血清MicroRNA作為生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)肝硬化診斷及預(yù)后判斷研究進(jìn)展

麻樹(shù)霖陳征綜述，劉曉峰審校

血清MicroRNA作為生物學(xué)標(biāo)記物對(duì)肝硬化診斷及預(yù)后判斷研究進(jìn)展

麻樹(shù)霖陳征綜述，劉曉峰審校

MicroRNA（miRNA）在生物體生長(zhǎng)、發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中都起著十分重要的作用。近期的實(shí)驗(yàn)表明，部分血清miRNAs在肝硬化患者水平差異較大，對(duì)肝硬化的診斷具有高度敏感性和特異性，提示血清miRNAs可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)記物用于肝硬化的臨床診斷及預(yù)后判斷。

肝硬化；miRNA；診斷；預(yù)后判斷

肝硬化是肝臟在慢性炎癥刺激下，肝小葉重建、假小葉和纖維結(jié)節(jié)形成的組織學(xué)發(fā)展過(guò)程。在中國(guó)乙型肝炎病毒的攜帶率高達(dá)7.18%，同時(shí)，近年來(lái)酒精性肝硬化、非酒精性脂肪肝發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)。其中，乙型病毒性肝炎被認(rèn)為是導(dǎo)致肝硬化的主要原因，其帶來(lái)的公民健康損害和社會(huì)負(fù)擔(dān)是難以估量的。據(jù)保守估計(jì)我國(guó)現(xiàn)有9300萬(wàn)乙型肝炎病毒感染者，是全球HBV感染人數(shù)最多的國(guó)家。目前的醫(yī)療水平尚不能清除人體內(nèi)的HBV，致使該病遷延難愈。肝硬化并發(fā)癥包括：食管胃底靜脈曲張、腹水、脾機(jī)能亢進(jìn)、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎、肝性腦病等，同時(shí)肝硬化還是肝惡性腫瘤的高危因素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，慢性HBV感染者約有15%～25%可能會(huì)因罹患HBV相關(guān)的肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌而過(guò)早死亡［1］。近幾年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs作為一類保守的非編碼RNA在肝硬化患者血清中表達(dá)異常［2］。而血清和血漿中含有來(lái)源于不同組織和器官的穩(wěn)定miRNAs，提示血清MiRNAs可能作為一種新的生物學(xué)標(biāo)記物用于疾病的無(wú)創(chuàng)檢查［3］。本文就血清miRNAs在臨床肝硬化診斷及預(yù)后分析方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　現(xiàn)有肝纖維化診斷方法的局限性

傳統(tǒng)肝硬化的診斷方法主要包括影像學(xué)、病理學(xué)和血清學(xué)三大類。（1）影像學(xué)檢查作為無(wú)創(chuàng)檢查普遍應(yīng)用于臨床工作，對(duì)于早期肝硬化化，影像學(xué)（超聲、CT、MR）診斷往往較為困難，而實(shí)時(shí)組織彈性成像技術(shù)容易受肥胖、腹水、肝臟周圍大血管、肋間隙狹窄等因素的影響；（2）病理學(xué)（肝臟穿刺活檢）是肝硬化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是明確診斷，衡量炎癥活動(dòng)度，以及判定藥物療效的重要依據(jù)，為避免肝穿刺的盲目性、肝臟病變的不均一性而導(dǎo)致抽樣誤差，往往需要用粗針穿刺，標(biāo)本長(zhǎng)度要求在1cm以上，并至少在鏡下包括6個(gè)以上匯管區(qū)，這導(dǎo)致肝穿刺活檢創(chuàng)傷較大，難以重復(fù)活檢，且并發(fā)癥也較為常見(jiàn)（約1/3的患者有疼痛；0.3%的患者出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括出血、氣胸、結(jié)腸和膽囊穿孔等）［4］；（3）血清學(xué)肝硬化指標(biāo)主要包括細(xì)胞外基質(zhì)成分、膠原酶類和細(xì)胞因子三大類，這其中以細(xì)胞外基質(zhì)成分較為常用。國(guó)外提出綜合多項(xiàng)有價(jià)值的血清學(xué)指標(biāo)建立診斷肝硬化的數(shù)學(xué)模型，如Fibrotest評(píng)分系統(tǒng)、AST/血小板指數(shù)（APRI）、FibrospectⅡ評(píng)分系統(tǒng)。但是，由于受到多方面結(jié)締組織代謝的影響，單項(xiàng)指標(biāo)只能反映肝硬化的某個(gè)方面，對(duì)診斷肝硬化的準(zhǔn)確性不高，導(dǎo)致其判斷作用是有限的，有時(shí)甚至是不可靠的。因此，進(jìn)一步提高肝硬化血清學(xué)診斷的敏感度和特異度需要繼續(xù)尋找新的能反映肝硬化程度的血清學(xué)指標(biāo)。

