植酸酶體外水解植物性飼料原料工藝條件的研究

■吳豐惟祝愛俠劉　翼卜小麗韓朋偉王春維，2

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.武漢市畜禽飼料工程技術(shù)中心，湖北武漢430023）

?

植酸酶體外水解植物性飼料原料工藝條件的研究

■吳豐惟1祝愛俠1劉翼1卜小麗1韓朋偉1王春維1，2

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.武漢市畜禽飼料工程技術(shù)中心，湖北武漢430023）

摘要：為解決直接添加植酸酶到水產(chǎn)飼料中不利于植酸酶充分發(fā)揮作用的問(wèn)題。試驗(yàn)參考吉富羅非魚飼料配方，以豆粕、棉粕和菜粕為原料，按比例為15∶9∶7混合，采用植酸酶進(jìn)行體外水解，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解效率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)研究加酶量（A）、反應(yīng)溫度（B）、加水量（C）和酶解時(shí)間（D）4個(gè)不同因素對(duì)植酸酶體外水解植物性飼料原料效率的影響。結(jié)果表明，各因素對(duì)植酸酶體外水解植物性飼料原料效率的影響程度依次是A＞B＞C＞D。其最佳酶解工藝條件為：加酶量為2 000 U/kg底物，反應(yīng)溫度35℃，加水量50%，酶解時(shí)間為3 h。在此條件下得出的植酸酶水解效率為42.16%。

關(guān)鍵詞：植酸酶；體外水解；單因素試驗(yàn)；正交設(shè)計(jì)；水解效率

磷是構(gòu)成動(dòng)物體的常量元素之一，是動(dòng)物骨骼、甲殼、鱗片和牙齒的主要構(gòu)成成分，也是參與體內(nèi)能量代謝、蛋白質(zhì)合成等許多生命活動(dòng)過(guò)程的重要元素[1]。飼料中的磷是畜禽及水產(chǎn)動(dòng)物攝取磷的主要來(lái)源，飼料中磷缺乏或VD3不足都會(huì)影響動(dòng)物對(duì)磷的吸收與利用，當(dāng)磷缺乏達(dá)到一定程度時(shí)，水產(chǎn)動(dòng)物就會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)速度下降、飼料效率降低和骨骼微量元素含量下降等癥狀[2]。而植物性飼料中的磷大部分以植酸的形式存在，不易被魚體所吸收，繼而直接排入養(yǎng)殖水體中，大量排放還會(huì)引起水體的富營(yíng)養(yǎng)化，導(dǎo)致藻類的大量繁殖和水體缺氧，給水產(chǎn)養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展帶來(lái)巨大威脅。

植酸是一類普遍存在于大多數(shù)植物性飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)。植酸能和某些蛋白質(zhì)形成難溶性的復(fù)合物[3]，阻礙蛋白質(zhì)的消化與吸收。植酸鹽還會(huì)使動(dòng)物體內(nèi)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶的活性降低，致使動(dòng)物體對(duì)蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率降低[4]。由于單胃和無(wú)胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏能分解植酸磷的酶，無(wú)法將植酸磷分解為可利用的無(wú)機(jī)磷，因此很難利用以植酸鹽的形式存在的磷[5-8]。必須在植酸酶的作用下才能被分解成可利用的無(wú)機(jī)磷。

現(xiàn)有的飼料加工技術(shù)都是將植酸酶直接加入到全價(jià)配合飼料粉狀原料中（包括：植物性、動(dòng)物性、維生素、礦物質(zhì)等多種原料，含有植酸的原料約占總原料的40%），再經(jīng)過(guò)一系列加工，如制粒、膨化、高溫調(diào)制、熟化制粒的加工過(guò)程，而植酸酶的耐熱性有限，造成其失活、有效性降低。另外被大家忽視的是植酸酶最適的pH值條件，植酸酶最佳酶解的pH值為5.5；因此現(xiàn)有的直接添加技術(shù)，被動(dòng)物采食后其胃（畜禽pH值為1.5～2.5，水產(chǎn)動(dòng)物腸道為中性）和畜禽腸道（pH值為7.0～7.5）環(huán)境均不利于植酸酶充分發(fā)揮功效，造成植酸酶的效率進(jìn)一步降低。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)原料與試劑

