電針穴位對分娩大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)及5?HT mRNA與蛋白表達(dá)的影響*

蔣秋燕，王美麗，李 麗，李艷林，王夢瑩

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

電針穴位對分娩大鼠鎮(zhèn)痛效應(yīng)及5?HT mRNA與蛋白表達(dá)的影響*

蔣秋燕，王美麗，李 麗，李艷林，王夢瑩

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

目的：探討電針穴位對大鼠分娩的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其中樞5?HT、2A受體基因與蛋白的表達(dá)。方法：120例孕鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、電針三陰交穴組、電針合谷穴組、電針合谷加三陰交組、電針血海穴組及藥物組。熱水甩尾觀察鎮(zhèn)痛效應(yīng)，ELISA法檢測血清5?HT水平，Real?timePCR、Westernblot檢測中樞5?HT及2A受體mRNA與蛋白表達(dá)。結(jié)果：大鼠痛閾值治療前（F＝0.736）組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；治療后（F＝216.361）組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；血清5?HT、大腦、脊髓5?HT及2A受體mRNA與蛋白表達(dá)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。電針不同穴位由低至高依次為空白組＜血海組＜合谷加三陰交組＜合谷組＜三陰交組＜藥物組，不同程度降低血清5?HT表達(dá)水平，提高大鼠痛閾值及大腦、脊髓5?HT及2A受體mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：電針不同穴位產(chǎn)生不同針效作用與電針不同程度降低血清5?HT表達(dá)水平及提高中樞5?HT、2A受體mRNA與蛋白表達(dá)相關(guān)，揭示5?HT及2A受體參與電針穴位鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。

電針穴位；分娩鎮(zhèn)痛；5?HT及2A受體；mRNA與蛋白表達(dá)

分娩鎮(zhèn)痛是現(xiàn)代文明的標(biāo)志，無痛分娩一直是人們追求的目標(biāo)。針刺具有鎮(zhèn)痛作用，而對針刺穴位鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究一直是人們所探討的問題。5?羥色胺（Serotonin，5?HT）及2A受體參與疼痛的產(chǎn)生或調(diào)制，作為研究疼痛的靶點而受到關(guān)注。本研究通過對分娩大鼠應(yīng)用電針與杜冷丁注射、空白組對照觀察其鎮(zhèn)痛效應(yīng)，ELISA檢測大鼠血清5?HT水平、Real?timePCR、Westernblot檢測大鼠中樞5?HT及2A受體mRNA與蛋白表達(dá)，揭示電針穴位對大鼠分娩鎮(zhèn)痛效應(yīng)及作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 造模及分組

3月齡SD健康大鼠，體質(zhì)量（300±50）g，性成熟未交配及普通清潔鼠飼料均由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。大鼠按雌、雄1∶1比例合籠，自由攝食、飲水。每日上午檢查托盤，發(fā)現(xiàn)陰栓則將雌鼠取出編號觀察，腹部膨隆確定為妊娠。對120例造模成功的孕鼠按隨機(jī)數(shù)字?jǐn)?shù)字表法［1］分為空白組、電針組（三陰交穴組、合谷穴組、血海穴組、合谷加三陰交穴組）及藥物組各20例。

1.2 治療方法

孕鼠在妊娠第19天開始灌服蓖麻油啟動產(chǎn)程?？瞻捉M未行任何干預(yù)措施自然分娩，電針組在大鼠產(chǎn)程啟動開始電針。取穴［2］：電針合谷組在兩前肢第一二掌骨之間取穴直刺1 mm，旁開1 mm同一穴再針入1針。電針血海組在兩后肢股內(nèi)側(cè)中間，髕底內(nèi)側(cè)端至恥骨聯(lián)合連線的下1／9處取穴直刺5 mm，旁開1 mm2一穴再針入1針。電針三陰交組在兩后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處直刺3 mm，旁開1 mm同一穴再針入1針。電針合谷加三陰交組方法同上。避免兩針相觸短路，膠布固定后與電針儀連接，同一對正負(fù)極連接同一穴，能引起大鼠肢體輕微抖動為針刺得氣，頻率為2 Hz和100 Hz交替的疏密波，電壓9 V，強(qiáng)度0.1～0.3 mA，波寬0.2～0.6 mS，每次20 min，每隔2 h電針1次，直至產(chǎn)下最后1個仔鼠止；藥物組在孕鼠產(chǎn)程啟動后皮下注射杜冷1次，用量按體表面積等效劑量換算比率計算，即按人常用量100 mg／d，大鼠劑量100 mg×0.018＝1.8 mg，200 g體質(zhì)量大鼠的劑量為1.8 mg×0.2＝9 mg／kg）。200 g大鼠皮下注射杜冷丁1.8 mg，250 g大鼠皮下注射杜冷丁2.25 mg［3］。

