胰島分離的研究進(jìn)展

程穎（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植科，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

成功的胰島移植可以將糖尿病患者的血糖水平維持在正常范圍內(nèi)，是臨床治療糖尿病的有效手段［1-2］。成功的β細(xì)胞代替治療是使受者實(shí)現(xiàn)糖代謝正常，脫離外源性胰島素，使糖化血紅蛋白水平（haemoglobin A1c，HbA1c）恢復(fù)正常，減輕糖尿病誘導(dǎo)的器官衰竭以及降低因使用外源性胰島素導(dǎo)致嚴(yán)重低血糖事件危及生命的風(fēng)險(xiǎn)。受者在接受胰島移植后糖尿病的急性和慢性并發(fā)癥將得到緩解，生活質(zhì)量得到極大改善［3］。

與胰腺移植相比，胰島移植具有并發(fā)癥發(fā)生率低、手術(shù)簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，但由于術(shù)后多數(shù)患者依賴胰島素，臨床沒(méi)有大規(guī)模開展。20世紀(jì)末，胰島分離技術(shù)的進(jìn)步使其為臨床胰島移植項(xiàng)目在全球的發(fā)展打開了大門。在Edmonton方案中研究者為糖尿病患者移植多個(gè)供體的胰島，通過(guò)使用低毒免疫抑制方案使7例受試者脫離了外源性胰島［4］，取得了突破性進(jìn)展。Edmonton方案也成為胰島移植標(biāo)準(zhǔn)［5-6］。盡管胰島移植取得了重大的進(jìn)步，實(shí)現(xiàn)了移植術(shù)后脫離胰島素治療，但大多數(shù)受者體內(nèi)移植胰島隨著時(shí)間的推移而被消耗，使胰島移植后5年的胰島素脫離率僅為10%。這種慢性胰島移植物功能的衰減可能與移植物排斥反應(yīng)和復(fù)發(fā)性自身免疫反應(yīng)有關(guān)［7］。

胰島分離純化是胰島移植的關(guān)鍵步驟，也是決定移植成敗的關(guān)鍵。影響胰島分離效果的因素很多，從供體腦死亡到胰島分離過(guò)程中，很多環(huán)節(jié)都會(huì)損耗胰島［8］。胰島制備過(guò)程包括供體的篩選、胰腺消化、胰島純化及胰島培養(yǎng)等。本文將闡述多種提高胰島分離產(chǎn)量的方法。

1 供者的篩選

很多供體相關(guān)因素能夠影響胰島分離結(jié)果，包括年齡、致死原因、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、冷缺血時(shí)間、住院治療時(shí)間、血管活性藥物的使用情況及血糖水平［9-15］。大多數(shù)情況下，較大的胰腺含有較多胰島［16］。因此，胰腺的重量是供體胰島的替代參數(shù)，一項(xiàng)研究通過(guò)分析345例供體信息得到了預(yù)測(cè)胰腺重量的公式［17］。研究發(fā)現(xiàn)∶① 男性的胰腺比女性更大；② 在40歲之前，胰腺重量隨年齡而增加；③ BMI與胰腺重量之間存在相關(guān)性，但與BMI相比，體表面積能更好地預(yù)測(cè)胰腺重量［18-19］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）來(lái)源的胰腺與腦死亡器官捐獻(xiàn)（donation after brain death，DBD）來(lái)源的胰腺在分離胰島的產(chǎn)量和功能上相似，但是臨床試驗(yàn)與該結(jié)果不完全一致［20］。日本在DCD供體的器官移植方面經(jīng)驗(yàn)豐富，他們?cè)贒CD供體來(lái)源的胰島移植中報(bào)道了第1、2、3年的移植物存活率分別是76.5%、47.1%和33.6%，多次胰島移植的存活率分別是100%、80.0%和57.1%。所有受者未發(fā)生嚴(yán)重低血糖事件，而且還有3例受體脫離胰島素分別14、79和215天［21］，這表明在DBD來(lái)源受限的情況下，DCD可作為分離胰島的重要來(lái)源。

2 胰腺組織的消化和酶

胰腺組織的消化采用酶消化分離法，將產(chǎn)生胰島素的胰島和胰腺的外分泌組織分離開。為了促進(jìn)胰島分離，需要將酶混合物灌注到胰島和外分泌組織的間隙中，消化間隙的結(jié)構(gòu)蛋白——膠原蛋白［22-23］。由于膠原蛋白的致密結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度，使其通常不能被普通的蛋白酶降解，但能被特異性高的膠原酶有效降解［24］。因此，膠原酶是分離胰島的關(guān)鍵成分，但單獨(dú)使用膠原酶不能充分消化胰腺組織［25］，這表明非膠原酶成分能促進(jìn)胰腺的消化。在1990年之前，天然膠原酶是從溶組織梭菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取出來(lái)的，廣泛應(yīng)用于胰島分離中，這種膠原酶分為2個(gè)不同的級(jí)別∶CⅠ和CⅡ，包含不定量的淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、殼多糖酶、唾液酸酶、透明質(zhì)酸酶、脂肪酶和磷脂酶［26-28］。因此，商品化的膠原酶在不同批次間具有成分和活性的差異，從而影響胰島分離的成功率［29-30］。20世紀(jì)90年代末，羅氏公司開發(fā)了一種經(jīng)純化的混合酶——Liberase HI，它是由CⅠ和CⅡ組成，并且添加了一種從嗜熱芽孢桿菌中提取的嗜熱菌蛋白酶，減少了不同批次之間酶活性的差異。隨后，Liberase HI應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)和臨床的胰島分離，提高了動(dòng)物和人胰島分離的產(chǎn)量和活性［31-32］。

