肝癌動(dòng)物模型研究進(jìn)展

王冠文，楊爽，張全勝（.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子腫瘤與表觀遺傳重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 6004；.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津 0007；天津市第一中心醫(yī)院臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 009）

在世界范圍內(nèi)肝癌位居惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大疾病[1]。肝癌易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后效果差，研究表明，肝癌患者肝切除術(shù)后5年存活率僅為30%～40%[2]。肝癌的發(fā)生是一個(gè)多階段逐步演變惡化的過(guò)程。與肝癌發(fā)生相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括病毒感染[3]、化學(xué)致癌物接觸[4]、酗酒[5]等，因此，研究如何提高肝癌診斷，加強(qiáng)預(yù)防和改進(jìn)治療措施至關(guān)重要。動(dòng)物模型是用來(lái)研究肝癌發(fā)病機(jī)制的重要工具，其中，小鼠模型的應(yīng)用最為廣泛。不同病因可引起不同基因的改變，導(dǎo)致了肝癌的異質(zhì)性，使得肝癌動(dòng)物模型不具有普遍性，本文綜述了用于研究肝癌的小鼠模型，可供研究者參考。

1 誘發(fā)型肝癌動(dòng)物模型

許多化學(xué)致癌物達(dá)到足夠的使用劑量和時(shí)間可以誘發(fā)動(dòng)物形成腫瘤。常用的化學(xué)致癌物根據(jù)其作用機(jī)制可以分為兩類：① 誘導(dǎo)DNA結(jié)構(gòu)改變；② 不直接造成肝臟損傷，但是與肝臟毒性藥物聯(lián)合使用時(shí)可以增強(qiáng)腫瘤的起始能力。用于構(gòu)建誘發(fā)型肝癌模型常用的化學(xué)致癌物包括氨基偶氮染料、芳香胺類、亞硝胺和黃曲霉素等。單用一種化學(xué)藥物，或多種藥物與不同的促癌劑、肝大部分切除等按不同順序組合成不同的誘發(fā)肝癌的方案。

誘發(fā)型肝癌模型的優(yōu)點(diǎn)在于可以模擬肝癌發(fā)生的3個(gè)過(guò)程，即損傷、硬化和腫瘤。其缺點(diǎn)是：誘導(dǎo)周期長(zhǎng)（3～5個(gè)月，甚至1～2年）、病死率高（53.82%）、肝癌出現(xiàn)的時(shí)間、部位、病灶數(shù)等在個(gè)體之間表現(xiàn)不均一。下面分別介紹幾種常用的化學(xué)致癌物誘導(dǎo)方法。

1.1 二乙基亞硝胺（DEN）：DEN是一種常用的化學(xué)致癌物，不僅可以誘導(dǎo)肝臟腫瘤的發(fā)生，同時(shí)也可以誘導(dǎo)胃癌[6]、皮膚癌、支氣管癌和血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生。DEN的促肝癌作用主要取決于其誘導(dǎo)DNA烷基化的能力，持續(xù)使用高劑量DEN可以導(dǎo)致DNA損傷和氧化應(yīng)激，從而引起肝臟腫瘤的發(fā)生。

單獨(dú)注射DEN誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌（HCC）發(fā)生的時(shí)間不僅取決于注射劑量，還與動(dòng)物性別、年齡和品系相關(guān)。動(dòng)物年齡越小，誘導(dǎo)HCC所需的時(shí)間越短，因?yàn)槠涓渭?xì)胞增殖較快。長(zhǎng)期注射DEN時(shí)雄鼠肝癌發(fā)生率為100%，而雌鼠肝癌發(fā)生率僅為30%，這種肝癌發(fā)生率的性別差異主要是由于雌激素在HCC中具有抑制作用，而雄激素則是促進(jìn)作用[7]。