豆粕、棉粕、菜粕購(gòu)于武漢九星飼料有限公司；植酸酶(粉狀，2 500 U/g，最適pH值5.5)市購(gòu)。

表1植物性原料基本營(yíng)養(yǎng)成分(%)

1.2主要儀器與設(shè)備

TAS-990火焰型原子吸收分光光度計(jì)；超恒溫水浴鍋；隔水式恒溫培養(yǎng)箱；離心機(jī)；868型pH值計(jì)；電熱式恒溫干燥箱；分析天平等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1酶處理方法

參照Cain等的酶處理方法[9]，將粉狀植酸酶溶解到乙酸/乙酸鈉緩沖溶液中(約0.25 mol/l，調(diào)節(jié)pH值至5.5)，常溫下持續(xù)攪拌30 min，制成均勻酶液。

分別稱取150 g豆粕、90 g棉粕和70 g菜粕充分混合，作為底物。按照試驗(yàn)條件需要定量稱取植酸酶，加入定量體積的乙酸/乙酸鈉緩沖溶液(0.25 mol/l，pH值5.5)中，于磁力攪拌器上常溫?cái)嚢?0 min，制成均勻酶液后，倒入底物中，常溫下混合10 min，裝入密封袋中，密封；放入恒溫培養(yǎng)箱并設(shè)定溫度。酶解后將其取出，取樣并將樣品置于電熱式恒溫干燥箱中烘8 h至絕干，分別測(cè)定酶解前后底物樣品中的植酸含量，計(jì)算酶效率。

1.3.2測(cè)定方法

①水分和干物質(zhì)測(cè)定：依據(jù)國(guó)標(biāo)方法，植物性原料在105℃下烘干測(cè)定水分及干物質(zhì)含量(GB5497-85)。

②總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用改良凱氏定氮法(GB5505-85)。

③總磷的測(cè)定：釩鉬酸銨分光光度法[10]。

④植酸的測(cè)定：參照Miller等1980年提出的植酸測(cè)定方法[11]，有所改進(jìn)。

樣品處理：將樣品粉碎混勻后置于電熱式恒溫干燥箱中烘8 h至絕干。

a)植酸的提?。悍Q取約1 g樣品于50 ml塑料離心管內(nèi)，加30 ml 4%三氯乙酸室溫下震蕩提取2 h，靜置4～6 h。其后4 000 r/min離心10 min，取上清液，殘余沉淀用10 ml 4%三氯乙酸沖洗4 000 r/min離心10 min，取上清液合計(jì)約40 ml轉(zhuǎn)入另一個(gè)50 ml離心管。

b) Fe-phytate沉淀：向(a)中所得約40 ml上清液中加入2 ml FeCl3溶液(Fe3+濃度為4 μg/ml)，l00℃水浴加熱45 min，形成白色絮狀的Fe-phytate沉淀，冷卻后于4 000 r/min離心10 min棄去上清液；加入40 ml左右的蒸餾水洗去吸附的FeCl3，4 000 r/min離心10 min棄去上清液。

c) Fe-phytate沉淀的溶解：將(b)中所得沉淀物轉(zhuǎn)入離心管，向離心管中加入10 ml 1.5 M NaOH以溶解Fe-phytate沉淀，不斷震蕩，形成Fe(OH)3沉淀，4 000 r/min離心10 min棄上清液。用3.3 M HNO3溶解，形成Fe(NO3)3溶液，定容至50 ml容量瓶。

d) Fe含量的測(cè)定：用原子吸收分光光度法測(cè)定。

植酸含量的計(jì)算公式：

PA(μM)=Fe(μM)/4.2(4.2為Fe-phytate沉淀中鐵與植酸的摩爾比)

PA(μg)=PA(μM)×660(660為植酸分子量)

酶效率的計(jì)算公式

有效磷含量(μg)=總磷含量(μg)-植酸磷含量(μg)

酶效率（%）=100%-(處理后植酸磷含量/處理前植酸磷含量)×100%

1.3.3植酸酶最佳酶解條件的確定

首先采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以植酸酶酶解效率為指標(biāo)，對(duì)影響植酸酶體外酶解的主要因素（加水量、酶解溫度、加酶量和酶解時(shí)間）進(jìn)行單因素分析，確定酶解參數(shù)的適宜范圍。然后根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34），最終確定植酸酶體外酶解的最佳參數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1加水量對(duì)植酸酶體外酶解植酸的效率的影響

