副溶血性弧菌分子分型的研究進展

曲業(yè)敏 馬淑青 孫梅 劉海珠 常鑫 宋宇

綜 述

副溶血性弧菌分子分型的研究進展

曲業(yè)敏 馬淑青 孫梅 劉海珠 常鑫 宋宇

近年來副溶血性弧菌（VP）已成為沿海地區(qū)引發(fā)食源性疾病的主要病原菌。由于對VP的分子特征了解不夠全面， 在疾病發(fā)生時無法對菌株溯源，從而導(dǎo)致未能盡早控制VP引起的食物中毒。而傳統(tǒng)的細菌分型技術(shù)已不能滿足臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查的需要，從分子水平上認(rèn)識VP則變得越來越重要。分子分型技術(shù)以其分辨率高、特異性強、重復(fù)率好的特點，在分型技術(shù)上表現(xiàn)出越來越多的優(yōu)勢。目前，隨機擴增多態(tài)性分析、脈沖場凝膠電泳、多位點序列分型等多種方法分子生物學(xué)分型技術(shù)已應(yīng)用于VP的遺傳進化關(guān)系及其群體遺傳學(xué)特征的研究，對VP的預(yù)防和控制具有重要意義 。

副溶血性弧菌；O3：K6型；分子分型

弧菌是一種菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭陰性（G-）菌，主要魚貝類致菌包括溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌等。近年來，有關(guān)創(chuàng)傷弧菌膿毒癥診斷的研究較為廣泛［1-3］，而針對VP的研究較少。VP是一種嗜鹽菌，食用未加工成熟的海產(chǎn)品是人類感染VP的主要原因，可引起食物中毒和急性腹瀉，也可引起傷口感染和菌血癥。近年來海鮮類食品在市場廣泛流通，導(dǎo)致該菌由沿海向內(nèi)陸傳播蔓延，甚至超過沙門菌和志賀菌，成為腹瀉的首要病原菌［4］。為了便于臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及醫(yī)院感染的監(jiān)控，在臨床應(yīng)用多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、脈沖場凝膠電泳（pulse-field electrophoresis，PFGE）等分子分型技術(shù)進行VP分子流行病學(xué)的研究，為VP感染防治提供病原學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將相關(guān)研究進展進行綜述。

1 基本特性

1.1 形態(tài)及培養(yǎng) VP為G-桿菌，屬于弧菌科弧菌屬，是一種多形態(tài)菌，其菌體呈桿狀、弧狀或絲狀，無莢膜和芽胞。在液體培養(yǎng)基中大多數(shù)VP有單端鞭毛和側(cè)鞭毛，以便于運動和黏附；而在半固體或枯稠的表面，它會在細胞周圍產(chǎn)生許多無鞘的周生鞭毛，以利于細菌細胞的群聚。VP對營養(yǎng)要求不高，但無法在無鹽培養(yǎng)基上生長，最適濃度為3.5%，超過8%則不能生長，耐堿怕酸。

2 致病性

VP是一種重要的食源性病原菌，大部分VP并不致病，只有少部分菌株才有致病性。但研究表明，國內(nèi)大部分臨床來源的VP分離菌株是致病的，作為大流行株的O3：K6也是普遍存在的［5］。VP引起的疾病一般起病急、臨床癥狀重，但其致死率較低。由VP引起的大部分胃腸炎可以通過自身免疫系統(tǒng)抑制，因此，患有肝臟疾病或免疫功能紊亂的群體可能有生命危險［6］。盡管大多數(shù)血清型VP是非致病性的，但研究表明，毒性基因可以通過水平轉(zhuǎn)移的方式從不同屬的致病性弧菌轉(zhuǎn)移到無毒性的VP［7］。

目前關(guān)于VP致病機制的研究主要圍繞其毒性因子展開。VP的主要致病因子是溶血毒素，包括直接溶血毒素（TDH）和TDH相關(guān)溶血毒素（TRH），分別由TDH和TRH基因編碼，具有溶血活性、腸毒素活性、心臟毒素活性及細胞毒素活性［8］。VP中有兩套編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)的基因簇，即T3SS-1 和T3SS-2，分別位于大小染色體上［9］。T3SS-1能夠介導(dǎo)宿主細胞的自噬，與宿主細胞凋亡有關(guān)，對多種細胞株均具有毒性；而T3SS-2對部分細胞具有腸毒性。因此，Ⅲ型分泌系統(tǒng)也被認(rèn)為是VP的主要致病因子。近年來發(fā)現(xiàn)了VP的Ⅵ型分泌系統(tǒng)（T6SS），該分泌系統(tǒng)能夠增強細菌對外界環(huán)境的適應(yīng)性，使細菌在菌群中處于生長優(yōu)勢，介導(dǎo)細菌對宿主細胞的致病性［10］。Ⅵ型分泌系統(tǒng)的T6SS-1具有細胞黏附能力，T6SS-2則具有細胞黏附和促細胞自噬兩種能力。

