直是國(guó)內(nèi)外生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。體外培養(yǎng)卵泡生長(zhǎng)狀態(tài)受獲取卵泡途徑、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)方案等多種因素影響。文章就人類未成熟卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)的臨床適應(yīng)證、培養(yǎng)方案及影響因素作一綜述，為相關(guān)研究人員和臨床工作者提供參考。

未成熟卵母細(xì)胞； 體外成熟培養(yǎng)； 培養(yǎng)方案； 影響因素； 人類

隨著二胎政策的全面放開(kāi)，女性的生育需求日益強(qiáng)烈，但多囊卵巢綜合征、卵泡發(fā)育遲緩、卵巢儲(chǔ)備功能不足等卵子成熟障礙所致不孕癥的發(fā)生率也呈快速上升趨勢(shì)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界不孕癥患者已達(dá)1億左右，中國(guó)的不孕率已由20年前的3%提高至12%左右[1]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，越來(lái)越多的不孕不育患者選擇人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)繁衍后代。傳統(tǒng)的ART是指人工授精(artificial insemination，AI)和體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)，而人類未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟(in vitro maturation，IVM)培養(yǎng)是一項(xiàng)新的ART衍生技術(shù)。由于IVM技術(shù)可避免傳統(tǒng)的IVF引起的卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)[2]，并可減少治療費(fèi)用，因此近30年來(lái)受到廣泛關(guān)注[3-4]。1991年，Cha等[5]首次對(duì)不孕癥患者應(yīng)用IVM技術(shù)，并誕下1名健康嬰兒。目前，世界范圍內(nèi)約有5000名IVM試管嬰兒誕生[6]，而國(guó)內(nèi)掌握IVM技術(shù)的醫(yī)院和機(jī)構(gòu)較少。筆者就人類未成熟卵母細(xì)胞的IVM培養(yǎng)研究進(jìn)展作一綜述。

1 IVM的優(yōu)點(diǎn)與臨床適應(yīng)證

IVF方案要求患者接受一段時(shí)間的促性腺激素(gonadotropins，Gn)治療以促進(jìn)排卵。部分接受治療的女性，尤其是多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)患者，由于過(guò)度刺激卵巢，而易導(dǎo)致OHSS。IVM在體外進(jìn)行，無(wú)需或僅需少量激素作用，具有減少治療費(fèi)用、避免藥物不良反應(yīng)、簡(jiǎn)化醫(yī)療監(jiān)控過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)。由于技術(shù)不成熟等原因，IVM卵母細(xì)胞成熟率及發(fā)育潛能較自然狀態(tài)下的體內(nèi)卵母細(xì)胞低，受孕率較IVF卵母細(xì)胞低。目前，IVM主要的臨床適應(yīng)證有：1)伴有PCOS的不孕癥。2)有生育要求的癌癥患者，如小竇狀卵泡在體外培養(yǎng)46～48 h即可發(fā)育成熟，因此即將進(jìn)行放、化療而需短期內(nèi)采取生殖力保存措施的患者可選擇IVM替代IVF。2014年，Prasath等[7]首次報(bào)道卵巢癌患者行卵巢切除術(shù)后，采用IVM卵母細(xì)胞發(fā)育、受精而來(lái)的胚胎進(jìn)行冷凍保存，最終成功產(chǎn)下嬰兒。3)LH受體缺陷的患者也可采用IVM體外獲取成熟卵母細(xì)胞[8]。

