風濕寧膠囊含藥血清干預對CIA?FLS細胞增殖及凋亡的影響*

王一婕，王永輝，張曉圓，周 然

（1.成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，成都 610075；2.山西中醫(yī)學院，山西晉中 030006）

風濕寧膠囊含藥血清干預對CIA?FLS細胞增殖及凋亡的影響*

王一婕1，王永輝2，張曉圓2，周 然2

（1.成都中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，成都 610075；2.山西中醫(yī)學院，山西晉中 030006）

目的：探討風濕寧膠囊（FSN）含藥血清干預對CIA?FLS細胞增殖及凋亡的影響。方法：采用CCK?8法檢測各組血清干預24、48、72 h后對CIA?FLS細胞增殖狀態(tài)的影響；采用Annexin V?FITC／PI雙染法通過流式細胞儀觀察各組血清干預48 h后對CIA?FLS細胞早期和晚期凋亡情況的影響。結(jié)果：CCK?8法結(jié)果表明，在24 h，F(xiàn)SN各濃度（20%、10%和5%）含藥血清干預對CIA?FLS細胞的增殖無抑制作用；在48 h，20%FSN含藥血清和10%FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞的增殖都表現(xiàn)出不同程度的抑制。在72 h，F(xiàn)SN各濃度（20%、10%和5%）含藥血清對CIA?FLS細胞增殖均可見顯著的抑制效果，其中20%風濕寧膠囊含藥血清效果最好。Annexin V?FITC／PI雙染檢測結(jié)果表明，風濕寧膠囊含藥血清各濃度（20%、10%和5%）組都不同程度地提高了細胞總凋亡率，其中20%風濕寧膠囊含藥血清組對CIA?FLS細胞凋亡促進作用最強。結(jié)論：風濕寧膠囊含藥血清對CIA?FLS細胞增殖的抑制及凋亡的促進可能是其治療類風濕關(guān)節(jié)炎的機制之一。

風濕寧膠囊；CIA?FLS細胞；增殖；凋亡

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多關(guān)節(jié)滑膜炎癥為表現(xiàn)的系統(tǒng)性自身免疫性疾?。?］，主要影響外周關(guān)節(jié)，也可累皮膚、心臟、肺、眼睛等其他組織和器官。RA在我國的發(fā)病率為0.32% ～0.38%［2］，該病可發(fā)生于任何年齡，且發(fā)病率隨著年齡的增長而升高。目前臨床使用治療RA藥物存在明顯的胃腸道不良反應、毒副作用大等缺點，有必要進一步探索RA的病理生理機制，尋找安全高效的新型治療藥物［3］。近年來，中醫(yī)藥在治療RA方面有很大優(yōu)勢［4?5］，諸多方藥在改善RA患者生活質(zhì)量、緩解疼痛、減少致殘率、減輕藥物副作用方面都有重要臨床價值和廣闊應用前景。

類風濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學“痹癥”范疇。在《內(nèi)經(jīng)》三氣致痹學說中，寒濕二邪尤為重要，因寒濕二邪均為陰邪且寒性凝滯，寒邪客于經(jīng)脈，氣血為寒邪所凝滯、閉阻不通、不通則痛。氣血凝滯不通，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)冷痛、濕性重濁黏滯、阻礙氣血運行表現(xiàn)為肢體疼痛重著，二者相感病情多纏綿難愈?？傊?，痹癥的病理因素不離風、寒、濕、熱、痰、瘀諸方面。

風濕寧膠囊（FSN）主治風寒濕兼瘀血阻絡型痹癥，源于山西名老中醫(yī)白清佐教授的經(jīng)驗方，由17味中藥組成（羌活［6?7］、獨活［8?9］、青風藤［10?11］、威靈仙［12?13］、片姜黃、防風、川芎［14］、麻黃、肉桂、三棱、血竭、延胡索、川牛膝、熟地黃［15］、砂仁、生姜和甘草），具有祛風散寒、除濕通絡、活血止痛之功。自20世紀80年代開始，風濕寧膠囊就以醫(yī)院制劑的形式用以治療類風濕疾病。經(jīng)過多年的臨床應用證明，其可明顯改善患者癥狀、體征，延緩阻止病情進展且抗炎作用良好［16］。本文試圖從細胞水平探討風濕寧膠囊治療類風濕關(guān)節(jié)炎的生物學機制，闡釋其部分作用機理，拓寬其應用空間，也為尋求中醫(yī)藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

