心臟移植動(dòng)物模型的構(gòu)建

何瑩，宮念樵（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，器官移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430030）

心臟移植動(dòng)物模型是研究移植免疫學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃椭匾侄蝃1-5]。從 1964 年 Abbott等[6]首次成功建立小鼠心臟移植模型開始，經(jīng)過了50多年的發(fā)展，逐漸形成了一系列相對(duì)穩(wěn)定的心臟移植模型建立方法，其中以小鼠和大鼠異位心臟移植模型最為常用，頸部和腹部為主要移植部位。本文就心臟移植動(dòng)物模型的建立方法進(jìn)行綜述，旨在為將來建立更加穩(wěn)定的移植動(dòng)物模型，更好地研究移植免疫學(xué)提供基礎(chǔ)。

1 小鼠頸部異位心臟移植模型

1991年Chen[7]建立了小鼠頸部心臟移植模型，此方法具有創(chuàng)傷小、污染小、術(shù)后存活率高等優(yōu)點(diǎn)，且能滿足二次移植的需要。同年，Matsuura等[8]成功地將改良的Cuff技術(shù)應(yīng)用于小鼠心臟移植建模中，其優(yōu)點(diǎn)是血管吻合口不易出血、狹窄。血管吻合時(shí)間短（5～10分鐘）。血管吻合處內(nèi)膜無損傷及異物，遠(yuǎn)期通暢率高。

通常采用體重為20～30 g的雄性BALB/c和C57BL/10小鼠進(jìn)行手術(shù)。腹腔注射約0.2～0.3 ml 1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，在20倍率手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行操作。供體取腹部正中切口，充分暴露手術(shù)視野，下腔靜脈注入1 ml含有50 U肝素的生理鹽水溶液。經(jīng)腋前線剪開胸廓并去除胸前壁，從下腔靜脈注入1 ml冷心臟停搏溶液到右心房至心跳停止。結(jié)扎上、下腔靜脈并于遠(yuǎn)心端剪斷。游離升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，分別于其遠(yuǎn)端剪斷，以細(xì)絲線自心臟后部將肺靜脈一并結(jié)扎，在結(jié)扎遠(yuǎn)端剪斷后取出供心，將其放置在冷乳酸林格液中以待移植。

受體小鼠麻醉后固定，右側(cè)頸肩部備皮消毒。以右下頜角和右鎖骨中點(diǎn)連線切開皮膚，暴露右側(cè)頜下腺并摘除，自鎖骨處向遠(yuǎn)心端游離右頸外靜脈至分叉處。去除右側(cè)胸鎖乳突肌，暴露并游離右頸總動(dòng)脈至分叉處。制作動(dòng)脈端連接管： 夾閉頸總動(dòng)脈近心端，于頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉前結(jié)扎切斷頸總動(dòng)脈，保留遠(yuǎn)心端。在頸總動(dòng)脈游離緣套入留置管，于凹槽處以8-0顯微縫線環(huán)扎固定。同法制作頸外靜脈連接管。將動(dòng)、靜脈套管分別用含有50 U/ml肝素鹽水沖洗，避免形成血栓。

將供心倒置于受體鼠頸部，其動(dòng)脈端連接管納入供心主動(dòng)脈，以顯微縫線在另一凹槽處環(huán)扎，同法將靜脈端套管與供心肺動(dòng)脈連接。 首先開放靜脈，然后緩慢開放動(dòng)脈，此時(shí)可見供心以主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈及肺動(dòng)脈順序充盈，供心轉(zhuǎn)為鮮紅色并很快復(fù)跳。調(diào)整并固定供心位置，避免動(dòng)、靜脈成角與扭曲，無張力縫合受體頸部切口。

術(shù)畢，受體皮下注射5%葡萄糖鹽水1 ml，肌注青霉素50 U/g。將小鼠放置在取暖燈下，通常小鼠在15～20分鐘后可以自行翻身爬行和飲水進(jìn)食。術(shù)后易見頸部移植心搏動(dòng)明顯，節(jié)律整齊，每日上下午各觸診1次，覺搏動(dòng)有力，節(jié)律整齊，約140～160次/分。若術(shù)后1天觸診移植心明顯變小，心搏無力或明顯增大，質(zhì)硬，心律變慢，則多有動(dòng)脈血栓形成或動(dòng)脈卡壓及靜脈吻合口狹窄等并發(fā)癥，則應(yīng)視為手術(shù)失敗[9]。