有研究顯示，當(dāng)給2周齡的小鼠單獨(dú)注射5～90 mg/kg DEN時(shí)，在45～104周后可以觀察到腫瘤的形成[8]。此外，B6C3F1小鼠單獨(dú)注射5.0 mg/kgDEN，近 64 周時(shí)可以觀察到腫瘤的形成[9]，而且在肝癌發(fā)生后，短時(shí)間內(nèi)就可以觀察到腫瘤肺轉(zhuǎn)移。小鼠品系不同，肝癌發(fā)生的時(shí)間和概率也不盡相同，例如：給sv129小鼠注射20 mg/kg DEN，30～55周后成瘤率為80%～100%[10]；給C3H/HE小鼠注射90 mg/kg DEN，45～75周后成瘤率為100%[11]；給 C57BL6/J小 鼠 注 射 5 mg/kg DEN，40～70周后成瘤率為84%。此外，還可以聯(lián)合注射苯巴比妥（PB）和DEN，其中，PB作為促癌劑，可以縮短建模時(shí)間。

1.2 黃曲霉素B1（AFB1）：AFB1是黃曲霉菌、寄生曲霉菌等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物。霉變食物中AFB1最常見(jiàn)，是目前已知最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一。AFB1在進(jìn)入人體后經(jīng)肝臟內(nèi)CYP450酶系統(tǒng)作用活化為AFB1-8，9-環(huán)氧化物（AFBO）[12]，繼而與DNA鳥(niǎo)嘌呤結(jié)合形成加合物，改變DNA結(jié)構(gòu)，引起DNA化學(xué)損傷。有研究結(jié)果顯示，給1周齡的小鼠喂食6 mg/kg的AFB1，52周后可誘導(dǎo)肝癌的形成[13]。

1.3 四氯化碳（CCl4）：CCl4的肝臟毒性可分為兩個(gè)階段[14]，首先，CCl4在肝內(nèi)經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝產(chǎn)生自由基，自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，造成細(xì)胞膜損傷；其次，CCl4可引起肝巨噬細(xì)胞（庫(kù)普弗細(xì)胞）誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥因子、趨化因子和其他促炎因子的分泌，這些因子不僅能夠直接造成肝臟的毒性損傷，而且能激活單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，最終導(dǎo)致肝組織損傷。反復(fù)的損傷、炎癥、修復(fù)最終可導(dǎo)致肝纖維化和腫瘤的形成[15]。小鼠出生6周后開(kāi)始靜脈注射CCl4（10 μl/g CCl4溶解于10%橄欖油），每周注射3次，4個(gè)月后能夠發(fā)生腫瘤。

2 移植肝癌動(dòng)物模型

移植肝癌動(dòng)物模型是指將肝癌組織或細(xì)胞（源于動(dòng)物或人）移植到受體動(dòng)物體內(nèi)（肝臟、肝外組織或器官）或?qū)⒎歉闻K來(lái)源的惡性腫瘤如乳腺癌等移植到動(dòng)物的肝臟。人類腫瘤移植瘤的來(lái)源有腫瘤活檢組織、手術(shù)切除標(biāo)本、取自腫瘤患者的胸腹腔積液內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和人類腫瘤細(xì)胞系。移植肝癌動(dòng)物模型主要用于篩選臨床抗癌藥物。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以使一組動(dòng)物同時(shí)接種同樣量的腫瘤組織和細(xì)胞，其腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率比較一致，腫瘤的大小和位置較易控制，個(gè)體差異較小，接種成活率接近100%。對(duì)宿主的影響相類似，易于客觀判斷療效，可在同種或同品系動(dòng)物之間進(jìn)行連續(xù)移植，試驗(yàn)周期一般較短，試驗(yàn)條件易于控制。根據(jù)受體動(dòng)物的不同，移植肝癌模型可分為正常動(dòng)物移植性肝癌模型和免疫缺陷動(dòng)物移植性肝癌模型。

2.1 皮下移植瘤模型：在HCC的研究中，皮下移植瘤模型是最常用的模型。這個(gè)模型將人肝癌細(xì)胞或腫瘤組織種植到免疫功能缺陷小鼠的頸背部皮下，種植的腫瘤細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106個(gè)時(shí)，成瘤率接近100%。由于腫瘤組織更完整地保留了人肝細(xì)胞癌的特性，因此，應(yīng)用此動(dòng)物模型所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為可靠[16]。

