智三針對AD模型大鼠腦內(nèi)ChAT及GLUT3表達的影響*

黃健婷，崔韶陽，2，唐純志△，羅曉舟，劉 明，卜正祥

(1.廣州中醫(yī)藥大學針灸康復臨床醫(yī)學院，廣州 510405; 2.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院康復科，廣東 深圳 518034)

智三針對AD模型大鼠腦內(nèi)ChAT及GLUT3表達的影響*

黃健婷1，崔韶陽1，2，唐純志1△，羅曉舟1，劉 明1，卜正祥1

(1.廣州中醫(yī)藥大學針灸康復臨床醫(yī)學院，廣州 510405; 2.深圳市福田區(qū)中醫(yī)院康復科，廣東 深圳 518034)

目的:觀察“智三針”對AD模型大鼠學習記憶能力、大腦皮質(zhì)ChAT及GLUT3的影響，探討針刺治療AD的機制。方法:采用腹腔注射D-gal聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ1-40建立AD模型，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、非穴組、智三針組各15只。記錄大鼠Y迷宮測試全天總反應時間(TRT)以評估其學習記憶水平，采用免疫組化染色法檢測大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)ChAT、GLUT3的表達水平。結果:造模后，模型組、非穴組、智三針組大鼠的TRT較正常組均延長，4周治療后與模型組、非穴組比較，智三針組大鼠TRT縮短;與正常組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)ChAT、GLUT3表達水平均顯著降低，與模型組、非穴組比較，智三針組ChAT、GLUT3表達水平均顯著升高。結論:“智三針”能提高AD大鼠的學習記憶能力，其機制可能與升高大鼠腦內(nèi)ChAT、GLUT3的表達有關。

智三針;阿爾茨海默病;膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶;葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3;大鼠

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種常見于老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以進行性的認知障礙、記憶障礙、失語、視空間技能障礙及精神病性癥狀等為主要表現(xiàn)。隨著病情的發(fā)展，AD患者逐漸失去自理能力，家庭和社會都將承受巨大的情感和經(jīng)濟負擔。因其復雜的病因病理不甚明了，到目前為止，對于 AD并沒有特異性治療方法［1］。近年來，針灸作為一種安全、有效、經(jīng)濟的治療方法，越來越多地運用到 AD治療中［2］?！爸侨槨庇缮裢パ?、雙側(cè)本神穴組成，主要用于智力低下、精神障礙、記憶障礙等，在臨床實踐中，“智三針”能有效地改善患者的學習記憶、認知障礙等功能［3-4］，但其作用機制并不明確。

本實驗采用腹腔注射D-半乳糖(D-gal)聯(lián)合雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1-40建立AD大鼠模型，通過對大鼠進行Y迷宮測試及大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase，ChAT)及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白3(Glucose transporter 3，GLUT3)水平的測定，探討針刺“智三針”穴對AD模型大鼠學習記憶能力的影響及其作用機制，進而為針灸防治AD提供實驗依據(jù)。

1 材料與器材

1.1 實驗動物

SPF級健康 SD大鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，購自中國中醫(yī)科學院實驗動物中心(動物合格證編號京SW2012069341)，于中國中醫(yī)科學院SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，在相同條件下(溫度21 ±2℃，濕度55±10%，12 h光照/12 h黑暗 循環(huán))自由攝食、飲水。該實驗經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審查合格(SPF20110032)。

1.2 主要實驗器材與試劑

WDT-2型腦立體定位儀(西安西北光電儀器廠)、Y迷宮裝置(河南原陽振華教學儀器廠)、石蠟包埋機、石蠟切片機(德國萊卡)、華佗牌針灸針(0.18×9 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)等。Aβ1-40(美國Sigma公司)、D-gal(上?；瘜W試劑總廠試劑二廠)、水合氯醛分析純(天津市大茂化學試劑廠)、ChAT試劑盒、GLUT3試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)等。

2 方法

2.1 AD模型的建立

70只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組15只(雄性8只，雌性7只)，造模組55只(雄性27只，雌性28只)。經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后，造模組大鼠接受腹腔注射0.96%D-gal(5 ml/kg)，正常組大鼠腹腔注射生理鹽水(5 ml/kg)，每天1次，連續(xù)6周。