2　MiRNA與肝硬化的關(guān)系

MiRNA是一類廣泛存在于真核生物中，長(zhǎng)度為20～25nt的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，它通過(guò)與目標(biāo)mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯［5］。MiRNAs在形成肝纖維化并向肝硬化發(fā)展中扮演著重要的角色，它通過(guò)作用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞（HSC）的增殖與轉(zhuǎn)化影響肝纖維化向肝硬化發(fā)展的進(jìn)程［6］。MiRNAs還可以促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）的表達(dá)，從而抑制人HSC的凋亡［7，8］。研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展受基因甲基化的調(diào)控［9］。甲基化CpG結(jié)合蛋白2（MeCP2）是甲基化結(jié)合蛋白家族中的主要成員，它通過(guò)與甲基化DNA的特異性結(jié)合，抑制其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，起到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，而某些miRNAs，如mir-132的下調(diào)表達(dá)可阻礙MeCP2的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制MeCP2與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）的結(jié)合，同時(shí)削弱MeCP2對(duì)EZH2基因激活效應(yīng)，從而抑制HSC的活化，減緩肝纖維化發(fā)展為肝硬化的進(jìn)程［10］。

3　血清miRNAs作為生物學(xué)標(biāo)記物的潛力

越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在大量來(lái)源于不同組織和器官的穩(wěn)定miRNAs，它們由細(xì)胞主動(dòng)且可控地分泌釋放入血液，同時(shí)這些miRNAs在不同個(gè)體間的識(shí)別還具備可重復(fù)性和一致性［11～14］。此外，血清miRNAs還具有非常強(qiáng)的穩(wěn)定性、可再生性、對(duì)RNA酶的耐受性［13～16］。大量實(shí)驗(yàn)已證明，在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的室溫放置、多次凍融、高溫及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿處理的情況下，血清miRNAs仍能保持其穩(wěn)定性，而在同樣的惡劣條件下，蛋白質(zhì)類生物標(biāo)記物則會(huì)出現(xiàn)不同程度的降解［12，17］。MiRNAs在血清中之所以能夠穩(wěn)定存在可能主要受兩方面條件保護(hù)：（1）血清中miRNAs通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白或脂蛋白復(fù)合物結(jié)合而提高其穩(wěn)定性；（2）血清及血漿中的miRNAs被包裹在細(xì)胞膜微粒（外泌體、微泡、凋亡小體等）中，進(jìn)而避免被RNA酶降解［11，18～21］。此外，MiRNAs在病毒性肝炎、肝臟損害、肝硬化、肝癌及其他肝臟疾病患者的血清中均呈現(xiàn)差異性表達(dá)［18，22～25］。越來(lái)越多的miRNAs被證明在肝硬化患者血清中表達(dá)異常，血清中miRNAs的這些特點(diǎn)提示其可以作為生物學(xué)標(biāo)記物用于肝硬化的臨床診斷及預(yù)后分析［26］。