皮下移植瘤模型在很多方面的試驗(yàn)中得到了廣泛運(yùn)用。但是，它最主要的缺點(diǎn)是缺乏腫瘤和肝組織之間的相互反應(yīng)，缺乏腫瘤與宿主的相互關(guān)系，在藥物試驗(yàn)中可能產(chǎn)生大量假陽(yáng)性結(jié)果。另外，微環(huán)境的改變可能會(huì)影響惡性細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，當(dāng)在皮下接種HCC細(xì)胞時(shí)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移現(xiàn)象很少發(fā)生，而原位接種卻經(jīng)常發(fā)生遠(yuǎn)處自發(fā)轉(zhuǎn)移[17]。

2.2 原位移植瘤模型：建立原位移植瘤模型包括兩種途徑，一種方法是建立肝內(nèi)種植模型，即將患者或皮下移植瘤模型來(lái)源的腫瘤碎片切割成1 mm×1 mm×1 mm的碎片，然后將其植入免疫功能缺陷小鼠的肝內(nèi)[18]；另一種更為常用的方法是將腫瘤細(xì)胞懸浮于10～20 μl含有50%基質(zhì)膠的無(wú)血清培養(yǎng)基中，直接注射到小鼠的肝左葉，約1周后將形成肝腫瘤[19]。建立原位移植瘤模型需要的細(xì)胞數(shù)目為（1～5）×106個(gè)時(shí)可形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但由于不同HCC細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移能力不同，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)所需要的時(shí)間也有差別。

原位移植瘤模型在模仿腫瘤微環(huán)境方面優(yōu)于皮下移植瘤模型，其主要缺點(diǎn)在于必須處死小鼠后才能測(cè)量腫瘤的體積[20]。

2.3 異體移植模型：近年來(lái)的研究顯示，對(duì)于HCC患者來(lái)說(shuō)，免疫療法可能成為其有效的選擇，特別是對(duì)于腫瘤復(fù)發(fā)的患者[21]。在這樣的情況下，免疫功能缺陷小鼠不適于模型構(gòu)建，因此，將小鼠HCC細(xì)胞系或腫瘤組織植入具有免疫活性的小鼠中建立異體移植模型則至關(guān)重要。由于免疫療法的最佳對(duì)象為復(fù)發(fā)HCC的患者，研究人員通常將低劑量的腫瘤細(xì)胞注射入門靜脈或脾靜脈[22-23]。例如，Zhao等[24]將1×106個(gè)小鼠肝癌細(xì)胞（H22）以及2×105個(gè)肝星狀細(xì)胞（HSCs）同時(shí)注射入BALB/c小鼠的肝臟內(nèi)，激活的HSCs不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤血管的新生和淋巴管生成，還可以顯著激活免疫抑制細(xì)胞，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，異體種植模型在某些特定的研究領(lǐng)域中為我們提供了更多的選擇。然而，由于小鼠肝腫瘤不同于人類肝腫瘤，臨床現(xiàn)象與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否相符尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過(guò)基因工程的方法將特定的外源基因?qū)雱?dòng)物基因組內(nèi)，使其發(fā)生整合、遺傳繁殖，由此培養(yǎng)出攜帶外源基因的動(dòng)物。此模型不但能從動(dòng)物整體的組織器官水平上進(jìn)行研究，而且還可以深入到細(xì)胞和分子水平，為肝癌的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和臨床醫(yī)學(xué)研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系。

3.1 組成型表達(dá)系統(tǒng)：組成型轉(zhuǎn)基因小鼠是將外源DNA片段導(dǎo)入到小鼠受精卵中，當(dāng)胚胎發(fā)育成小鼠時(shí)，其所有細(xì)胞中都可以表達(dá)目的基因，并穩(wěn)定的遺傳給后代。