2 IVM實(shí)施方案

根據(jù)Gn使用情況，將IVM實(shí)施方案大致分為以下幾種：1)經(jīng)典IVM方式：最早的IVM技術(shù)方案中不加入任何Gn。當(dāng)卵泡直徑達(dá)到10～12 mm而未形成優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。該方案不僅適用于PCOS患者，還適用于排卵正常的個(gè)體。2)添加卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)培養(yǎng)。FSH對(duì)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟十分重要，F(xiàn)SH水平不足或缺乏會(huì)影響排卵。在培養(yǎng)時(shí)加入小劑量FSH可增加獲卵數(shù)、體外培養(yǎng)成熟率以及妊娠率[9-10]。一般在體外培養(yǎng)的第3天加入100～150 U 的FSH，連續(xù)3d至卵泡達(dá)到10～12 mm[11]。人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)含F(xiàn)SH和LH，可促進(jìn)IVM卵母細(xì)胞生長(zhǎng)，增加獲卵數(shù)和妊娠率[12-13]。3)添加人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)培養(yǎng)。在培養(yǎng)時(shí)，加入hCG(一般為10 000 U)有助于卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)[14]，并能夠增加妊娠率。有研究[15-16]顯示，當(dāng)PCOS患者行IVM時(shí)，hCG可以顯著提高卵母細(xì)胞成熟率、受精率、妊娠率和出生率。4)聯(lián)合使用FSH和hCG。當(dāng)體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時(shí)，聯(lián)合使用FSH和hCG可進(jìn)一步提高獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞成熟率、種植率和臨床妊娠率[17]。

3 影響因素

與自然狀態(tài)下和傳統(tǒng)的IVF等輔助生殖技術(shù)中卵母細(xì)胞成熟方式不同，IVM未成熟卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂在體外完成，該過(guò)程受多種因素影響。

3.1 取卵方式與時(shí)間

用于IVM的未成熟卵泡可直接從陰道采集，也可從手術(shù)切除的體外卵巢組織上采集[18-19]。用于IVM的卵母細(xì)胞恢復(fù)能力受陰道采集時(shí)的抽吸壓力和針頭型號(hào)的影響。較高吸取壓力和較粗針頭有利于卵母細(xì)胞恢復(fù)，但會(huì)損傷卵母細(xì)胞外的卵丘細(xì)胞。與IVF獲取卵母細(xì)胞不同，陰道獲取卵母細(xì)胞用于IVM時(shí)，需縮短采集針的長(zhǎng)度，增加針的硬度，并減小吸取時(shí)的壓力(大約為56 mmHg)[4]。有文獻(xiàn)[20]報(bào)道，將卵母細(xì)胞采集針?lè)磸?fù)在卵巢基質(zhì)上抽吸的過(guò)程中逐漸增加抽吸壓力，可采集到更多卵泡。卵泡越小，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂進(jìn)而發(fā)育成熟的能力越弱，但體積較大的優(yōu)勢(shì)卵泡可分泌大量雌激素而引起周圍卵泡閉鎖。因此，過(guò)早或過(guò)晚結(jié)束培養(yǎng)都會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。目前，一般在卵泡直徑達(dá)到10～12 mm時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。有研究[21]表明，如果在結(jié)束培養(yǎng)前35～38 h加入hCG，在結(jié)束培養(yǎng)時(shí)的卵母細(xì)胞的直徑大小將對(duì)培養(yǎng)結(jié)果無(wú)明顯影響。

3.2 體外培養(yǎng)方法

在體外培養(yǎng)時(shí)的卵泡所處空間結(jié)構(gòu)的不同，卵泡體外培養(yǎng)方法被大致分為微滴(一維)培養(yǎng)、二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)。將卵泡直接放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行一維法培養(yǎng)時(shí)，不利于卵母細(xì)胞與其周圍顆粒細(xì)胞之間的相互作用，且卵泡因重力作用而失去三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響卵母細(xì)胞生長(zhǎng)[22]。目前，常采用二維培養(yǎng)法和三維培養(yǎng)法對(duì)卵泡進(jìn)行培養(yǎng)。利用顆粒細(xì)胞或STO細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部鋪飼養(yǎng)層可構(gòu)建二維培養(yǎng)環(huán)境，而在海藻酸鈉水凝膠等特殊材料包裹后，包埋培養(yǎng)可構(gòu)造三維立體結(jié)構(gòu)的卵泡培養(yǎng)環(huán)境[23]。另外，卵泡生長(zhǎng)受到組織密度的調(diào)節(jié)，低密度條件下卵泡可加速生長(zhǎng)[24]。Xiao等[25]采用“兩步法”，通過(guò)IVM培養(yǎng)而成功獲取成熟卵母細(xì)胞，即在三維培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)竇前卵泡至竇狀卵泡階段，隨后去除部分卵泡，使細(xì)胞密度降低，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞生長(zhǎng)，并最終獲取成熟卵母細(xì)胞。