Annexin V?FITC／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒：南京碧波（BA12100）；Enogene Cell Counting kit?89：EnoGene（E1CK?000208?10）；胎牛血清：Gibco（10100?147）；0.25%胰酶溶液：基諾生物（GNM15050）；DMEM／F12培養(yǎng)基：HyClone（SH30023.01B）；T25培養(yǎng)瓶：Corning（430168）；96孔板：SIGMA（SIAL0596）；6孔板：SIGMA（SIAL0516）。

1.2 實驗儀器

FACSCalibur流式細胞儀：美國BD公司；倒置熒光顯微鏡：日本OLYMPUS；iMark型酶標儀：美國Bio?Rad；細胞培養(yǎng)箱：力康生物醫(yī)療科技控股集團（Heal Force HF151／212）；顯微鏡：上海長方光學儀器有限公司。

2 方法

2.1 大鼠成纖維滑膜細胞的傳代培養(yǎng)

將模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織取出后進行原代培養(yǎng)，等待組織塊周圍的滑膜細胞生長至約覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底80%面積時進行第1次傳代培養(yǎng)，待細胞再次增殖至覆蓋約80%培養(yǎng)瓶瓶底時，按上述步驟再次對其傳代，直至第4代后進行實驗研究。

2.2 FSN含藥血清的制備

取SPF級SD大鼠60只，隨機分為正常血清對照組、風濕寧膠囊血清組（0.66 g／kg）和Tofacitinib血清組（15 mg／kg）3組各20只。對各組大鼠每天灌胃2次，正常血清對照組用等量生理鹽水進行灌胃，持續(xù)7 d。第7天末次給藥后1 h采用乙醚對大鼠進行麻醉，隨后對其行腹主動脈取血，并放入37℃溫箱靜置1 h后，以3000 r／min／r離心10 min，收集上清。同組血清混勻后，在56℃水浴條件下滅活30 min，并采用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝入2 ml離心管，置－20℃保存?zhèn)溆?。并將獲取的風濕寧膠囊含藥血清按比例與DMEM／F12培養(yǎng)基配制成濃度分別為5%、10%、20%的培養(yǎng)液備用。

2.3 細胞分組與用藥

采用“2.1”項下模型大鼠第3代成纖維滑膜細胞，各組在加血清前先對成纖維滑膜細胞進行饑餓24 h，并分為空白血清對照組、Tofacitinib含藥血清組、20%含藥血清組、10%含藥血清組、5%含藥血清組。

2.4 CCK?8法檢測CIA?FLS增殖率

采用CCK?8法確定風濕寧膠囊對CIA大鼠成纖維滑膜細胞增殖的影響。用風濕寧膠囊含藥血清干預CIA大鼠成纖維滑膜細胞24、48、72 h后，通過對OD值檢測來間接反映細胞的活力和數(shù)量。

2.5 Annexin V?FITC／PI雙染法檢測CIA?FLS凋亡率

Annexin V?FITC／PI雙染法檢測FSN含藥血清干預對CIA?FLS凋亡的影響。采用Annexin V?FITC和PI的熒光標記通過流式細胞儀來檢測CIA?FLS細胞的凋亡比例。Annexin V?FITC和PI染色陰性代表正常細胞，Annexin V?FITC染色陽性同時PI陰性代表早期凋亡細胞，Annexin V?FITC和PI同時陽性代表壞死的細胞。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用LSD檢驗，不同時間點比較采用重復測量資料方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 FSN含藥血清對CIA?FLS增殖抑制影響