4　肝硬化患者血清MiRNA的差異

4.1肝硬化患者血清mir-101水平差異研究者通過(guò)對(duì)miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)mir-101在肝細(xì)胞癌（HCC）組織中表達(dá)上調(diào)，Wei等人則發(fā)現(xiàn)在乙型病毒性肝炎（CHB）患者中mir-101在HBV-X蛋白的影響下表達(dá)下調(diào)，并且在乙肝相關(guān)性肝細(xì)胞癌（HBV-HCC）組織中引發(fā)表觀遺傳學(xué)改變［27，28］。此后，Xie等人通過(guò)對(duì)CHB、乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝硬化（HBV-LC）及HBV-HCC三類患者及健康人的血清中miR-101進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：CHB組與對(duì)照組血清miR-101濃度沒(méi)有顯著差異；HBV-LC組miR-101水平明顯高于CHB組和對(duì)照組；HBV-HCC患者血清中miR-101相比于HBC-LC、CHB和對(duì)照組則出現(xiàn)明顯下調(diào)。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的ORC曲線分析，他們發(fā)現(xiàn)血清mir-101在鑒別診斷肝硬化和肝細(xì)胞癌時(shí)的靈敏度和特異度分別為95.5%和90.2%，提示血清mir-101可作為區(qū)分HBV-HCC和HBV-LC的潛在無(wú)創(chuàng)性生物學(xué)標(biāo)記物。為了研究HBV-LC發(fā)展為HBC-HCC的風(fēng)險(xiǎn)與miR-101之間的關(guān)系，Xie利用二元邏輯回歸將性別、年齡、飲酒情況和血清ALT水平控制在同一水平，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血清miR-101的表達(dá)下調(diào)與高HBV-HCC的風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。在之后的研究中，他們還發(fā)現(xiàn)在診斷由HBV-LC進(jìn)展而來(lái)的HBV-HCC時(shí)，血清miR-101優(yōu)于血清甲胎蛋白（AFP），而二者聯(lián)合用于HBV-HCC的診斷相比于血清miR-101單獨(dú)用于HBV-HCC的診斷則沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)。因此他們認(rèn)為，miR-101可作為一種新的無(wú)創(chuàng)生物學(xué)指標(biāo)用于HBV-LC的臨床診斷，對(duì)CHB向HBV-LC進(jìn)展的情況進(jìn)行有效監(jiān)控并及時(shí)發(fā)現(xiàn)由HBV-LC發(fā)展而來(lái)的HBV-HCC［29］。

4.2肝硬化患者血清中miR-375的差異研究顯示miR-375基因在活化期肝星狀細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，并證實(shí)miR-375通過(guò)DNA甲基化作用參與了肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細(xì)胞的過(guò)程，而這一過(guò)程是肝硬化形成的中心環(huán)節(jié)［30-32］。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上，70%-90%的CpG分散于DNA序列中，呈低甲基化狀態(tài)，另一種集簇存在，稱為CpG島，位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近，處于非甲基化狀態(tài)，DNA復(fù)制后啟動(dòng)子CpG島序列內(nèi)的5′胞嘧啶被甲基修飾，導(dǎo)致DNA結(jié)合蛋白與DNA主螺旋溝的結(jié)合能力降低，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性。Mir-375啟動(dòng)子區(qū)存在CpG島，miR-375通過(guò)甲基化作用沉默特定基因的表達(dá)，控制蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和抗凋亡等生物效應(yīng)，從而影響肝硬化的發(fā)生與發(fā)展［31］。在另一研究中，研究者通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)肝硬化患者血清中miRNAs進(jìn)行高通量分析，篩選出明顯差異表達(dá)的miRNAs并進(jìn)行PRC分析發(fā)現(xiàn)，包括miR-375在內(nèi)的一系列miRNAs與正常人相比呈明顯的差異性表達(dá)［2］。在不久的將來(lái)，我們或許可以通過(guò)分析血清miR-375的表達(dá)水平對(duì)肝硬化的進(jìn)展情況進(jìn)行有效檢測(cè)。