溶組織梭菌有2個(gè)同源但不同的基因—ColG和 ColH，分別編碼 CⅠ和 CⅡ［33-34］。CⅠ和 CⅡ在結(jié)構(gòu)上完全不同，但這兩種酶的催化作用基本一致［35］。一些研究者認(rèn)為CⅡ是消化胰腺的關(guān)鍵酶而忽略了CⅠ的作用［36］。Kin等［37］的研究表明，與含CⅡ比例較高的酶相比，含CⅠ比例較高的酶能表現(xiàn)出更好的消化效果，研究還發(fā)現(xiàn)過(guò)多的CⅡ并不會(huì)促進(jìn)人胰島素的釋放，而是需要CⅡ/CⅠ比值適當(dāng)［38］。

深入研究胰島和外分泌組織之間的結(jié)構(gòu)和成分能促進(jìn)胰腺消化方法的改進(jìn)，先前的一些研究闡述了人胰腺內(nèi)不同類型膠原蛋白的分布情況。膠原蛋白Ⅳ存于導(dǎo)管和腺泡之間的基底膜內(nèi)［39］，胰島和外分泌組織之間存在的膠原蛋白亞型有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ［40］。Hughes等［41］研究發(fā)現(xiàn)，成人胰腺的胰島和外分泌組織之間的膠原蛋白類型主要是膠原蛋白Ⅵ。膠原蛋白Ⅵ含有大量的二硫鍵以保護(hù)其結(jié)構(gòu)不易被膠原酶破壞［42］。胰腺膠原蛋白受正常衰老過(guò)程的影響，Bedossa等［43］發(fā)現(xiàn)超過(guò)50歲的受試者體內(nèi)胰腺膠原蛋白的含量明顯高于青年受試者。因此，對(duì)膠原蛋白的深入認(rèn)識(shí)能助于對(duì)胰腺消化方法的改進(jìn)。

2007年，人們發(fā)現(xiàn)Liberase膠原酶的生產(chǎn)過(guò)程中使用了含牛神經(jīng)成分的物質(zhì)，使胰島移植具有潛在傳染朊病毒的風(fēng)險(xiǎn)，很多胰島移植中心出于安全考慮而換用Serva膠原酶，很大地影響了胰島的產(chǎn)量和質(zhì)量。比較使用Liberase HI 和Collagenase NB1分離人胰島的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Liberase HI分離的人胰島活性更佳［44-45］。采用高效液相色譜法和膠原蛋白降解活性實(shí)驗(yàn)分析了Liberase MTF、CIzyme Collagenase HA和Collagenase NB1，發(fā)現(xiàn)CIzyme Collagenase HA具有最強(qiáng)的膠原蛋白降解活性，其次 是 Liberase MTF 和 Collagenase NB1［46］。Balamurugan等［47］詳細(xì)地評(píng)估了8種不同的酶組合使用對(duì)人胰島分離產(chǎn)量的影響。這項(xiàng)研究中249例胰島分離中用到的酶包括純化和未經(jīng)純化的膠原酶（CⅠ和CⅡ），嗜熱菌蛋白酶及中性蛋白酶。根據(jù)酶的生化特征和酶的消化能力，用CⅠ、CⅡ和中性蛋白酶的混合物代替嗜熱菌蛋白酶配制成新的混合酶。與標(biāo)準(zhǔn)混合酶相比，使用這種新的混合酶能從胰腺炎和捐獻(xiàn)的胰腺供體中分離出更多胰島，并能保持良好的胰島活性和功能。Qi等［48］對(duì) Liberase HI、Collagenase NB1/NP 和 MTF C/T進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)比應(yīng)用這3種酶分離胰島的數(shù)量、活性、葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucosestimulated insulin secretion，GSIS）、葡萄糖刺激的耗氧量（glucose-stimulated oxygen consumption rate，ΔOCR）及小鼠胰島移植的效果發(fā)現(xiàn)，采用MTF C/T分離胰島的各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于采用Liberase HI 和Collagenase NB1/NP分離的胰島。此外，還有相當(dāng)多的研究致力于開發(fā)非酶的胰腺消化方法，不損傷胰島而選擇性地消化腺泡組織［49］，如采用雙向電流非接觸技術(shù)分離胰島［50］。這些混合酶和非酶型的胰島分離技術(shù)是否能在臨床胰島移植中應(yīng)用以及能否改善治療效果至今尚未闡明。