2 小鼠腹部異位心臟移植模型

1973年Corry等[10]成功建立了小鼠腹部心臟移植模型，手術(shù)創(chuàng)傷大、時(shí)間長(zhǎng)、污染機(jī)會(huì)多。同時(shí)對(duì)受體全身生理影響大，術(shù)后腹腔黏連嚴(yán)重，炎性反應(yīng)重，術(shù)后存活率低，且不易觀測(cè)供心存活情況，故未得到廣泛應(yīng)用。目前，實(shí)驗(yàn)中采用的手術(shù)方法多借鑒于大鼠Ono術(shù)式[11]。

以雄性健康C57BL/6和BALB/c小鼠作為供受體。腹腔注射0.01 ml/g 1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，并固定于自制手術(shù)臺(tái)上。沿正中切口入腹腔，顯露下腔靜脈，經(jīng)下腔靜脈推注0.2 ml肝素鈉使其肝素化。約1分鐘后，剪斷腹主動(dòng)脈放血并迅速剪開膈肌，沿兩側(cè)腋前線剪斷肋骨充分暴露心包。剪開心包，將胸腺組織向上推移，充分顯露心臟。于近心端分別結(jié)扎并切斷下腔靜脈和上腔靜脈，充分游離主動(dòng)脈，于頭臂干分支處橫斷；同法將肺動(dòng)脈在分叉處橫斷，然后將肺靜脈連同心臟后組織一并結(jié)扎并切斷；取下供心，將其置于4℃生理鹽水中保存。

將受體小鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上。備皮消毒皮膚，經(jīng)正中開腹，上至劍突下至尿道外口上緣約1 cm處。腹壁切口兩側(cè)采用自制拉鉤牽拉固定。剪開小腸與直腸間的系膜，將小腸向左上腹推移，充分顯露下腔靜脈。剪開結(jié)腸系膜和后腹膜，充分游離下腔靜脈及與其伴行的主動(dòng)脈；上至左腎靜脈分支下方，下至左右髂血管分叉上方約0.5 cm處。于下腔靜脈近心端和遠(yuǎn)心端各置1根阻斷帶，先阻斷近端血供，待腔靜脈充盈后阻斷遠(yuǎn)端血流。分別于腹主動(dòng)脈和腔靜脈作一縱行切口，行供心主動(dòng)脈和受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合。吻合方法為：將供心置于小鼠右側(cè)腹腔，于吻合口兩端各作一牽引線，自尾側(cè)一針連續(xù)縫合至頭側(cè)打結(jié)固定后，翻轉(zhuǎn)心臟至左側(cè)，行后壁連續(xù)縫合，與尾側(cè)牽引線打結(jié)固定。同法行肺動(dòng)脈和下腔靜脈端側(cè)吻合，吻合方法為一針連續(xù)縫合后壁先縫法，吻合至對(duì)側(cè)時(shí)自身打結(jié)固定1次。吻合完畢后，先開放遠(yuǎn)端血流，后松開近端阻斷帶。將腸管復(fù)位后，分兩層連續(xù)縫合關(guān)閉腹腔。

小鼠通常在術(shù)后10～30分鐘蘇醒。給予保暖，單籠飼養(yǎng)，不禁飲食。每天通過視診和觸診觀察供心的搏動(dòng)情況。如供心有搏動(dòng)，而且小鼠存活4天以上者視為手術(shù)成功[12]。

3 大鼠頸部異位心臟移植模型

目前，國(guó)內(nèi)外建立的大鼠頸部心臟移植模型多按照Chen[7]的術(shù)式進(jìn)行，雖該手術(shù)操作難度大，血管吻合困難，但創(chuàng)傷小，經(jīng)多次改進(jìn)后已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究。

