脂肪肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展

王振，楊濤，李世朋，張建軍（.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 3009；.天津市第一中心器官移植中心，天津 3009）

隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖人群的比例逐年上升，脂肪肝的發(fā)病率也呈逐年增高的趨勢(shì)，非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，臨床治療上也缺乏有效措施。因此，研究不同方法構(gòu)建脂肪肝動(dòng)物模型對(duì)于闡明脂肪肝的發(fā)病機(jī)制及其治療尤為重要。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外動(dòng)物脂肪肝模型的造模方法進(jìn)行綜述，旨在為脂肪肝的基礎(chǔ)和臨床研究提供參考。

1 酒精性脂肪肝動(dòng)物模型

1.1 急性酒精性脂肪肝模型：國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用56%白酒灌胃法建立急性酒精性脂肪肝模型。給予小鼠16 ml/kg白酒灌胃，1次/天，連續(xù)灌胃10天后，小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平明顯升高，肝組織中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）水平顯著增加，肝細(xì)胞顯著脂肪變，腫脹，肝竇受壓，可見(jiàn)血管充血和灶性壞死[1-2]。大鼠給予8 ml/kg白酒灌胃，2次/天，連續(xù)5天后，病理可見(jiàn)大鼠肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的脂滴空泡[3]。該方法符合人類(lèi)的飲酒習(xí)慣，構(gòu)建模型方法簡(jiǎn)單易行，建模周期短，成本低，但灌胃工作較繁瑣，動(dòng)物死亡率高。

1.2 慢性酒精性脂肪肝模型：慢性酒精性脂肪肝造模方法包括單純乙醇灌胃法、乙醇灌胃結(jié)合高脂飲食法、乙醇混合脂肪乳灌胃法等。羅華麗等[4]采用56度紅星二鍋頭酒按10 ml/kg比例灌胃，上下午各1次，連續(xù)灌胃8周以建立大鼠酒精性脂肪肝模型，結(jié)果表明模型組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性明顯升高，肝組織病理可見(jiàn)明顯肝細(xì)胞脂肪變性。張偉等[5]以乙醇灌胃為基礎(chǔ)，緩慢提高乙醇的劑量和濃度，并結(jié)合高脂飼料（基礎(chǔ)飼料84%，豬油5%，膽固醇l%，玉米油10%）飲食，造模6周后發(fā)現(xiàn)大鼠發(fā)生明顯的肝臟脂肪變性，血清ALT活性升高，肝勻漿超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX-Px）活性降低，MDA含量升高。羅華麗等[4]還采用乙醇混合含高脂配方的脂肪乳劑（豬油25 g，膽固醇10 g，丙硫氧嘧啶1 g，吐溫20 ml，50%乙醇）按15 ml/kg灌胃，連續(xù)4周。結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織脂肪變性明顯，血清ALT、AST、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）均明顯升高。

2 非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型

2.1 高脂飲食法：高脂飲食法是國(guó)內(nèi)外常用的NAFLD的動(dòng)物模型建立方法，與人類(lèi)NAFLD發(fā)病機(jī)制及肝組織病理學(xué)特征相似。該法還可用于建立代謝障礙綜合征、血脂異常、肥胖及胰島素抵抗等動(dòng)物模型[6]。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，由于各研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系、喂養(yǎng)飼料成分、性別及飼養(yǎng)時(shí)間等因素的不同，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織病變程度及病理類(lèi)型也不同[7]。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，用高脂飼料（脂肪占總熱量的71%）飼養(yǎng)3種不同種系雄性大鼠（Lewis、Wistar 和SD大鼠），3周后所有大鼠超過(guò)66%的肝細(xì)胞均發(fā)生脂肪變，但其病理類(lèi)型不同。微孔狀、混合性和空泡狀脂肪變?cè)?種大鼠肝臟病理中均可發(fā)現(xiàn)，但僅SD大鼠肝臟組織出現(xiàn)重度纖維化肝細(xì)胞損傷及中央靜脈血流速度減少，SD大鼠對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)具有更高敏感性[8-9]。雄性大鼠（無(wú)論種系）更易發(fā)生肝細(xì)胞脂肪變，這與NAFLD在男性和絕經(jīng)后的女性中發(fā)病率較高相一致[10]。飼養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，飼料中脂肪含量越高，肝細(xì)胞脂肪變及肝損傷程度越嚴(yán)重[11-12]。脂肪酸種類(lèi)對(duì)肝細(xì)胞脂肪變及肝損傷的影響程度不同。含豐富飽和脂肪酸（SFA）或單不飽和脂肪酸（MUFA）的飼料（如豬油）易導(dǎo)致大鼠肥胖、胰島素抵抗及肝組織重度脂肪變；以ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3 PUFA）為脂肪來(lái)源的飼料（如魚(yú)油）可顯著減輕SD大鼠肝脂肪變程度[12]；以ω-6多不飽和脂肪酸（ω-6 PUFA）為脂肪來(lái)源的飼料（如玉米油）飼養(yǎng)SD大鼠14周后，肝臟組織中無(wú)脂肪變且肝內(nèi)甘油三酯的含量也不增加[13]。