取5份底物，每份310 g，加酶量為1 000 U/kg底物，加水量分別為20%、30%、40%、50%、60%。將混合好的酶液分別倒入底物中，混合10 min后分別裝入封口袋中，放入恒溫培養(yǎng)箱中30℃下酶解5 h，測(cè)其植酸磷含量，計(jì)算植酸酶體外酶解植酸的效率，結(jié)果（如圖1）所示。

圖1加水量對(duì)植酸酶體外酶解植酸效率的影響

圖1可以看出，隨著底物中加水量的增加，底物中被分解的植酸逐漸增多，酶效率逐漸升高，當(dāng)加水量達(dá)到50%后，隨著加水量的增加，酶效率的增長(zhǎng)趨于平坦，說(shuō)明向底物中加入50%的水已經(jīng)基本滿足植酸酶體外酶解所需的水環(huán)境。在植酸酶預(yù)處理植物性飼料原料的過(guò)程中，若物料中水含量過(guò)低，由于缺乏媒介，植酸酶很難接觸到物料中的植酸，致使植酸酶的作用效果不佳；但隨著加水量的增加，物料中水含量不斷升高，越來(lái)越充足的水為植酸酶對(duì)植酸的催化分解反應(yīng)提供了一個(gè)良好的水環(huán)境，植酸酶的酶解效率也隨之升高；但是當(dāng)加水量增大到一定程度時(shí)，植酸酶反應(yīng)過(guò)程所需的水環(huán)境已具備，此時(shí)水環(huán)境不再是影響植酸酶發(fā)揮作用的主要因素，再增加加水量，植酸酶的酶效率也不會(huì)大幅增加，甚至當(dāng)加水量過(guò)高時(shí)，植酸酶酶液中植酸酶的濃度可能會(huì)因被過(guò)度稀釋而降低酶解效率，綜合考慮選擇50%加水量進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2溫度對(duì)植酸酶體外酶解植酸的效率的影響

取5份底物，每份310 g，加酶量為1 000 U/kg底物，加水量為50%，將混合好的酶液分別倒入底物中，混合10 min后分別裝入封口袋中，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中，分別將溫度設(shè)定為25、30、35、40℃和45℃，酶解5 h，測(cè)其植酸磷含量，計(jì)算植酸酶體外酶解植酸的效率，結(jié)果(如圖2)所示。

圖2可看出，隨著溫度升高，植酸酶酶解效率先呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度超過(guò)35℃時(shí)，又呈下降趨勢(shì)，這說(shuō)明植酸酶酶解有其最適宜的溫度范圍，過(guò)高或過(guò)低的酶解溫度環(huán)境都會(huì)阻礙植酸酶作用效果。原因在于植酸酶是一種蛋白質(zhì)，在溫度較低時(shí)，植酸酶的酶活會(huì)隨著溫度的升高而升高，反應(yīng)速度也隨之逐漸加快，但是當(dāng)溫度達(dá)到植酸酶的耐受上限之后，繼續(xù)升高溫度會(huì)導(dǎo)致植酸酶逐漸變性而失去活力，酶效率也不再增加，還有可能會(huì)降低。劉大川[12]的研究證實(shí)酶解反應(yīng)的溫度應(yīng)當(dāng)在一定范圍內(nèi)進(jìn)行上下波動(dòng)，而且產(chǎn)物的含量變化也不是很大。本試驗(yàn)中酶解溫度為35℃時(shí)，植酸酶的酶解效率達(dá)到最大值30.92%；繼續(xù)升高溫度，植酸酶酶解效率反而呈下降趨勢(shì)。因此，在適宜的范圍內(nèi)，升高溫度有助于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，但是一般的植酸酶在溫度超過(guò)35℃時(shí)，都會(huì)因不能耐受而逐漸失去活性。因此選取35℃為以后試驗(yàn)的酶解溫度。

圖2溫度對(duì)植酸酶體外酶解植酸的效率的影響

2.3加酶量對(duì)植酸酶體外酶解植酸的效率的影響

取5份底物，每份310 g，分別調(diào)節(jié)加酶量為500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/kg底物，加水量為50%，將混合好的酶液分別倒入底物中，混合10min后分別裝入封口袋中，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中35℃下酶解5 h，測(cè)其植酸磷含量，計(jì)算植酸酶體外酶解植酸的效率，結(jié)果如圖3所示。