3 胰島純化

人的肝臟具有很強(qiáng)的再生能力和血管重建能力，因此可作為胰島移植部位［51］，而平均每個(gè)人的胰腺（90 g）通過(guò)酶消化可以得到大于40 ml的胰腺組織，不能以較大組織量注入肝臟中。此外，大量的臨床證據(jù)表明，將大量的組織顆粒注入肝臟中會(huì)立即引起肝栓塞、血栓、損傷甚至死亡［52］。顯然，為了移植安全只有減少組織量才能將胰島移植到肝臟內(nèi)。這可以通過(guò)胰島純化的操作得到高純度的胰島來(lái)實(shí)現(xiàn)。

根據(jù)密度差異將胰島從外分泌組織中分離出來(lái)是一種簡(jiǎn)單而有效的胰島純化方法。這種方法的理論基礎(chǔ)是利用胰島（＜1.059 g/ml）和外分泌組織（1.059～1.074 g/ml）之間的密度差異［53］，通過(guò)離心使胰島和外分泌組織在連續(xù)密度梯度液中分布到自己的密度區(qū)間。理論上，胰島和外分泌組織之間存在的密度差異能有效地分離胰島。但是，會(huì)有部分胰島沒(méi)有完全和外分泌組織分離開，外分泌物質(zhì)釋放和組織水腫，使外分泌組織的密度下降而不能純化分離到大量高純度的胰島。

COBE 2991的出現(xiàn)迅速提高了胰島純化的產(chǎn)量［54］。其中，最為常用的一種純化介質(zhì)是聚蔗糖。Scharp等［55］研究發(fā)現(xiàn)，去掉Ficoll中低分子量物質(zhì)能提高胰島純化的產(chǎn)量。UW液能減少腺泡組織水腫［56-58］，Huang等［59］將UW液應(yīng)用于胰島純化過(guò)程中，將UW液和泛影酸鈉加入Ficoll 中制成密度梯度液用于分離胰島，與之前的純化液相比，明顯提高了胰島純化的產(chǎn)量。之后，Barbaro等［60］將UW-Bicoll純化方法進(jìn)一步改良，采用一個(gè)較窄的密度區(qū)間純化胰島使其純化效率達(dá)到85%。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在純化過(guò)程中應(yīng)用OptiPrep能減少胰島分泌的促炎因子和趨化因子，并在臨床上取得不錯(cuò)的成效［61］。McCall等［62］對(duì)比了 Ficoll-，histopaque-，dextran-和碘克沙醇的胰島純化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用histopaque不僅能純化出胰島而且花費(fèi)最低，是一種經(jīng)濟(jì)可行的純化方法。Shimoda等［63］采用了一種大瓶純化技術(shù)，以ET-Kyoto和碘克沙醇作為純化液，待純化組織加在純化液的上層，離心使胰島和外分泌組織分離開。這種技術(shù)較傳統(tǒng)的分離技術(shù)能提高胰島的產(chǎn)量和活性。此外，一些其他的研究使用磁性分離胰島［64］，盡管可以分離豬胰島，且具有臨床應(yīng)用的潛力，但這項(xiàng)技術(shù)如何轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用至今尚未闡明。

4 胰島培養(yǎng)

臨床胰島移植依賴于成功的人胰島分離，然后通過(guò)體外培養(yǎng)維持胰島功能直至實(shí)行移植手術(shù)。雖然在移植實(shí)驗(yàn)中是否應(yīng)該立即將分離的胰島實(shí)行移植有爭(zhēng)議［65］，但將人胰島培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行移植對(duì)于臨床治療是有益處的，能夠?yàn)榛颊咛峁?zhǔn)備時(shí)間以及移植前的免疫治療時(shí)間，并且在培養(yǎng)期間可以完成各種質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)（如微生物學(xué)檢測(cè)和熱源檢測(cè)實(shí)驗(yàn)）。一項(xiàng)非常重要的研究領(lǐng)域就是利用一些物質(zhì)在培養(yǎng)過(guò)程中改善胰島活性以及促進(jìn)移植后的胰島功能，如在培養(yǎng)液中加入抗氧化劑能成功地維持胰島的完整性［66］。胰島分離后極易受到缺氧的損傷［67］，另一項(xiàng)研究領(lǐng)域就是減少培養(yǎng)過(guò)程中的缺氧損傷。一些新的生物材料也應(yīng)用于胰島培養(yǎng)過(guò)程中改善胰島活性，如細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）代替物為胰島提供天然的微環(huán)境［68］，還有一些用ECM胰島包被技術(shù)、生物支架和生物反應(yīng)器等。

5 總 結(jié)

近幾年，臨床胰島移植技術(shù)發(fā)展迅速以及免疫抑制治療也取得了很大的進(jìn)步，使胰島移植受體的5年胰島素脫離率達(dá)到60%［69］。目前的研究仍需致力于如何從供體中獲得大量高活性的胰島，使其在受體內(nèi)長(zhǎng)期維持調(diào)控血糖的功能。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)還需要付出更多努力，為糖尿病患者帶來(lái)福音。