6周后，造模組在第7周第1天接受雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ1-40。將Aβ1-40肽段溶于無菌生理鹽水中(5 g/L)，37℃孵育48 h備用。首先，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g)，將大鼠固定于腦立體定位儀常規(guī)消毒，顱頂部正中切開皮膚，暴露顱骨露出前囟。參照 Paxinos＆Watson大鼠腦立體定位圖譜［5］，選擇雙側(cè)海馬區(qū)為注射靶區(qū)(前囟后 3.5 mm，中縫旁開 2.0 mm，硬腦膜下 2.7 mm)，用牙科鉆在顱骨對應位置鉆開小孔，微量進樣器垂直進針2.7 mm，在兩側(cè)海馬區(qū)分別緩慢注入2 μL的 Aβ1-40，速度控制在 0.5 μL/min，留針 5 min，緩慢撤針以5 min為宜，縫合皮膚，術后采用抗感染(青霉素鈉肌注3 d，每天1次)、保暖等措施。正常組大鼠海馬區(qū)注射等量的生理鹽水。2周后，將存活的符合模型標準的造模組45只大鼠納入實驗，按隨機數(shù)字表法分為模型組、非穴組和智三針組各15只。

2.2 針刺方法

穴位定位參考李忠仁主編《實驗針灸學》，“智三針”神庭穴取大鼠百會穴正中前下方2 mm處，神庭穴兩側(cè)旁開0.5 mm處為本神穴，大鼠雙側(cè)肋弓最低點上2 cm處取為非穴。采用針刺捻轉(zhuǎn)手法，平補平瀉，于每天上午進行，捻轉(zhuǎn)頻率為 80±5次/ min，幅度為180±5°，持續(xù)刺激2min休息1 min，如此反復，持續(xù)15 min。每天1次，每周6次，共4周。正常組、模型組不給予針刺，抓取固定15 min。

2.3 Y迷宮測試

Y迷宮測試將分別于大鼠造模成功1周后及針刺療程結束后進行，保持周圍環(huán)境安靜、光線較暗，訓練及測試時間固定，由專人負責。首先，將大鼠置于起步區(qū)，隨機變換安全區(qū)與電擊區(qū)，以訓練大鼠辨別燈光刺激與安全區(qū)的能力。電擊參數(shù):電壓50～70 V，持續(xù)5 s。安全區(qū)以Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂順序變換，大鼠在電擊區(qū)通電后10 s內(nèi)一次性跑向安全區(qū)為正確反應，否則為錯誤反應。大鼠到達安全區(qū)后，燈光持續(xù)15 s，熄燈為結束1次測試，大鼠所在支臂為下一次測試起點，休息30 s后進行第2次測試，如此反復，每天訓練20次。第1～3天為學習階段，第4天測試記為短期記憶能力，第5天開始接受針刺等干預措施，第33天(針刺療程結束后)測試記為長期記憶能力。將全天總反應時間(total reaction time，TRT)記為評估學習記憶能力的指標。

2.4 標本采集及檢測

第33天Y迷宮測試之后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g)，快速斷頭取腦，分離大腦皮質(zhì)，經(jīng)4%中性多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片厚4 μm，按照試劑盒說明經(jīng)免疫組化染色，每張切片在光鏡下觀察，隨機觀察每組大鼠同一部位切片，選擇5個不重復視野，并利用全自動圖像分析系統(tǒng)，測出每張切片內(nèi)ChAT、GLUT3染色平均光密度和陽性面積率。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行完全隨機設計資料的方差分析比較各組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，Y迷宮數(shù)據(jù)、免疫組化結果均以(±s)表示。

3 結果

3.1 Y迷宮測試結果

表1顯示，各組大鼠第4天(治療前)及第33天(治療后)TRT結果。治療前與正常組比較，模型組、非穴組、智三針組大鼠的 TRT均延長(P＜0.05)，且模型組、非穴組、智三針組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明 AD造模大鼠出現(xiàn)學習記憶能力減退。治療后與模型組比較，非穴組與智三針組TRT均縮短(P＜0.05)，但是非穴組與其自身第4天比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與非穴組比較，智三針組TRT時間縮短(P＜0.05)，提示“智三針”能提高 AD模型大鼠的學習記憶能力。

表1 各組大鼠Y迷宮測試全天總反應時間TRT(±s)

表1 各組大鼠Y迷宮測試全天總反應時間TRT(±s)

注:與同時間點正常組比較:#P＜0.05;與同時間點模型組比較:*P＜0.05;與同時間點非穴組比較:△P＜0.05

組 別 鼠數(shù) 第4天(s) 第33天(s) 15 24.02± 9.58 21.82± 4.58模 型 組 15 37.77±14.09# 42.05±10.87非 穴 組 15 35.46±16.16# 33.08± 8.63*智三針組 15 37.40±14.26# 27.16± 6.67正常組＊△