1.3 大鼠痛閾測定方法

熱水甩尾痛閾測定，各組大鼠在治療前后分別以（50±0.5℃）熱水浸燙鼠尾2cm，記錄入水至甩尾出水的間隔時間（測量3次取其均數(shù)，時間按秒計算）。因大鼠針刺后最高痛閾值并不都在同一時段出現(xiàn)，針刺前后10 min、20 min、30 min、60 min共5個測量時段，而統(tǒng)計分析時則不分時段選取最大痛閾值，觀察大鼠鼠尾熱水浸燙至甩尾出水的間隔時間。統(tǒng)計學(xué)分析，痛閾值以s計量，所有測量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用STATA8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，針刺前后痛閾值比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析［4］。

1.4 標(biāo)本采集方法

各組大鼠在接受以上治療方法產(chǎn)下最后1個鼠仔時斷頭取血6 ml左右，30 min內(nèi)完成離心，將血清放置無熱原、無內(nèi)毒素試管，標(biāo)號凍存于－20～－70℃電冰箱，以備ELISA檢測；迅速用生理鹽水洗干凈，選擇大腦灰質(zhì)頂葉區(qū)及脊髓腰膨大段，標(biāo)號保存在－80℃冰箱備Real?time PCR。所有標(biāo)本均在3個月內(nèi)完成檢測。

1.5 儀器、試劑及步驟

1.5.1 實驗儀器 PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀（美國ABI公司Applied Biosystems 2720 Thermal cycler）；DYY?8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ?2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；H6?1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司）；TU?1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；StepOne型熒光定量PCR儀（ABI）。

1.5.2 實驗試劑 大鼠5?HT、ELISA Kit（貨號FA01983B）由上?？婆d商貿(mào)有限公司進(jìn)口美國TSZ公司產(chǎn)品。

Real?time PCR引物由生工生物工程上海（股份）有限公司設(shè)計與合成，LightCyclerR480 DNA SYBR Green I Master由生工生物工程上海（股份）有限公司提供。TRIzol試劑購于invitrogen公司，定量PCR試劑：ABI SybrGreen PCR Master Mix（2X）購于ABI公司DNA Marker，第一鏈cDNA合成試劑盒（AMV First Strand cDNA Synthesis Kit），氯仿、異丙醇、無水乙醇、DEPC H2O，6×DNA Loading Dye，10 ×TAE（400mM Tris?acetateand 10mM EDTA，pH8.0）等其他試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.5.3 實驗步驟 血清5?HT水平分析采用ELISA檢測分析，具體操作按說明書進(jìn)行；Real?time PCR檢測分析5?HT及2A受體mRNA表達(dá)，分別將大鼠腦灰質(zhì)頂葉區(qū)及脊髓腰膨大段提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩??HT引物：F：5′GTCACCT GCGACCTGTTTATC 3′，R：5′GCGTCCTTTTGTTCAC ATAGTCT 3′，5?HT2A引物，F(xiàn)：5′TGCCACCAACT ATTTCCTGAT3′，R：5′AAGAGCACATCCAGGTAAA，TCC 3′；管家基因（β?actin）引物，F(xiàn)：5′?CGTAAAGACCTCTATGCC AAC A?3′，R：5′?CGG ACTCA CGTACTCCTGCT?3′。擴(kuò)增條件：95℃ 2 min，95℃ 10 s變性，60℃40 s退火，72℃延伸，40個循環(huán)。Trizol Reagent由invitrogen提供。Western blot檢測中樞5?HT及2A受體蛋白表達(dá)，將大鼠大腦灰質(zhì)、脊髓腰椎膨大段組織總蛋白提取，稱取120 mg加入預(yù)冷500 uL細(xì)胞裂解液，裂解30 min離心4℃，12000 r／min 20 min，蛋白定量。將蛋白上樣緩沖液稀釋，煮4 min置 －80℃ 備用。經(jīng)SDS?PAGE電泳分離，至溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時停止電泳。然后轉(zhuǎn)膜（250 mA，90 min），取下PVDF膜用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，在室溫下振搖1～2 h，滴加一抗在封閉的膜內(nèi)，4℃過夜。次日PBS漂洗15 min×1次，將膜用TBST清洗4次，每次5 min，再與二抗室溫下孵育1 h。TBST清洗后，將顯影劑滴加到PVDF膜正面，凝膠圖像系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白灰度值。BCA蛋白濃度測定試劑盒由Biovision公司提供，抗5?HT、5HT2A抗體由abcam公司提供，二抗及化學(xué)發(fā)光試劑盒由Abbkine公司提供。按說明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，各組間均數(shù)兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠痛閾值及血清5?HT表達(dá)比較