表1圖 1顯示，采用 CCK?8法觀察各濃度（20%、10%和5%）風濕寧膠囊含藥血清對 CIA?FLS細胞增殖的抑制作用。實驗結(jié)果表明，24 h與空白血清對照組比較，各濃度（20%、10%和5%）的風濕寧膠囊含藥血清組OD值未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而Tofacitinib含藥血清組OD值出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與 Tofacitinib含藥血清組比較，各濃度（20%、10%和5%）風濕寧膠囊含藥血清組OD值出現(xiàn)明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。48 h與空白血清對照組比較，Tofacitinib含藥血清組、20%風濕寧膠囊含藥血清組和10%風濕寧膠囊含藥血清組OD值出現(xiàn)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），5%FSN含藥血清組OD值未見明顯下降，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Tofacitinib含藥血清組比較，各濃度（20%、10%和5%）風濕寧膠囊含藥血清組OD值出現(xiàn)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。72 h與空白血清對照組比較，風濕寧膠囊各濃度（20%、10%和5%）含藥血清組和Tofacitinib含藥血清組OD值均出現(xiàn)不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Tofacitinib含藥血清組比較，10%風濕寧膠囊含藥血清組和5%風濕寧膠囊含藥血清組OD值出現(xiàn)明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），20%FSN含藥血清組OD值變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞OD值的影響（±s）

表1 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞OD值的影響（±s）

注：與空白血清對照組比較：?P＜0.05，與Tofacitinib含藥血清組比較：＃P＜0.05

組別例數(shù) 24 h（OD） 48 h（OD） 72 h（OD）空 白 血 清 對 照 組 6 0.612±0.039 0.855±0.038 1.150±0.051 Tofacitinib 含 藥 血 清 組 6 0.461±0.024? 0.561±0.036? 0.836±0.047?2 0%FSN含 藥 血 清 組 6 0.594±0.021＃ 0.617±0.039?＃ 0.812±0.062?1 0%FSN含 藥 血 清 組 6 0.606±0.041＃ 0.684±0.033?＃ 0.878±0.052?＃5% FSN 含 藥 血 清 組 6 0.614±0.050＃ 0.810±0.031＃ 0.960±0.065?＃

圖1 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞OD值的影響

3.2 FSN含藥血清對CIA?FLS凋亡的影響

圖2 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞凋亡的影響

圖3 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞凋亡的影響

表2圖2、3顯示，采用流式細胞儀對各濃度（20%、10%和5%）風濕寧膠囊含藥血清干預48 h后的CIA?FLS細胞進行Annexin V?FITC／PI雙染。檢測結(jié)果表明，與空白血清對照組比較，各濃度（20%、10%和 5%）風濕寧膠囊含藥血清組和Tofacitinib含藥血清組中CIA?FLS細胞總凋亡率都出現(xiàn)不同程度的升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Tofacitinib含藥血清組比較，5%FSN含藥血清組CIA?FLS細胞總凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），20%FSN含藥血清組和10%FSN含藥血清組CIA?FLS細胞總凋亡率有所升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞凋亡的影響（±s）

表2 FSN含藥血清干預對CIA?FLS細胞凋亡的影響（±s）

注：與空白血清對照組比較：?P＜0.05，與Tofacitinib含藥血清組比較：＃P＜0.05

組別 例數(shù) 總凋亡率（%）空 白 血 清 對 照 組 6 2.85±0.49 Tofacitinib含 藥 血 清 組 6 19.14±3.37?2 0%FSN含藥血清組 6 24.46±4.69?＃1 0%FSN含藥血清組 6 26.50±3.92?＃5%FSN含 藥 血 清 組 6 15.73±3.24?＃

4 討論與展望

類風濕患者滑膜細胞較正常人滑膜細胞增殖較快，被認為是“腫瘤樣增殖”。正常人的滑膜組織只有約1～3層，且存在于纖維性關(guān)節(jié)囊與關(guān)節(jié)腔的間隙中，由成纖維樣滑膜細胞、巨噬細胞樣滑膜細胞、蛋白多糖、膠原纖維、毛細血管和淋巴管等組成。類風濕患者的滑膜組織可以明顯增厚到4～10層，增多的滑膜細胞通過侵襲作用導致類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，所以如何能夠有效地抑制滑膜組織中所占比例最高的成纖維滑膜細胞的增殖和促進其凋亡，成為臨床治療的有效途徑之一。