3.2 大鼠大腦皮質(zhì)ChAT、GLUT3的表達

表2顯示，與正常組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)ChAT、GLUT3平均光密度值及陽性面積率均顯著降低(P＜0.01)，說明 AD模型大鼠腦皮質(zhì)內(nèi) ChAT、GLUT3蛋白表達降低。經(jīng)針刺治療后，與模型組比較，非穴組與智三針組大鼠的ChAT、GLUT3平均光密度值及陽性面積率均有所升高，但是非穴組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，而智三針組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與非穴組比較，智三針組大鼠ChAT、GLUT3的平均光密度值及陽性面積率顯著升高(P＜0.01)，說明“智三針”具有提高AD模型大鼠腦皮質(zhì)ChAT、GLUT3蛋白表達的作用。

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)ChAT及GLUT3蛋白表達的比較(±s)

表2 各組大鼠大腦皮質(zhì)ChAT及GLUT3蛋白表達的比較(±s)

注:與正常組比較:##P＜0.01，與模型組比較:＊＊P＜0.01，與非穴組比較:△△P＜0.01

GLUT3平均光密度值 陽性面積率 平均光密度值 陽性面積率正 常 組組 別 例數(shù) ChAT 15 2.46±0.55 5.66±1.36 2.47±1.29 7.48±1.85模 型 組 15 0.32±0.07## 1.97±0.24## 0.49±0.08## 3.17±0.73##非 穴 組 15 0.40±0.04 2.20±0.32 0.52±0.11 3.81±0.77智 三 針 組 15 1.17±0.26＊＊△△ 4.06±0.84＊＊△△ 1.25±0.23＊＊△△ 6.09±1.38＊＊△△

4 討論

臨床實踐表明，針灸療法對AD患者的智能及社會活動功能康復有積極作用?！爸侨槨卑ㄉ裢ァ㈦p側(cè)本神穴歷代記載均為調(diào)神要穴。《淮南子·精神訓》中說道:“神者，智之淵也?！鳖^為精明之府，諸陽之會，腦為元神之府，主宰人的精神智力、思維、記憶和情感等?！夺樉难麥\解》中記載:“神庭，居處為庭。腦為元神之府，穴當天庭之上，為神的居處，主治煩悶恍惚，癲狂風癇諸疾?！北旧裱?，《針灸穴名淺解》謂其:“穴在前額發(fā)際，內(nèi)應于腦……故善治有關神識諸病，如驚癇、癲風、神不歸本等癥，故名本神?！睆默F(xiàn)代醫(yī)學角度，“智三針”位于前額頭皮，內(nèi)應大腦額葉，額葉功能與情感、認知、智力密切相關，故“智三針”在治療神志疾患方面有其優(yōu)勢性。

本研究采用 D-gal腹腔注射聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ1-40建立 AD模型，一方面 D-gal腹腔注射可致大鼠出現(xiàn)與人類自然衰老相似的一系列生化改變、基因表達與調(diào)控異常、細胞退行性及行為學改變等;另一方面Aβ是 AD形成與發(fā)展的關鍵因素，聯(lián)合 Aβ片段注射可使膽堿能神經(jīng)元喪失功能，降低大鼠的學習記憶能力［6］。在 Y迷宮測試中，模型大鼠的TRT比正常大鼠延長，學習記憶能力受損。針刺療程后，與模型組比較，智三針組TRT明顯縮短，說明“智三針”能夠改善 AD大鼠的學習記憶功能。

AD患者在臨床上主要表現(xiàn)為記憶和認知功能障礙，中樞膽堿能系統(tǒng)參與學習記憶過程，AD的發(fā)生與膽堿能系統(tǒng)功能衰退關系密切［7］。乙酰膽堿(Acetylcholine，Ach)是膽堿能系統(tǒng)中參與學習記憶過程的重要神經(jīng)遞質(zhì)，而ChAT是Ach合成過程中重要的酶，Ach由膽堿、乙酰輔酶A在ChAT的催化下合成。研究報道顯示［8-9］，AD患者 Ach合成減少，ChAT的活性下降，且與癡呆的嚴重程度密切相關。本研究結果顯示，AD模型大鼠較正常大鼠出現(xiàn)學習記憶減退癥狀，且大腦皮質(zhì)ChAT蛋白表達較正常組顯著降低，AD大鼠膽堿能系統(tǒng)受到損害。智三針組大鼠經(jīng)過針刺治療后，學習記憶能力得到改善，且ChAT蛋白表達較模型組、非穴組大鼠均顯著提高，說明“智三針”能夠提高AD大鼠腦皮質(zhì)中ChAT表達，改善膽堿能系統(tǒng)功能。