4.3肝硬化患者血清中miR-181b的差異研究發(fā)現(xiàn)miR-181b通過(guò)作用于p27基因促進(jìn)HSC的增殖分化，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）則可以誘導(dǎo)miR-181b表達(dá)上調(diào)［33］。Wang分析了22位肝硬化患者和17位健康人的血清miR-18a和miR-18b水平，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清miR-18b水平明顯高于健康人，表明血清miR-18b或許可以作為肝硬化的潛在生物學(xué)診斷標(biāo)記物［34］。

4.4肝硬化患者血清mir-122的差異Zhang研究發(fā)現(xiàn)，血漿Mir-122比血清轉(zhuǎn)氨酶更早的反應(yīng)了肝臟的損害，而Trebicka等人對(duì)小白鼠的研究表明miR-122的血清水平在對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝臟損傷中升高，并且比其他指標(biāo)更早的反應(yīng)了肝細(xì)胞的破壞［23，35］。Waidmann et al從107位肝硬化實(shí)驗(yàn)組患者和143位對(duì)照組患者血清中提取Total RNA，并對(duì)miR-122進(jìn)行qPCR分析，發(fā)現(xiàn)肝功能失代償期肝硬化患者血清中miR-122水平低于代償期的肝硬化患者血清中miR-122水平，合并腹水，自發(fā)性腹膜炎和肝腎綜合征的肝硬化患者血清中miR-122水平明顯低于未合并有上述并發(fā)癥的患者血清中mir-122水平。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量Cox回歸分析可以發(fā)現(xiàn)miR-122的血清水平是獨(dú)立于MELD評(píng)分，性別和年齡的肝硬化生存率相關(guān)因素。因此血清miR-122水平被認(rèn)為是一種用于評(píng)價(jià)肝硬化患者的預(yù)后的新的潛在指標(biāo)參數(shù)［36］。

4.5肝硬化患者血清miR-571和miR-652的差異Christoph Roderburg的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)大樣本量的肝硬化病人隊(duì)列進(jìn)行miRNAs高通量分析及qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)了一系列miRNAs在肝硬化患者血清中表達(dá)異常。其中在以往研究中并未引起重視的miR-571和miR-652在肝硬化患者血清中呈顯著的差異性表達(dá)。肝硬化患者肝細(xì)胞中miR-571在促纖維化因子TGF-β的作用下表達(dá)上調(diào)，而其在血清中的表達(dá)水平出現(xiàn)了同步的上調(diào)。同時(shí)，血清miR-571水平變化還與肝硬化等級(jí)密切相關(guān)。此外，Mir-571在肝硬化患者循環(huán)單核細(xì)胞和血清中的濃度水平出現(xiàn)了一致的的下調(diào)表達(dá)。提示血清miRNAs不僅可以反應(yīng)肝硬化的發(fā)展進(jìn)程，還通過(guò)固有免疫細(xì)胞的炎癥信號(hào)通路調(diào)節(jié)包括肝纖維化在內(nèi)的各種慢性炎癥反應(yīng)。miR-571和miR-652的這些特點(diǎn)定義了一種新的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，并為今后慢性肝病及肝硬化的miRNA診斷及治療提供了一定的理論基礎(chǔ)［5］。

4.6硬化患者血清中miR-106b的差異性MiR-106b在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)多個(gè)基因（如TGF-β、p21/CDKN1A和ULK1基因）的表達(dá)，其中TGF-β可以通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的表達(dá)促進(jìn)肝纖維化的形成，暗示miR-106b參與了肝硬化的發(fā)生與發(fā)展［37］。Chen通過(guò)對(duì)肝硬化患者血清miRNAs進(jìn)行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)miR-106b、miR-122及miR-144在肝硬化患者血清中下調(diào)表達(dá)，而miR-181d，miR-181b則呈明顯上調(diào)表達(dá)。其中，血清miR-106b在檢測(cè)早期CHB-LC病人方面取得令人滿意的效果。此外，研究發(fā)現(xiàn)血清miR-106b可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)記物用于監(jiān)控肝硬化由代償期向失代償期的轉(zhuǎn)變，為肝硬化的臨床治療提供重要參考［33］。