3 分子分型技術(shù)的發(fā)展

VP經(jīng)典的分類依據(jù)是血清型分型，自1996年以來，全球范圍內(nèi)引發(fā)越來越多VP感染和暴發(fā)的菌株都屬于大流行株的同源復(fù)合體。這種同源復(fù)合體的出現(xiàn)引起了人們對VP非典型性大流行株傳播公共健康問題的關(guān)注［11］。除了原始的O3：K6血清型外，學(xué)者們還鑒定出了至少11種其他的衍生體［12］。因此血清學(xué)在追溯流行性的同源復(fù)合體傳播上是有一定局限性的。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，隨機引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、限制性片段長度多態(tài)性分型、隨機擴增多態(tài)性DNA分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、核糖分型、PFGE、MLST以及多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multiple locusvariable number of tandem repeats analysis，MLVA）等多種分子生物學(xué)分型技術(shù)已成功應(yīng)用于VP分子流行病學(xué)的研究［13］。這些分子分型技術(shù)將有助于在全世界范圍內(nèi)進行食源性微生物流行病學(xué)研究?，F(xiàn)針對幾種常用的分子分型技術(shù)的研究應(yīng)用進行闡述。

3.1 RAPD RAPD技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種分子技術(shù)，可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析，在遺傳圖譜構(gòu)建、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、DNA指紋分析和基因定位等不同領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。RAPD利用一系列不同的具有10個左右堿基的單鏈隨機引物對基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得的電泳帶型可用于比較細菌菌株的親緣關(guān)系，從而反映基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。目前，我國大部分基層實驗室只能開展VP常規(guī)的細菌分離培養(yǎng)及血清學(xué)鑒定，無法在基因組水平描述病原菌所致暴發(fā)或流行的遺傳背景，并追溯傳染源、查明傳播途徑。盡管RAPD可重復(fù)性和分型力不高，且不同實驗室間的結(jié)果不能比較，但其簡便快速，且需要的基因組DNA少，不用事先了解細菌基因組序列就可以準(zhǔn)確測出靶序列的特性，在疾病暴發(fā)流行時，是一種用于區(qū)分相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)［14］。因此RAPD技術(shù)以其簡便、快速、有效等特點，特別適用于在基層實驗室應(yīng)用。

3.2 PFGE PFGE出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，用于分析大分子DNA片段，其重復(fù)性好、分辨力強，被稱為細菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”［15］。對比分析不同樣品、不同地區(qū)食源性VP染色體PFGE 條帶圖譜，以評價菌株之間的遺傳多樣性及環(huán)境菌株與分離自患者菌株的相關(guān)性，可對食源性疾病暴發(fā)進行早期預(yù)警，為疫情防控提供有力的技術(shù)保障。PFGE的基本原理是不斷改變凝膠上外加的脈沖電場方向，從而改變包埋在瓊脂糖凝膠中DNA分子的泳動方向。DNA分子越大則重新定向的時間越長，因此大DNA 分子的變化比小DNA 分子慢，從而按染色體大小在凝膠上呈現(xiàn)出不同的電泳帶型。在一定程度上，DNA電泳帶的密度可以反映細菌內(nèi)DNA的含量及DNA分子大小，最終達到分型目的。

PFGE可直接或間接反映病原體變異分化的本質(zhì)即DNA序列的改變，從而實現(xiàn)微觀變化的宏觀顯示［16］。Tenover等［17］按其電泳條帶不同提出了有關(guān)PFGE圖譜與測定菌株相關(guān)性的判別標(biāo)準(zhǔn)是圖譜一致為相同菌株；有1～3條帶的差異菌株；有4～6條帶的差異菌株；或更多條帶的差異菌株。因為細菌的高變異性，判斷是否為同一菌株時允許存在變異，因此該標(biāo)準(zhǔn)尚存在局限性。Talon等［18］在解釋PFGE圖譜時提出85%以上條帶相同的即為相同菌株，50%以上條帶不同則為不同菌株。美國PulseNet體系中的6家實驗室聯(lián)合建立了PulseNet VP有效快速的PFGE標(biāo)準(zhǔn)化分型技術(shù)。中國也在2004年9月正式加入了 PulseNet 網(wǎng)絡(luò)， 成立了PulseNet China實驗室，建立了PFGE標(biāo)準(zhǔn)化方案和數(shù)據(jù)庫［19］。PFGE方法與其他分型方法相比有著更高的分辨力和更好的可重復(fù)性，且結(jié)果穩(wěn)定、更易于標(biāo)準(zhǔn)化，可以方便、及時地對不同地區(qū)、不同時間、不同致病性菌株或不能用MLST分型的菌株進行有效分型。同時，計算機凝膠掃描和軟件分析有助于創(chuàng)建病原菌PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫，通過數(shù)據(jù)庫的比對來判斷被測菌株與相同菌屬間的親緣關(guān)系。PFGE的缺點首先是耗時長，不適用于實驗室大量樣本分析；其次是試劑及設(shè)備價格非常昂貴；另外，很小的電泳條件改變就可以導(dǎo)致每條光譜帶間距離的變化，因此不適用于不同實驗室間結(jié)果的比較。