以Wistar和SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，供體大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（3 μl/g）麻醉后固定。沿腹白線正中開腹，暴露下腔靜脈，緩慢推注2 ml肝素生理鹽水，3分鐘后剪開膈肌并沿雙側(cè)腋前線開胸，將胸壁翻起。剪開心包暴露心臟，以冰屑覆蓋心臟，分離上下腔靜脈，并于近心端離斷，同時(shí)結(jié)扎右心耳。去除胸腺游離升主動(dòng)脈及無名動(dòng)脈，在無名動(dòng)脈與左頸總動(dòng)脈之間結(jié)扎并切斷主動(dòng)脈弓（將殘端留長(zhǎng)些以免絲線脫落），留無名動(dòng)脈大約2～3 mm用來吻合。將顯微鑷插入心包橫竇并擴(kuò)張，可顯露肺動(dòng)脈，將右肺動(dòng)脈套線結(jié)扎并切斷，游離左肺動(dòng)脈，留末端4～5 mm切斷，用以吻合，注意將主動(dòng)脈與肺動(dòng)脈之間游離充分。提起心臟，用絲線將左上腔靜脈及全部肺靜脈一次性集束結(jié)扎、切斷，取出心臟后放入4℃肝素生理鹽水中保存。

受體大鼠麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，備皮，消毒、鋪孔巾，自下領(lǐng)骨至右鎖骨中線剪一斜切口，游離皮下組織和頜下腺體，結(jié)扎并橫斷胸鎖乳突肌，暴露頸動(dòng)脈鞘。游離右側(cè)頸外靜脈，在微血管夾近心端阻斷靜脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎并橫斷，用50 U/ml的0～4℃ 肝素生理鹽水沖洗管腔。同上述方法處理頸內(nèi)動(dòng)脈。

供心置于受體右頸部，定時(shí)用冰鹽水降溫，調(diào)整好供心位置以利吻合。在20倍手術(shù)顯微鏡視野下，供心無名動(dòng)脈與受體頸內(nèi)動(dòng)脈用10/0無損傷血管縫合線作端端吻合，具體方法為：在3點(diǎn)和9點(diǎn)處各吻合一針固定，再前壁吻合3針，然后順時(shí)針翻轉(zhuǎn)供心和微血管夾180°，暴露后壁并吻合3針，注意使邊距及針距均勻?qū)ΨQ。接著用8-0線作供心肺動(dòng)脈與受體頸外靜脈的端一端吻合，具體步驟為：先在3點(diǎn)處吻合一針固定，然后向9點(diǎn)處做4～5針間斷吻合，翻轉(zhuǎn)供心吻合對(duì)側(cè)。吻合完畢后先開放靜脈，若吻合口有滲血，可用小棉球輕壓片刻即可，一般不需補(bǔ)針。隨后開放動(dòng)脈，若吻合口有明顯出血，關(guān)閉微血管夾，補(bǔ)針；若吻合口有滲血，棉球輕壓片刻即可。開放后l～3分鐘供心即可由纖顫變?yōu)閺?fù)跳，觀察供心5～10分鐘正常復(fù)跳后，調(diào)整移植心于適當(dāng)位置以防血管扭曲，縫合皮膚。大鼠一般于15～30分鐘后可翻身爬行，術(shù)后飲水自由。

每天早晚視診及觸診各一次。正常移植心搏動(dòng)有力，節(jié)律整齊，心率為140～160次/分。觸診搏動(dòng)無力，節(jié)律減慢，做心電圖監(jiān)測(cè)，移植心搏動(dòng)停止，無心電活動(dòng)則視為排斥。若術(shù)后3天內(nèi)觸診移植心明顯變小、搏動(dòng)無力，或明顯增大、質(zhì)硬、節(jié)律減慢，則多為動(dòng)脈血栓形成或靜脈吻合口狹窄等并發(fā)癥，則視為手術(shù)失敗[13]。

4 異種心臟移植模型

大鼠與小鼠的異位心臟移植模型是重要的異種移植基礎(chǔ)研究動(dòng)物模型[14-16]。移植部位通常為頸部和腹部，頸部異種心臟移植模型更具優(yōu)勢(shì)。本文介紹一種頸部袖套法建立小鼠-大鼠異種心臟移植模型[17]。