2.2 膽堿-蛋氨酸缺乏（MCD）飲食模型：膽堿在機(jī)體內(nèi)能夠參與多種重要的生化反應(yīng)（甲基化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)），合成卵磷脂、鞘磷脂和乙酰膽堿。膽堿缺乏時(shí)，蛋氨酸可以轉(zhuǎn)化合成膽堿。膽堿、蛋氨酸均缺乏時(shí)，卵磷脂合成受阻，產(chǎn)生極低密度脂蛋白（VLDL）合成及分泌障礙；僅缺乏膽堿時(shí)，含豐富蛋氨酸的飲食，不影響VLDL的合成及分泌，肝脂肪變和炎癥損傷較輕[14-15]。MCD飲食飼養(yǎng)1～2周后小鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的肝脂肪變，2周后出現(xiàn)肝臟壞死性炎癥，接著相繼出現(xiàn)竇周和中央靜脈周?chē)w維化，同時(shí)伴有血清ALT顯著升高和肝臟Cyp2E1、4A10、4A14等脂質(zhì)氧化酶基因表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象。經(jīng)MCD飲食誘導(dǎo)的SD大鼠，其非酒精性脂肪性肝炎（NASH）進(jìn)展相對(duì)緩慢，1周時(shí)出現(xiàn)微孔狀脂肪變；3周時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)榇笈菪灾咀儼樯l(fā)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；5周時(shí)出現(xiàn)廣泛大泡性脂肪變伴單核細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)狀壞死；7周時(shí)出現(xiàn)中央靜脈纖維化[15]。不同的動(dòng)物種系及性別對(duì)MCD的敏感性不同，與大鼠相比，小鼠具有敏感性高、模型周期短且肝組織病理學(xué)特點(diǎn)顯著[16]。在相同飼養(yǎng)條件下，Wistar大鼠肝組織中脂肪含量、血清轉(zhuǎn)氨酶及肝損傷程度高于SD大鼠；雄性大鼠（無(wú)論種系）肝脂肪含量及血清轉(zhuǎn)氨酶高于雌性大鼠[16]。雖然MCD飲食飼養(yǎng)鼠造模方法簡(jiǎn)便易行，但不能反映人類(lèi)NAFLD的病因?qū)W機(jī)制及其他特征。與人類(lèi)相比，經(jīng)MCD飲食誘導(dǎo)的大鼠體重減輕，血清TG及膽固醇含量降低，盡管存在肝臟胰島素抵抗但無(wú)外周胰島素抵抗現(xiàn)象，不能反映NAFLD患者的代謝情況。