3.3 MLST MLST是1998年為研究菌群基因結(jié)構(gòu)而設(shè)計的一種高分辨率分型技術(shù)［20］。MLST通過對多個管家基因核酸序列的分析，依據(jù)等位基因的多樣性確定菌株的序列型，并可通過互聯(lián)網(wǎng)上的數(shù)據(jù)庫對不同國家、不同地區(qū)分離的菌株進行比較，已成為一種確定全球細菌病原體（如腦膜炎奈瑟菌和金黃色葡萄球菌）的流行病學(xué)方法［21-22］。早先的MLST研究旨在探討VP新的大流行株的進化，研究者假定其是從一個共同的O3：K6進化而來［23］，研究主要局限于大流行株菌株，且只檢測了4個管家基因，均位于染色體Ⅰ上，而VP有2條染色體，使用6～8個基因有益于確定是否2條染色體都承受類似的進化壓力。目前一般選擇6～10個管家基因或廣泛存在的毒性基因分別進行PCR擴增，若不同菌株間PCR產(chǎn)物的核苷酸序列完全一致，則將該序列類型認(rèn)定為等位基因。這種數(shù)字化結(jié)果既準(zhǔn)確又清晰，不同的等位基因?qū)⒈恢付ú煌臄?shù)字，而一個細菌的所有等位基因數(shù)字將構(gòu)成等位基因譜，不同的等位基因譜組成不同的序列型（sequence type，ST），其分析數(shù)據(jù)可以通過互聯(lián)網(wǎng)在全球范圍進行比對，在監(jiān)測全球的流行病上具有強大的優(yōu)勢。

González-Escalona等［11］的研究結(jié)果表明，MLST適用于不同地區(qū)的VP菌株，采用MLST并對其進行了種群結(jié)構(gòu)調(diào)查，確定了物種克隆擴增中重組/突變的影響。MLST用所測定的管家基因核苷酸序列組合進行編碼分型，可有效分析不同時間、不同地區(qū)臨床分離株的遺傳相關(guān)性，特別是多地域相關(guān)性微生物的流行病學(xué)、種內(nèi)微進化、來源追蹤和抗菌藥物耐受研究，數(shù)據(jù)重復(fù)性及可比性好，可共享。MLST產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用于細菌進化和種群研究，而不考慮其多樣性、種群結(jié)構(gòu)的演化［24］，已被臨床微生物學(xué)家和流行病學(xué)家視為一種重要溯源與進化分析工具。以前的MLST研究說明了細菌屬中的菌株間存在遺傳親緣關(guān)系，確定了基因重組及突變相關(guān)進化的重要性和基因水平轉(zhuǎn)移事件在進化過程中的重要作用［25-26］。但由于 MLST 主要通過進化過程中高度保守的管家基因變異對細菌進行分型，因此并不能區(qū)分關(guān)聯(lián)度高的菌株，也不能有效鑒別遺傳關(guān)系相近的不同血清型菌株［27］。同時MLST 需要測序儀器且測序費用較高，影響了其在醫(yī)院的大量推廣和普及，僅局限于在大型的全球性流行病學(xué)研究中心使用。

3.4 MLVA MLVA是近年國外發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)的快速分析多位點串聯(lián)重復(fù)序列的新方法，是一種細菌二代分子分型方法。該方法通過區(qū)分基因組上多個具有多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列位點（vNTR）的拷貝數(shù)而對菌株進行分型［28］，不同的臨床分離株可表現(xiàn)為不同的串聯(lián)重復(fù)數(shù)，故MLVA結(jié)果可以數(shù)字化表示，便于不同實驗室間比較。MLVA 分型與血清學(xué)分型、PFGE 分型相關(guān)性好，不僅能夠反映菌株間基因水平微小變異，同時結(jié)果以精確的數(shù)字化水平呈現(xiàn)，易于實驗室內(nèi)和實驗室間的比對。MLVA分型方法比MLST的試驗費用低，可以不必測序就獲得數(shù)字化結(jié)果，而數(shù)據(jù)傳遞方便性又與MLST一致。與PFGE相比，MLVA在實驗時間方面很有優(yōu)勢，且實驗操作比PFGE簡單，分辨效率更高。MLVA方法不僅適用于進行國際化的比較，而且也適用于基層實驗室的研究應(yīng)用及進行全世界范圍的流行病學(xué)研究，目前在國內(nèi)一些大型研究中心已經(jīng)開始得到應(yīng)用。

4 展望

近年來，VP引起的感染暴發(fā)逐漸增多，食物中毒的檢出率逐漸升高，故相關(guān)部門應(yīng)根據(jù)VP的流行及傳播特點制定更加科學(xué)、完善的預(yù)防措施，加強對水產(chǎn)品銷售、進貨渠道及餐飲業(yè)衛(wèi)生的管理。因此，建立一個從產(chǎn)地到餐桌對海產(chǎn)品進行監(jiān)控的食品鏈檢測體系是非常必要的。采用分子分型技術(shù)對菌株進行分型研究，對及時確定污染源，迅速處理食物中毒有關(guān)的應(yīng)急突發(fā)事件和有效治療具有突出意義。

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（本文編輯：孫茜）

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