取8～12周齡雄性BALB/c小鼠和雄性F344大鼠分別為供體和受體。供體、受體均行異氟烷麻醉。受體仰臥固定于加熱的手術(shù)墊上，對(duì)術(shù)區(qū)備皮進(jìn)行消毒。于右頸前外側(cè)縱行切開皮膚，上至下頜基底部，下至鎖骨，分離皮下脂肪組織，解剖游離出頸外靜脈。近心端以微血管夾夾閉后，近顱側(cè)結(jié)扎，離斷靜脈遠(yuǎn)心端。以肝素復(fù)方氯化鈉溶液（50 U/ml）沖去血管近心端游離段的血液及血凝塊。于頸外靜脈內(nèi)側(cè)離斷部分頸前肌群，尋找頸總動(dòng)脈并用同法進(jìn)行處理，避免損傷血管、神經(jīng)。將靜脈套入其套管中（18G），無損傷血管鉗夾住套管管柄及血管固定，外翻靜脈壁套于套管上，8-0絲線結(jié)扎固定。同法套入動(dòng)脈套管（24G），再次以肝素液沖洗血管游離段，防止血凝塊形成。受體頸部切口外敷濕鹽水紗布，等待植入供心。

供體仰臥位固定于加熱手術(shù)墊上并消毒術(shù)區(qū)。沿腹正中切口進(jìn)入腹腔，自下腔靜脈注入0.5 ml肝素復(fù)方氯化鈉溶液（50 U/ml），使全身肝素化，然后繼續(xù)自下腔靜脈緩慢推注3 ml肝素復(fù)方氯化鈉溶液，同時(shí)剪開腹主動(dòng)脈放血，待動(dòng)脈血變清亮，完成灌注。剪開胸廓暴露心臟，用4℃冷鹽水紗布外敷心臟表面，使其迅速降溫停跳。充分游離升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，緊靠無名動(dòng)脈起始和肺動(dòng)脈分叉處分別剪斷主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈。以8-0絲線分別結(jié)扎左、右上腔靜脈和下腔靜脈，其余進(jìn)出心臟的所有血管集束結(jié)扎，迅速剪下心臟后立即移植。

供心放入受體頸部切口中，以4℃冷鹽水紗布包裹。于供心肺動(dòng)脈邊緣縫一針牽引線，將受體頸外靜脈套管端插入供心肺動(dòng)脈內(nèi)，以8/0絲線環(huán)扎固定。用同法將頸總動(dòng)脈套管插入供心主動(dòng)脈內(nèi)，環(huán)扎固定。先松開靜脈血管夾，然后再松開動(dòng)脈血管夾，可見心臟立即充血、變紅，開始出現(xiàn)心肌纖顫并迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鞴?jié)律性跳動(dòng)，心率為160～200次/分。注意擺好供心位置，防止動(dòng)靜脈打折，術(shù)畢縫合皮膚。

術(shù)后保暖加溫1小時(shí)，并保持室溫約28℃。供心植入后，于受體頸部可直接觀察并觸摸到供心的搏動(dòng)情況，從供心復(fù)跳至完全停止跳動(dòng)的時(shí)間作為供心存活時(shí)間。小鼠-大鼠異種移植12小時(shí)后供心仍搏動(dòng)良好者則認(rèn)為手術(shù)成功。

5 工作型異位心臟移植模型

以上心臟移植動(dòng)物模型均為非工作型異位心臟移植，非工作型心臟移植左心室長(zhǎng)期無前負(fù)荷，不射血，可導(dǎo)致心肌收縮蛋白合成障礙，引起心臟的萎縮[18]。Ohmi等[19]和 Yokoyama等[20]通過破壞供心的三尖瓣和房間隔，使異位移植心臟的左心室獲得前負(fù)荷，成為工作型心臟。Maruyama等[21]和Figueiredo等[22]通過聯(lián)合供體心、肺異位移植到腹腔，右心室血液流經(jīng)肺動(dòng)脈→肺→肺靜脈→左心房→左心室，使左心室獲得前負(fù)荷，成為工作型心臟。Zehr等[23]用破壞主動(dòng)脈瓣膜的方法，產(chǎn)生主動(dòng)脈瓣反流，左心室具有一定的前負(fù)荷可保證左心室有排血功能。1997年，Klima等[24]通過結(jié)扎供心左肺動(dòng)脈，右肺動(dòng)脈與左心房端側(cè)吻合，升主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，建立了豬的工作型異位心臟移植模型。曹浩等[25]在前人研究的基礎(chǔ)上建立了大鼠工作型異位心臟移植模型。