3.3 培養(yǎng)液添加成分

將未成熟的小竇狀卵泡從人體內(nèi)取出后，卵母細(xì)胞所處環(huán)境即發(fā)生變化，與其直接接觸的培養(yǎng)液成分將對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟、受精能力等產(chǎn)生重要的影響。適當(dāng)添加Gn有助于獲取高質(zhì)量的IVM的卵母細(xì)胞，添加促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa)，可促進(jìn)人IVM的卵母細(xì)胞的成熟和排卵，并最終產(chǎn)下嬰兒[26]。在培養(yǎng)液中加入表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)可增加人IVM的成功率[27]。減數(shù)分裂抑制劑可延遲IVM的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，而cAMP可促進(jìn)減數(shù)分裂的發(fā)生。在培養(yǎng)液中加入不同濃度和種類的cAMP調(diào)節(jié)因子，可使cAMP濃度增高，有利于IVM的卵母細(xì)胞的發(fā)育[28-29]。另外，IVM的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核并非同步成熟。生發(fā)泡破裂排出第一極體標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟，但較難對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)成熟程度進(jìn)行檢測(cè)。有文獻(xiàn)[30]報(bào)道，當(dāng)生殖力保存時(shí)，在對(duì)卵巢組織或卵泡進(jìn)行玻璃化處理的過(guò)程中玻璃化液有利于IVM和后期的胚胎發(fā)育，可能與卵母細(xì)胞質(zhì)、核非同步成熟有關(guān)。

4 展望

近年來(lái)，由于生育問(wèn)題形勢(shì)嚴(yán)峻，而IVM技術(shù)快速發(fā)展，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。相對(duì)于IVF和自然妊娠而言，盡管IVM存在妊娠率和出生率低的問(wèn)題，但其具有安全、操作相對(duì)簡(jiǎn)單快捷的特點(diǎn)，使其逐漸成為IVF的替代療法。在IVF和體外胚胎培養(yǎng)等傳統(tǒng)ART技術(shù)的使用過(guò)程中存在導(dǎo)致基因組印跡異常的風(fēng)險(xiǎn)[31]，而該現(xiàn)象在IVM中尚未發(fā)現(xiàn)，并在一定程度上進(jìn)一步證實(shí)了IVM的安全性和未來(lái)更廣泛的接受度[32-33]。卵母細(xì)胞成熟受染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、線粒體分布等因素的影響[12]。卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞之間的相互作用和信號(hào)交流可調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂抑制與恢復(fù)[34]，是IVM的另一關(guān)鍵影響因素。為進(jìn)一步提高IVM技術(shù)水平，未來(lái)應(yīng)從分子水平和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平全面了解在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的調(diào)控因素，通過(guò)相關(guān)技術(shù)檢測(cè)，有針對(duì)性地優(yōu)化未成熟卵母細(xì)胞的IVM培養(yǎng)方案。

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(責(zé)任編輯：胡煒華)

Research Progress of In Vitro Maturation of Human Immature Oocytes

HU Liao-liaoa，ZHANG Jingb，ZHENG Yue-huic

(a.MedicalExperimentalTeachingCenter； b.ReproductiveCenteroftheFirstAffiliatedHospital； c.DepartmentofPhysiologyofBasicMedicalSchool，NanchangUniversity，Nanchang330006，China)

With the delay of childbearing age and the full implementation of Two-Childen Policy,the prevalence of reproductive diseases including infertility,premature ovarian failure and diminished ovarian reserve increases year by year.In vitro maturation(IVM) of human immature oocytes is a hot spot in the field of reproductive medicine.The growth of follicles cultured in vitro is affected by multiple factors such as approaches to oocyte retrieval,culture environment and culture regimens.This paper reviews the clinical indications,culture methods and influencing factors of IVM of human immature oocytes to provide more information for relevant researchers and clinical workers.

immature oocytes; in vitro maturation; culture methods; influencing factors; human

2016-11-09

國(guó)家自然科學(xué)基金(81360100)；江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(20113023)

胡燎燎(1990—)，女，碩士，主要從事生殖醫(yī)學(xué)的研究。

張靜，主治醫(yī)師，E-mail：65304902@qq.com。

R711.6； R339.2

A

1009-8194(2016)12-0095-04

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.12.039