動(dòng)脈化小鼠肝移植模型

張全勝，田英華（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 3009；.瑞士蘇黎世大學(xué)附屬醫(yī)院）

隨著臨床肝臟移植的飛速發(fā)展，科學(xué)家迫切需要建立合適的動(dòng)物肝臟移植模型，從基礎(chǔ)科研角度解決瓶頸問題。小鼠因其解剖生理與人類相似（與大鼠相比，小鼠有膽囊而大鼠無膽囊），而且小鼠的H2系統(tǒng)也與人類白細(xì)胞抗原（HLA）系統(tǒng)相似。加上人類對(duì)小鼠基因型了解得比較透徹，近十年來，已經(jīng)成功建立了基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并研制了大量相應(yīng)的特異性單克隆抗體，為肝移植術(shù)后免疫學(xué)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供了近于完美的實(shí)驗(yàn)品系。因此，利用小鼠來建立動(dòng)物肝臟移植模型成為器官移植基礎(chǔ)科研工作的首選。

1991年Qian等[1]首次成功建立了非動(dòng)脈化小鼠原位肝移植（OLT）模型。但非動(dòng)脈化的動(dòng)物模型明顯與臨床肝移植的生理過程有所差異。臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，肝動(dòng)脈系統(tǒng)是供肝側(cè)膽管及吻合口最主要的血供來源，肝動(dòng)脈重建的重要性不言而喻。移植術(shù)后早期發(fā)生的肝動(dòng)脈血供不良（HAI）是移植術(shù)后缺血型膽管損傷（ITBL）和致死性膽道并發(fā)癥的獨(dú)立性危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重影響受體再次肝移植率和存活率[2]。李永輝等[3]通過單純結(jié)扎正常小鼠肝動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其術(shù)后肝功能明顯異常，肝出現(xiàn)缺血性改變，尤其膽管病變明顯，膽管壞死增生，發(fā)生急性膽管炎，并可致肝內(nèi)感染，膿腫形成甚至死亡，說明結(jié)扎肝動(dòng)脈可危及小鼠生命。動(dòng)脈化的OLT模型因更接近于自然生理而受到廣泛關(guān)注。

總結(jié)大鼠和小鼠肝移植動(dòng)脈化模型發(fā)現(xiàn)，多數(shù)研究人員認(rèn)為大鼠的動(dòng)脈重建成功與否與大鼠移植術(shù)后的灌注損傷、長期生存率、膽道并發(fā)癥的發(fā)生沒有必然聯(lián)系[4]。但小鼠的情況卻與之不同，多數(shù)研究人員認(rèn)為小鼠肝移植的動(dòng)脈化相較于非動(dòng)脈化具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢：

1 動(dòng)脈化有利于減少肝細(xì)胞損傷及膽道并發(fā)癥

1.1 反映肝細(xì)胞受損情況的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），非動(dòng)脈化OLT模型術(shù)后1周內(nèi)的表達(dá)明顯高于動(dòng)脈化OLT模型。

1.2 堿性磷酸酶（ALP）是反映膽道上皮損傷情況的酶學(xué)指標(biāo)，動(dòng)脈化OLT模型術(shù)后ALP升高不明顯，而非動(dòng)脈化OLT模型術(shù)后2周ALP明顯升高，且持續(xù)時(shí)間長[5]。

1.3 動(dòng)脈化和非動(dòng)脈化OLT模型的常規(guī)病理明確提示，非動(dòng)脈化OLT模型術(shù)后1周可見肝細(xì)胞散在點(diǎn)、片狀壞死，匯管區(qū)可見淋巴細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞凋亡，輕度纖維化，伴小膽管增生。術(shù)后1個(gè)月匯管區(qū)小膽管明顯增生，極性紊亂，膽管上皮細(xì)胞增生，膽汁淤積，大體標(biāo)本肝臟內(nèi)可見明顯淤膽，不同程度的階段性膽道梗阻與擴(kuò)張。而動(dòng)脈化OLT模型術(shù)后1個(gè)月可見肝組織結(jié)構(gòu)良好，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小正常，染色均勻，偶見少量纖維組織增生，匯管區(qū)少量淋巴細(xì)胞浸潤，小管增生不明顯，無膽汁淤積?？梢姼蝿?dòng)脈重建有利于肝功能恢復(fù)，減少肝細(xì)胞損害和膽道并發(fā)癥。