在課題組前期研究中［10］，AD模型大鼠的相關病理腦區(qū)呈現(xiàn)出葡萄糖代謝降低的征象，而腦組織代謝所需能量幾乎全部來源于葡萄糖。體內(nèi)葡萄糖由血液通過血腦屏障進入腦細胞，需要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter，GLUT)的參與，而腦內(nèi)主要負責神經(jīng)元葡萄糖轉(zhuǎn)運的是 GLUT3［11］。已有研究發(fā)現(xiàn)，AD腦中GLUT3水平降低，可能導致腦葡萄糖攝取、代謝受損，進而影響腦功能狀態(tài)。GLUT3的大量減少，使得被轉(zhuǎn)入神經(jīng)元的葡萄糖減少，能量供應不足加速神經(jīng)元的退化及神經(jīng)系統(tǒng)的衰老。本研究結果顯示，AD大鼠大腦皮質(zhì)GLUT3蛋白表達較正常大鼠顯著降低，而智三針組大鼠GLUT3蛋白表達較模型組、非穴組大鼠均顯著提高，說明“智三針”能夠促進GLUIT3合成增加，加速神經(jīng)元的葡萄糖攝入，改善腦內(nèi)能量供應。

綜上所述，“智三針”能夠提高AD模型大鼠的學習記憶能力，其機制可能與改善膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)代謝、提高腦組織葡萄糖攝取從而改善能量代謝有關?！爸侨槨蹦茉谝欢ǔ潭壬细纳?AD病理狀態(tài)，但能否最終恢復至正常狀態(tài)需進一步研究探討。

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Effect of Zhisan Needle on the Expression of Chat And Glut3 in the Brain of Ad Model Rats

HUANG Jian-ting1，CUI Shao-yang1，2，TANG Chun-zhi1△，LUO Xiao-zhou1，LIU Ming1，BU Zheng-xiang1
(1.Clinical Medical College of Acupuncture，Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China; 2.Department of Rehabilitation，Acupuncture＆Massage，Shenzhen Futian Hospital of TCM，Shenzhen 518034，China)

Objective:To observe the effects of acupuncture at Zhisanzhen on the learning and memory abilities and the expression of the ChAT and the GLUT3 of the cerebral cortex in Alzheimer’disease(AD)model rats.Methods:AD model rats were induced by intraperitoneal injection of D-gal and bilateral hippocampus injection of Aβ1-40.Y-maze task was applied to gauge the success of modeling and to assess the learning and memory abilities of the rats.The control group (n=15)，the model group(n=15)，the acupoints group(n=15)and the sham point group(n=15)were included.Rats in the acupoints group and the sham point group were needled one time per day for 15 min，6 days in one week，and 4 weeks in all.Immunochemistry staining was used to identify the expression level of the ChAT and the GLUT3.Results: The total reaction time(TRT)of the AD model rats were much longer compared with the control group at the same time point.After the 4-week acupuncture intervention，the TRT of the acupoints group was shorter than the model group and the sham point group.Compared with the control group，the expression level of the ChAT and the GLUT3 in the cerebral cortex were decreased significantly in the AD model rats.Compared with the model group and the sham point group，the expression level of the ChAT and the GLUT3 were improved in the acupoints group.Conclusion:Acupuncture at Zhisanzhen can improve the learning and memory abilities in AD model rats，and its mechanism may be related to the regulation of the expression of the ChAT and the GLUT3 in the cerebral cortex.

Acupuncture;Alzheimer’s disease;ChAT;GLUT3;Rats

R345.3

:B

:1006-3250(2016)07-0915-03

2015-12-11

國家自然科學基金面上項目(81173350)-運用 PET技術研究智三針對AD大鼠腦功能代謝的影響

黃健婷(1990-)，女，江西贛州人，在讀博士，從事針灸治病機理的臨床與研究。

△通訊作者:唐純志(1966-)，男，湖南慈利人，教授，醫(yī)學博士，從事針灸治病機理的臨床與研究，E-mail:jordan664@ 163.com。