2.3 高糖飲食法：果糖/蔗糖攝入過(guò)多不僅促進(jìn)機(jī)體內(nèi)脂肪從頭合成增加，還能夠使肝組織中活性氧類(lèi)的生成增多，從而導(dǎo)致代謝障礙綜合征、肥胖和NAFLD[17]。SD大鼠經(jīng)含糖量極高（蔗糖70%）的飲食喂養(yǎng)2～3周后可形成脂肪肝，同時(shí)參與脂肪合成的酶類(lèi)及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成增加[18]。用含糖65%的飲食喂養(yǎng)C57BL-6小鼠8周后出現(xiàn)肝脂肪變、炎癥損傷和門(mén)脈纖維化，并伴有胰島素抵抗、血脂異常和炎癥因子增加[19-21]。

2.4 基因模型：Zucker大鼠（fa/fa大鼠）和ob/ob小鼠是瘦素受體基因突變鼠，也是目前國(guó)外最常用的NAFLD的基因模型。瘦素是脂肪組織分泌的肽類(lèi)激素，主要調(diào)控飲食行為及能量消耗，還與細(xì)胞死亡及纖維化相關(guān)[22]。Zucker大鼠還廣泛應(yīng)用于遺傳性肥胖和代謝障礙綜合征的研究。瘦素受體基因突變、瘦素抵抗可導(dǎo)致高瘦素血癥、高脂血癥、食欲過(guò)盛、胰島素抵抗及過(guò)度肥胖[23]。Zucker大鼠高脂血癥主要以VLDL、高密度脂蛋白（HDL）的增加為主，低密度脂蛋白（LDL）不增加且肝臟組織中LDL受體表達(dá)水平降低；肝組織中主要為大泡性和微孔狀脂肪變，脂肪聚集于門(mén)靜脈周?chē)鷧^(qū)域；此外，肝組織中還原型谷胱甘肽、維生素E含量減少，過(guò)氧化氫酶活性降低，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（ChREBP）表達(dá)增加[24]。Zucker大鼠與ob/ob小鼠均不能自發(fā)地由單純性脂肪肝發(fā)展至NASH，只有在給予MCD飲食或高脂飲食或在內(nèi)毒素、乙醇、缺血/再灌注損傷等損肝因素的“二次打擊”下，才能演變?yōu)轱@著NASH[25]。其他基因模型還包括FLS小鼠模型[26]、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT/C D36缺失小鼠模型[27]、乙酰輔酶A氧化酶（AOX）缺乏小鼠模型[18]、線粒體三功能蛋白酶（MTP）缺失小鼠模型等[28]。

2.5 復(fù)合模型：由于基因模型和營(yíng)養(yǎng)模型的表型均與人類(lèi)NAFLD存在一定的差異，不能涵蓋人類(lèi)NAFLD的疾病普遍發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，許多學(xué)者在基因模型的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)、藥物誘發(fā)等復(fù)合模型，使新模型的表型與人類(lèi)NAFLD更接近，并能反映疾病從單純性脂肪肝向NASH進(jìn)展，NASH向肝纖維化進(jìn)展的過(guò)程。最常用的復(fù)合模型包括ob/ob小鼠+MCD飲食，db/db小鼠+MCD飲食，Zucker大鼠+MCD飲食/高脂飲食。這些模型均能形成典型的NASH組織學(xué)改變[29]。db/db小鼠+MCD飲食模型比ob/ob小鼠+MCD飲食模型炎癥及細(xì)胞周?chē)w維化更嚴(yán)重，且建模周期明顯縮短。以高脂飲食（豬油占總熱量的60%）飼養(yǎng)Zucker大鼠8周后，大鼠肝脂肪變明顯增加，并進(jìn)展為NASH，血清轉(zhuǎn)氨酶及炎癥因子含量明顯升高[30]。復(fù)合模型最大程度地模擬了人類(lèi)NAFLD的復(fù)雜性，病理變化顯著，是一種極具潛力的NASH模型。

近年來(lái)，NAFLD動(dòng)物模型的研究有了很大進(jìn)展，但至今仍缺乏涵蓋人類(lèi)NAFLD整個(gè)疾病譜的單一動(dòng)物模型。不同致病因素所致脂肪肝動(dòng)物模型的形成機(jī)制及病理改變各異，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究目的選擇合適的造模方法。此外，還應(yīng)致力于探索新的造模方法。