試驗(yàn)中應(yīng)用微生物植酸酶在體外對(duì)植物性飼料原料中的植酸進(jìn)行水解，隨著植酸酶加量的不斷增大，植酸酶的酶解效率的增加幅度逐漸減小。圖3可看出，底物中植酸的量固定時(shí)，增加加酶量，植酸酶的效率也隨之增加，底物中被分解的植酸的量增加，但酶效率的增加幅度逐漸減小，并趨于平坦，當(dāng)加酶量為2 500 U/kg底物時(shí)，酶效率最高，為40.27%。底物中植酸的量是不變的，當(dāng)加酶量不斷增大時(shí)，植酸酶的濃度升高，越來(lái)越多的植酸被水解為肌醇和磷酸鹽，但隨著植酸酶濃度的不斷升高時(shí)，酶與底物的結(jié)合部位逐漸達(dá)到飽和，酶促反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降，當(dāng)酶濃度過(guò)飽和時(shí)，酶量的增加不再增加酶效率。考慮到植酸酶的價(jià)格問(wèn)題，選取植酸酶的加酶量為2 000 U/kg底物進(jìn)行下一步試驗(yàn)，此加酶量下的酶解效率為39.08%。

圖3加酶量對(duì)植酸酶體外酶解植酸效率的影響

2.4酶解時(shí)間對(duì)植酸酶體外酶解植酸的效率的影響

取5份底物，每份310 g，加酶量為2 000 U/kg底物，加水量為50%，將混合好的酶液分別倒入底物中，混合10 min后分別裝入封口袋中，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中35℃下分別酶解1、2、3、4 h和5 h，測(cè)其植酸磷含量，計(jì)算植酸酶體外酶解植酸的效率，結(jié)果(如圖4)所示。

圖4酶解時(shí)間對(duì)植酸酶體外酶解植酸的效率的影響

圖4可以看出，植酸酶體外水解植物性飼料原料時(shí)，植酸酶的酶解效率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解效率的增加量逐漸遲緩，3 h后酶效率已達(dá)到最大值41.94%，再繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，酶解效率沒有明顯變化，主要的原因可能是在酶解前期植酸酶的活力比較高，產(chǎn)物抑制比較小，當(dāng)酶解時(shí)間不斷延長(zhǎng)，植酸酶的作用位點(diǎn)已經(jīng)大部分?jǐn)嗔眩菜崦傅拿富盍ο陆?，其?duì)植酸的水解反應(yīng)漸漸停止。綜合考慮酶解效率和經(jīng)濟(jì)效益，選擇3 h作為下一步試驗(yàn)的酶解時(shí)間。

以植酸酶水解效率為參考指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)分析得出植酸酶體外水解植物性飼料原料的適宜條件為：加水量50%、溫度35℃、加酶量2 000 U/kg底物、酶解時(shí)間3 h。在此條件下，酶效率達(dá)到41.94%。

2.5植酸酶體外水解植物性飼料原料的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究不同因素對(duì)植酸酶體外水解植物性飼料原料效率的綜合影響，試驗(yàn)對(duì)加酶量、反應(yīng)溫度、加水量和酶解時(shí)間進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)L9（34），以植酸酶酶解效率為考察指標(biāo)，確定植酸酶體外水解植物性飼料原料的最佳工藝參數(shù)。正交試驗(yàn)因素水平表和正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表2和表3所示。

表2植酸酶體外酶解條件正交試驗(yàn)因素水平

由表3得知，根據(jù)極差R大小，影響指標(biāo)的因素主次順序?yàn)椋篈＞B＞C＞D，即加酶量＞酶解溫度＞加水量＞酶解時(shí)間。最佳酶解工藝條件組合為A3B2C3D1，但由單因素試驗(yàn)可知，當(dāng)加水量為50%和60%時(shí)效果幾乎一樣，從酶解成本方面來(lái)考慮，選用組合A3B2C2D1，即加酶量為2 000 U/kg底物，酶解溫度35℃，加水量50%，酶解時(shí)間為3 h。

由極差分析圖可知，凡是連成的直線越陡，則說(shuō)明其波動(dòng)越大，即對(duì)指標(biāo)的影響程度越大，是主要因素。由圖5可以看出，因素A對(duì)植酸酶的酶解效率的直線波動(dòng)最大，這也同樣說(shuō)明了影響植酸酶的酶解效率的主要因素是加酶量。