4.7肝硬化患者血清中miR-33a的差異Mir-33a最近已成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。Mir-33a作為一種新的生物學(xué)標(biāo)記物被證明其血清濃度水平與肝硬化的進(jìn)展情況有密切的聯(lián)系，研究表明，mir-33a不僅可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的脂質(zhì)和膽固醇的代謝平衡，還與HSC的激活及肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。通過(guò)研究纖維蛋白酶原基因的表達(dá)和mir-33a在肝纖維化中的相關(guān)機(jī)制，Li等人發(fā)現(xiàn)，伴隨著CHB患者肝纖維化的發(fā)展，血清mir-33a水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，并且與I型膠原蛋白和α平滑肌肌動(dòng)蛋白翻譯水平顯著相關(guān)。另外，實(shí)驗(yàn)表明，mir-33a在人類肝星狀細(xì)胞和LX-2細(xì)胞中的表達(dá)水平高于肝癌細(xì)胞。暗示mir-33a在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用，除了其他常見(jiàn)的診斷方法（如肝臟瞬時(shí)彈性成像技術(shù)，傳統(tǒng)血清指標(biāo)）外，mir-33a可以作為一種新的工具用于早期肝硬化的診斷［38］。

4.8肝硬化患者血清中miR-29的差異肝硬化患者血清、肝星狀細(xì)胞中miR-33a的表達(dá)水平明顯下降，提示miR-29不只是可以用于治療，或許還具有作為生物學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)人類肝纖維化的潛力。MiR-29在慢性病毒性肝炎和肝纖維化病人中異常表達(dá)，而在原發(fā)性膽汁性肝硬化樣本中無(wú)明顯的表達(dá)異常，表明miR-29在不同病因的肝臟疾病之間的表達(dá)水平存在差異，提示血清miRNAs可用于鑒別診斷不同類型的肝硬化［39］。

5　總結(jié)與展望

隨著不斷的研究，越來(lái)越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者血清中呈差異表達(dá)。對(duì)慢性肝病及肝纖維化病人的分組研究表明，包括miR-29a，miR-197-3p，miR-505-3p，miR-652，miR-20a，miR-21，miR-34a，miR-122，miR-133a，miR-223，miR-571，let7等一系列標(biāo)志物在血清中異常表達(dá)，其中幾個(gè)標(biāo)志物與肝纖維化的程度相關(guān)。盡管血清中miRNAs水平的調(diào)控與他們?cè)诟卫w維化相關(guān)的特定細(xì)胞中的功能之間的聯(lián)系尚不明確，但是血清miRNAs作為生物學(xué)指標(biāo)具有良好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，血清miRNAs測(cè)定或許可以作為一種新的檢驗(yàn)方法用于肝硬化的臨床診斷及預(yù)后分析。更值得我們期待的是，下一代的深度測(cè)序（next generation sequencing，NGS）已經(jīng)能夠勝任生物體液中miRNAs的檢測(cè)工作，NGS或許可以成為miRNAs生物學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)的可行方法［40，41］。通過(guò)確立規(guī)范化的樣本采集、處理、提純及數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)，血清miRNAs測(cè)定將有望成為肝硬化臨床診斷及預(yù)后判斷的重要參考指標(biāo)。

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（收稿：2015-09-09）

（本文編輯：朱傳龍）

Serum MicroRNA in diagonsis of patients with liver cirrhosis

Ma Shulin，Liu Xiaofeng.
Department of Gastroenterology，Military General Hospital，Jinan 25000，Shandong Province，China

MicroRNAs（miRNAs）have emerged as master regulators in several biological processes.More and more studies have shown that serum miRNAs levels differ in liver cirrhosis.Serum miRNAs may serve as a potential biomarker for dignosis and prognosis of patients with liver cirrhosis

Liver cirrhosis；miRNA；Diagnosis；Prognosis

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.033

250000濟(jì)南市濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科

麻樹(shù)霖，男，26歲，碩士研究生。主要從事肝纖維化發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)及臨床研究

劉曉峰，E-mail：liuxf0531@126.com