乙型肝炎病毒（HBV）感染是引起HCC的主要原因之一。HBV的組成成分中研究最多的是乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）和乙型肝炎病毒表面抗原。完全整合了HBx基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其肝臟的組織病理呈進(jìn)展性變化，第4個(gè)月時(shí)出現(xiàn)多灶性肝細(xì)胞改變，第8～10個(gè)月時(shí)出現(xiàn)良性腺瘤。80%以上的雄鼠在第11～15個(gè)月時(shí)死于肝癌，60%以上的雌鼠在第17～21個(gè)月時(shí)死亡。組成型基因表達(dá)系統(tǒng)最主要的缺點(diǎn)之一就是胚胎致死。另外，外源基因是隨機(jī)整合的，整合率并不能控制，而且這種技術(shù)使得基因表達(dá)通常不局限于某個(gè)器官或某個(gè)組織，基因的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間均不受控制，因此，無(wú)法回答基因功能上的許多細(xì)節(jié)問(wèn)題。

3.2 條件性表達(dá)系統(tǒng)：Cre/loxP重組系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于條件性基因表達(dá)系統(tǒng)。Cre/loxP重組系統(tǒng)由Cre重組酶和loxP位點(diǎn)兩部分組成。loxP由兩個(gè)13 bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8 bp序列共同組成，其中13 bp反向重復(fù)序列是Cre重組酶的結(jié)合域。Cre重組酶是細(xì)菌噬菌體P1的一種酶蛋白，分子量約為38 KDa，可以識(shí)別催化兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間發(fā)生同源重組，從而造成DNA的缺失、異位等現(xiàn)象。如果兩個(gè)LoxP位于同一條DNA鏈上，且方向相同，結(jié)果將使LoxP位點(diǎn)之間的序列被刪除，條件性表達(dá)系統(tǒng)因具備上述特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于條件性基因表達(dá)系統(tǒng)。當(dāng)Cre酶啟動(dòng)子為組織特異性啟動(dòng)子時(shí)，可以使目的基因只在特定的組織中表達(dá)。在條件性系統(tǒng)中，常常利用某些肝臟特異性的啟動(dòng)子元件，如清蛋白（Alb）啟動(dòng)子[25-26]、金屬硫蛋白（MT）啟動(dòng)子[27]、甲狀腺素運(yùn)載蛋白啟動(dòng)子等，實(shí)現(xiàn)目的基因在肝臟中的特異性表達(dá)。為了研究c-myc與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）在肝癌發(fā)生中的相互作用，Sandgren等[28]構(gòu)建了Alb/c-myc和MT/TGF-α兩種小鼠轉(zhuǎn)基因模型[27]，進(jìn)而建立了c-myc/TGF-α轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)表達(dá)Alb/c-myc或MT/TGF-α的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，c-myc和TGF-α基因在小鼠肝臟中的共同表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝臟腫瘤的形成加速[29]。這種轉(zhuǎn)基因小鼠出生后第1周，肝細(xì)胞持續(xù)增殖，2月后即可形成腫瘤。

條件性表達(dá)型系統(tǒng)可以避免發(fā)生胚胎致死，但其主要缺點(diǎn)在于這種不可逆的方法并不能準(zhǔn)確地模擬癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段所發(fā)揮的作用。