由于正交試驗(yàn)中無(wú)最佳組合試驗(yàn)，在此條件下做進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得植酸酶的酶解效率達(dá)42.16%，這也表明了正交試驗(yàn)分析的正確性。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究不同因素對(duì)植酸酶體外水解植物性飼料原料效率的影響，得出影響指標(biāo)的因素主次順序?yàn)椋篈＞B＞C＞D，即加酶量＞酶解溫度＞加水量＞酶解時(shí)間，最佳酶解工藝條件為A3B2C2D1，即加酶量為2 000 U/kg底物，酶解溫度35℃，加水量50%，酶解時(shí)間為3 h。在此條件下得出的植酸酶水解效率為42.16%。

表3正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

圖5極差分析

參考文獻(xiàn)

[1]黃峰.水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2011，4.

[2]楊義.飼料中磷的含量及利用率[J].湖南飼料，2005，6：27-29.

[3]何欣.植酸及其測(cè)定方法[J].中國(guó)飼料，1998，3：30-32.

[4] Komegay E T，et al.Response of broilers to graded level of microbi?al phytase added to maize-soybean-meal-based diets containing three levels of non-phytate phosphorus[J].British J.Nutr，1996，75：839-852.

[5] Nelson T S.The utilization of phytate phosphorus by poultry-A re?view[J].Poultry Sci，1967,46：862-871.

[6] Cromwell G L.Phytase appears to reduce phosphorus in feed [J]. Feedstuffs，1991，63(41)：14-16.

[7] Newman K.Phytase：The enzyme，its origin and characteristics：im?pact and potential for increasing phosphorus availability[J].Alltech Technical Publication，1995：169-177.

[8] Ravindran V，Bryden W L，Komegay E T.Phytases：Occurrence，Bioavailability and Implications in poultry nutrition [J].Poultry and Avian Biology reviews，1995，6 (2)：125-143.

[9] Cain K D，Garling D.Pretreatment of soybean meal with phytase for Salmonid diets to reduce phosphorus concentrations in hatch?ery effluents [J].Progr fish-Cult 1995，57：114-119

[10]鐘國(guó)清.飼料中無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷的測(cè)定方法[J].飼料工業(yè).2003，24(7)：32-34.

[11] Miller G A，Youngs V L，Oplinger E S.Environmental and culti?var effects on oat phytic acid concentration[J].Cereal Chemistry，1980，57(3)：189-191.

[12]劉大川.酶解法制備大豆肽的研究[J].中國(guó)油脂，1997，6（1）：14-16.

（編輯：崔成德，cuichengde88@sina.com）

Study on the technology of enzymatic hydrolysis of plant feed ingredients in vitro

Wu Fengwei, Zhu Aixia, Li Yi, Bu Xiaoli, Han Pengwei, Wang Chunwei

Abstract：The study is to solve the problem that directly adding phytase into aquaculture feed cannot exert the action of phytase sufficiently. This experiment referenced the GIFT feed formulation ratio of 15∶9∶7 which is mixed of soybean meal, cottonseed meal and rapeseed meal, using hydrolysis in vi?tro of phytase, consider the hydrolysis efficiency as an indicator, apply orthogonal test based on singlefactor test to research with 4 influential factors addition of enzyme amount (A), the reaction tempera?ture (B), addition of water (C) and enzymatic reaction time (D). The optimal sequence was A＞B＞D＞D. The optimal parameters of hydrolysis by phytase of plant raw materials in vitro, the result as follows: addition of enzyme 2 000 U per kilogram of substrate, the reaction temperature 35℃, addition of wa?ter 50%, enzymatic reaction time 3 h. Under these conditions enzymatic efficiency comes to 42.19%.

Key words：phytase；hydrolysis in vitro；Single factor experiment；Orthogonal design；efficiency of hy?drolysis

收稿日期：2015-11-09

通訊作者：祝愛俠，講師。

作者簡(jiǎn)介：吳豐惟，碩士，主要從事飼料添加劑及資源開發(fā)的研究。

中圖分類號(hào)：S816.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-991X（2016）03-0049-05

doi:10.13302/j.cnki.fi.2016.03.010