2 能夠減輕器官保存引起的灌注損傷，延長供肝保存時(shí)間

Que等[6]報(bào)道顯示，供體冷保存長達(dá)16小時(shí)的非動(dòng)脈化小鼠肝移植模型，術(shù)后生存不超過2天。而Tian等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在同等條件下，動(dòng)脈化OLT模型能穩(wěn)定的長期生存。據(jù)此，Shen等[7]設(shè)計(jì)了器官不同冷保存時(shí)間的實(shí)驗(yàn)方案，以1小時(shí)、6小時(shí)、16小時(shí)、24小時(shí)來分別統(tǒng)計(jì)動(dòng)脈化/非動(dòng)脈化模型術(shù)后2周的存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈化小鼠模型存活率分別為100%、100%、47%和33%，而非動(dòng)脈化的存活率僅為92%、82%和8%。研究人員又針對(duì)24小時(shí)冷保存的器官移植術(shù)后進(jìn)行分組，觀察術(shù)后1小時(shí)、6小時(shí)和1天、3天、7天存活率，結(jié)果顯示動(dòng)脈化模型存活率分別為100%、66%、45%、41%和31%，高于非動(dòng)脈化模型的100%、44%、26%、15%和11%?？梢妼?duì)于長時(shí)間冷保存的供體肝臟來說，動(dòng)脈化OLT模型的術(shù)后存活率優(yōu)于非動(dòng)脈化OLT模型。目前，能夠解釋該現(xiàn)象的理論依據(jù)還不是十分明確，有學(xué)者注意到與動(dòng)脈化模型相比，非動(dòng)脈化模型術(shù)后CD4+表達(dá)明顯升高，從而增強(qiáng)了白細(xì)胞介素-2（IL-2）、γ干擾素、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，加重了非動(dòng)脈化模型的肝細(xì)胞損傷[7]。

3 提高術(shù)后長期存活率

Qian等[1]最早報(bào)道的非動(dòng)脈化小鼠肝移植模型研究指出，該模型的長期預(yù)后并不理想，術(shù)后2周存活率為70%～80%，術(shù)后3周存活率不超過60%。相反，Tian等[5]卻發(fā)現(xiàn)小鼠動(dòng)脈化的OLT模型能保持較好的長期存活率，認(rèn)為這得益于動(dòng)脈重建帶來更輕的炎癥發(fā)應(yīng)、更小的肝細(xì)胞損傷、能保持更完整的膽道形態(tài)，從而有利于小鼠肝功能的恢復(fù)，因而得以長期存活。

也有少數(shù)學(xué)者認(rèn)為動(dòng)脈重建對(duì)于小鼠肝移植模型術(shù)后受體的存活率和膽道并發(fā)癥無顯著性影響，而且IL-2、γ干擾素、TNF-α的基因表達(dá)水平也沒有顯著差異[8]，因而，對(duì)于由此產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)無明顯影響。這一問題，還需要今后更多的實(shí)驗(yàn)來深入研究。

實(shí)際操作中，小鼠的動(dòng)脈壁纖薄，吻合方式多統(tǒng)一采取11-0無損傷血管縫線兩點(diǎn)連續(xù)縫合方式。但供體動(dòng)脈吻合端的選擇有兩種不同方式：① 國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者采用供體腸系膜上動(dòng)脈襻與受體腹主動(dòng)脈進(jìn)行端側(cè)吻合的方法[5]；② 但也有學(xué)者認(rèn)為這樣供體血管較短，在受體左腎動(dòng)脈下腹主動(dòng)脈吻合時(shí)肝動(dòng)脈受到牽拉，影響肝動(dòng)脈血流。研究人員對(duì)此提出了改進(jìn)意見，將肝動(dòng)脈連同腹腔干及其以下的一段腹主動(dòng)脈作整段取出，然后將供、受體腹主動(dòng)脈進(jìn)行端側(cè)吻合，增加了供體血管長度，也增大了吻合血管的口徑，減少了并發(fā)癥[9]。還有學(xué)者報(bào)道采用肝固有動(dòng)脈支架法重建動(dòng)脈。但這一方法不可避免的形成繼發(fā)血栓。術(shù)后2周檢查肝動(dòng)脈通暢情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，21%受體鼠的動(dòng)脈支架附近有明顯的血栓形成[10]。

與人的解剖結(jié)構(gòu)相似，小鼠的肝動(dòng)脈也存在變異，而肝動(dòng)脈變異對(duì)肝動(dòng)脈重建造成不同的影響。常見的變異發(fā)生在肝動(dòng)脈起源于腸系膜上動(dòng)脈或胃左動(dòng)脈（＜10%），但并不影響隨后的動(dòng)脈重建，但其他一些很罕見的變異，例如肝固有動(dòng)脈直接由腹主動(dòng)脈發(fā)出、或由食管支發(fā)出、或肝左動(dòng)脈單獨(dú)由胃左動(dòng)脈發(fā)出（＜2%），如果出現(xiàn)上述情況，最好的辦法是另選供體[5]。

綜上所述，小鼠OLT模型的動(dòng)脈化有利于減少肝細(xì)胞損傷及膽道并發(fā)癥；能夠減輕器官保存引起的灌注損傷，延長供肝保存時(shí)間；提高術(shù)后長期存活率。但該模型技術(shù)難度較大，到目前為止，世界上只有少數(shù)研究中心能夠完成。這需要充分的實(shí)驗(yàn)條件準(zhǔn)備、嚴(yán)格的顯微外科操作訓(xùn)練和極大的耐心，才能知難行易。