Wistar大鼠作為供受體。供體心臟的取法與上述大鼠頸部異位心臟移植相同。

剪開肺動(dòng)脈以及左心房的近肺動(dòng)脈側(cè)邊緣，左心房切口可稍大于肺動(dòng)脈斷口，采用連續(xù)縫合法用8-0帶針縫合線將二者吻合?？p合前需將肺動(dòng)脈和左心房吻合口修飾平整，避免肺動(dòng)脈扭曲打折影響血流再通。去除主動(dòng)脈附近的脂肪組織、胸腺殘余以及心包膜等，預(yù)留主動(dòng)脈約2 mm，將斷端修剪平整后，在主動(dòng)脈斷口兩端，從外側(cè)向內(nèi)側(cè)穿兩根8-0帶針縫合線與血管壁上，預(yù)留備用。以上操作均需在冰盒內(nèi)低溫完成。準(zhǔn)備好后，將供心用濕紗布蓋好低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

受體大鼠術(shù)前禁食不禁水過夜準(zhǔn)備。供體心臟移植同上述小鼠腹部異位心臟移植。以邊距1 mm、針距0.7 mm端側(cè)吻合供心主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈。如有少量滲血，用消毒棉壓迫止血即可。如果有大量出血?jiǎng)t需要重新牽拉阻斷血流，補(bǔ)針縫合。一般血管阻斷時(shí)間控制在40分鐘內(nèi)不會(huì)引起大鼠術(shù)后下肢癱瘓。確定吻合可靠后，剪斷取下牽引線，再通血流后供心會(huì)迅速充盈，并在15秒～1分鐘內(nèi)由室性心律失常復(fù)跳至竇性心率（＞120次/分）。如果復(fù)跳不良，則應(yīng)采用心臟按摩法，保證心臟內(nèi)血液循環(huán)起來，一方面能夠防止血凝，另一方面持續(xù)為供心心肌供血恢復(fù)心肌活力。在吻合良好的情況下，最多按摩心臟5分鐘即可成功復(fù)跳。心臟復(fù)跳后，以溫鹽水沖洗腸袢并復(fù)位，并觀察3分鐘，若無供心心率減慢吻合口出血等情況，則可以關(guān)腹。

關(guān)腹消毒后，根據(jù)出血量皮下補(bǔ)液2～3 ml（羥乙基淀粉氯化鈉注射液），傷口滴加1 ml利多卡因局部麻醉鎮(zhèn)痛，將大鼠放在加熱的保溫墊上，保溫蘇醒。注意體位，應(yīng)保持側(cè)臥位，不可采用俯臥姿勢(shì)，防止體重壓迫供心，使吻合口扭曲，以致供心缺血停跳。一般在吻合口良好無滲漏血的情況下，2小時(shí)后即可完全蘇醒，單鼠單籠，給予正常飲食。每日觸診腹部供心的搏動(dòng)情況。一般在受體大鼠蘇醒后24小時(shí)，觸診供心心率＞120次/分，則視為移植成功。

6 總 結(jié)

以上介紹的心臟移植動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用，基本可以滿足器官移植后免疫排斥反應(yīng)和驗(yàn)證免疫抑制藥物療效等研究的需求。雖然仍可能存在手術(shù)操作難度大，血管吻合困難等問題，但是基于以往的實(shí)驗(yàn)方法，隨著移植技術(shù)的不斷改良，實(shí)驗(yàn)室條件的不斷改善，模型構(gòu)建的穩(wěn)定性和可靠性必然會(huì)有效地得到提高和保證。