3.3 誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)：誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)允許我們?cè)诙虝r(shí)間內(nèi)控制基因表達(dá)的變化。目前，常用的可誘導(dǎo)系統(tǒng)包括三類，分別是四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)、他莫昔芬調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)以及病毒調(diào)控的Cre傳遞系統(tǒng)。其中四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)包括：tet-off和tet-on系統(tǒng)，它們都是在原核生物操縱子模型的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的真核誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)。Tet-off系統(tǒng)由反應(yīng)質(zhì)粒和調(diào)節(jié)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒的啟動(dòng)子是人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子，下游是一段由四環(huán)素阻遏蛋白（TetR）與單純皰疹病毒 （HSV）的VP16蛋白羧基末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合而成的轉(zhuǎn)錄活化因子（tTA）。在反應(yīng)質(zhì)粒上克隆目的基因，反應(yīng)質(zhì)粒的啟動(dòng)子是缺失了增強(qiáng)子的人巨細(xì)胞病毒最低限度啟動(dòng)子（PminCMV），其上游是一個(gè)由操縱基因（TetO）和42個(gè)堿基的7次正向重復(fù)序列組成的。由于PminCMV缺失增強(qiáng)子區(qū)需要TetR與TetO結(jié)合，目的基因才能啟動(dòng)表達(dá)。當(dāng)四環(huán)素不存在時(shí)，調(diào)節(jié)質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物TetR能與反應(yīng)質(zhì)粒TRE區(qū)的TetO序列結(jié)合，能夠啟動(dòng)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；當(dāng)四環(huán)素存在時(shí)，tTA與TetO分離，目的基因不能被轉(zhuǎn)錄。tet-on系統(tǒng)是在tet-off系統(tǒng)的基礎(chǔ)上改造發(fā)展而來(lái)，將tet-off系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)錄因子換成四環(huán)素調(diào)控的反式激活子（rtTA），當(dāng)四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素（Dox）不存在時(shí)，rtTA不能識(shí)別其特異的DNA靶序列，目的基因不表達(dá)；當(dāng)Dox存在時(shí)，rtTA才能夠與TetO序列結(jié)合從而啟動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄。

Tet調(diào)節(jié)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)包括：① 可以在大范圍內(nèi)極其嚴(yán)格地行使調(diào)控作用；② 定量控制表達(dá)所需要的四環(huán)素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于毒性閾值；③ 由于四環(huán)素具有良好的細(xì)胞和組織穿透能力，即使在小鼠的不同部分，包括胎盤以及哺乳母鼠的乳汁中，所需濃度可以輕易實(shí)現(xiàn)。因此，Tet調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以用于發(fā)育中的胚胎以及離乳前和離乳中的小鼠后代[30]。使用組織特性啟動(dòng)子，輔以四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)。利用四環(huán)素控制Cre細(xì)胞譜系特異性的表達(dá)，通過(guò)Cre重組酶催化的重組作用可在特定組織及特定發(fā)育階段敲除由LoxP序列標(biāo)記的基因。病毒調(diào)控的Cre傳遞系統(tǒng)是另一種基因操縱方式。在這個(gè)系統(tǒng)中，缺失復(fù)制功能的重組腺病毒可被用于將肝特異性Cre基因轉(zhuǎn)入攜帶loxP序列的小鼠中[31]。Colnot等[32-33]建立了一種小鼠模型，在其抑癌基因Apc的第14個(gè)外顯子兩側(cè)加入了loxP位點(diǎn)（Apclox/lox），之后通過(guò)靜脈注射腺病毒編碼的Cre重組酶（AdCre） 使肝臟Apc基因失活。注射0.5×109滴度的AdCre 8個(gè)月之后，67%的Apclox/lox小鼠出現(xiàn)了HCC。在這些Apc基因失活的HCC小鼠中，β-catenin信號(hào)被明顯激活。

與其他可誘導(dǎo)系統(tǒng)相比，腺病毒調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)更容易實(shí)施，相對(duì)技術(shù)難度較低。更重要的是，研究人員不僅可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的臨時(shí)調(diào)控，還可以精確調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平。然而，腺病毒無(wú)法整合到宿主的染色體中，故無(wú)法實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定表達(dá)。

4 展 望

隨著人們對(duì)肝癌臨床和基礎(chǔ)研究的日益深入，通過(guò)基因打靶技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)、核酸干擾技術(shù)等可以將離體培養(yǎng)、基因敲除或基因定點(diǎn)修飾后的動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成動(dòng)物個(gè)體，這將很好地解決動(dòng)物轉(zhuǎn)基因效率低和基因表達(dá)方面的問(wèn)題，為肝癌動(dòng)物模型提供發(fā)展方向。此外，進(jìn)一步利用基因技術(shù)或其他科學(xué)方法，使肝癌動(dòng)物模型的建立不斷改進(jìn)和完善，能夠?yàn)楦伟┑幕A(chǔ)理論和臨床應(yīng)用研究提供更理想的動(dòng)物模型。