本研究分別運用不同濃度（20%、10%和5%）的風濕寧膠囊含藥血清，對第3代CIA?FLS體外干預不同時間（24、48和72 h）后，通過CCK?8法觀察對CIA?FLS增殖的影響情況。實驗結(jié)果提示，陽性藥Tofacitinib含藥血清起效迅速，風濕寧膠囊含藥血清藥力持久。從24、48和72 h這3個時間點來觀察，風濕寧膠囊含藥血清對CIA?FLS細胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)出一定的時效關(guān)系，其中20%風濕寧膠囊含藥血清干預72 h抑制率較高，達到34%，而在24 h時其抑制率與空白血清無明顯差異，可能是中藥含藥血清中代謝成分起效較慢所致。

在細胞凋亡方面，本實驗采用流式細胞儀通過Annexin V?FITC／PI雙染來檢測風濕寧膠囊含藥血清對CIA?FLS細胞干預48 h后凋亡的影響。檢測結(jié)果提示，風濕寧膠囊含藥血清對異常增殖CIA?FLS細胞凋亡的促進，可能是該方在臨床中治療和緩解類風濕患者關(guān)節(jié)腫脹疼痛等癥狀的機制之一。由于實驗僅對各濃度（20%、10%和5%）風濕寧膠囊含藥血清干預CIA?FLS細胞48 h的凋亡進行了檢測，未能了解不同時間點凋亡的動態(tài)變化，結(jié)果中Annexin V陽性同時PI陰性細胞所占比例較低，而PI陽性同時Annexin V陽性細胞所占比例較高，可能是由于含藥血清干預時間較長導致多數(shù)CIA?FLS細胞進入了晚期凋亡。下一步的實驗中，我們將會縮短風濕寧膠囊含藥血清對CIA?FLS細胞的干預時間至12 h、24 h甚至6 h，以期更好地觀察藥物對細胞早期凋亡的影響。

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Effects of Serum Containing Fengshining Capsule Intervention on the Proliferation and Apoptosis of CIA?FLS Cells

WANG Yi?jie1，WANG Yong?hui2，ZHANG Xiao?yuan2，ZHOU Ran2
（1.Basic Medicine College，Chengdu TCM University，Chengdu 610075 China；2.TCM College of Shanxi，Jinzhong 030006，China）

Objective：To research the effects of FSN drug?containing capsule serum on CIA?FLS cell proliferation and apoptosis.Methods：CCK?8 method is used to detect serum intervention group 24，48，72 h after the impact on the CIA?FLS cell proliferation state；The Annexin V?FITC／PI double staining with flow cytometry instrument observation group serum intervention after 48 h of CIA?FLS the impact of early and late apoptotic cells.Results：The CCK?8 method detection results show that within 24 h，the concentration（20%，10%and 20%）of FSN drug?containing serum on the CIA?FLS did not appear obvious role.In 72 h，F(xiàn)SN each concentration（20%，10%and 5%）drug?containing serum and tofacitinib drug?containing serum on the CIA?FLS proliferation had visible significant inhibitory effect，of which 20%Fengshining capsules containing medicine serum works best.Annexin V?FITC／PI double dye test results show that the Fengshining capsules containing medicine serum concentrations（20%，10%and5%）groups each have different levels of the cell apoptosis rate，of which 20% Fengshining capsules containing medicine serum group of CIA?promote the strongest FLS apoptosis.Conclusion：Fengshining capsule drug?containing serum on the CIA?FLS inhibition of cell proliferation and apoptosis of promotion may be one of the mechanism of treatment of rheumatoid arthritis.

Fengshining capsule；CIA?FLS cells；Proliferation；Apoptosis

R285.5

：B

：1006?3250（2016）10?1326?04

2016?04?11

國家自然科學基金面上項目（81473589）?基于JAK?STAT信號轉(zhuǎn)導通路利用蛋白組學技術(shù)從方病證相關(guān)角度研究風濕寧膠囊治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制

王一婕（1982?），女，河北寧晉人，實驗師，在讀博士，從事方劑功效發(fā)揮機理及應用研究。