表1顯示，6組大鼠痛閾值干預(yù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），干預(yù)后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。配對t檢驗結(jié)果顯示，除空白組外，其他各組均顯著高于干預(yù)前。進(jìn)一步LSD多重比較結(jié)果顯示，與空白組比較，電針各穴位組及藥物組痛閾明顯升高，痛閾由低至高依次為空白對照組＜血海組＜合谷加三陰交組＜合谷組＜三陰交組＜藥物組；血清5?HT含量方差分析結(jié)果顯示，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。除空白對照組外，其他5組大鼠血清5?HT表達(dá)水平均有不同程度降低，降低作用由低至高依次為空白對照組＜血海組＜合谷加三陰交組＜合谷組＜三陰交組＜藥物組。

表1 6組大鼠痛閾值及血清5?HT比較（±s）

表1 6組大鼠痛閾值及血清5?HT比較（±s）

注：與空白組比較：??P＜0.01；與三陰交組比較：§§P＜0.01；與血海組比較：＃＃P＜0.01

組別 例數(shù) 干預(yù)前痛閾 干預(yù)后痛閾 5?HT（Pg／ml）空 白 對 照 組 20 6.94±0.89 7.26±1.09 204.08±8.69電 針 三 陰 交 穴 20 6.98±1.06 18.26±1.21?? 119.45±18.19??電 針 合 谷 穴 20 6.86±1.00 15.96±1.52 151.76±14.49電針合谷加三陰交 20 7.31±0.82 14.28±0.97 134.35±7.17電 針 血 海 穴 20 6.77±1.04 12.14±1.30??§§ 187.80±20.10??§§藥 物 組 20 7.01±0.96 19.45±1.84??§§＃＃ 98.12±22.61??§§＃＃F 0.736 216.361 124.647 P P＝0.598＞0.05 P＝0.000＜0.01 P＜0.01

2.2 6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體mRNA表達(dá)

表2顯示，Real?time PCR檢測6組大鼠中樞5?HT、2A受體及β?actin擴(kuò)增曲線拐點清晰，指數(shù)值明顯，基線平無上揚，擴(kuò)增到平臺期，各管擴(kuò)增效率接近，擴(kuò)增效率高，提示PCR擴(kuò)增良好；由熔解曲線可見，熔解曲線呈單一峰，說明所有基因擴(kuò)增的特異性，無非特異性產(chǎn)物存在。6組大鼠中樞5?HT、2A受體 mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。LSD多重比較顯示，由低至高依次為空白組＜血海組＜合谷組＜合谷加三陰交組＜三陰交組＜藥物組。

表2 6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體mRNA表達(dá)水平比值（±s）

表2 6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體mRNA表達(dá)水平比值（±s）

注：與空白組比較：??P＜0.01；與三陰交組比較：§§P＜0.01；與血海組比較：＃＃P＜0.01

組別 例數(shù) 大腦灰質(zhì)脊髓膨大段腰5?HT 5?HT 2A受體 5?HT 5?HT 2A受體空 白 對 照 組 20 1 1 1 1電 針 三 陰 交 穴 20 2.0278±0.4904?? 1.7573±0.2166?? 1.5954±0.1407?? 1.4050±0.3472??電 針 合 谷 穴 20 1.6500±0.4331 1.3939±0.1318 1.3916±0.0225 1.1186±0.336電針合谷加三陰交 20 1.6651±0.4185 1.5129±0.1477 1.4905±0.1369 1.2136±0.3715電 針 血 海 穴 20 1.4127±0.4304??§§ 1.2401±0.1224??§§ 1.2907±0.1618??§§ 1.0645±0.5737??§§藥 物 組 20 2.1782±0.3540??§§＃＃ 2.0939±0.3158??§§＃＃ 1.7024±0.0983??§§＃＃ 1.3106±0.3031??§§＃＃F 23.653 89.404 99.059 3.585 P 0.000 0.000 0.000 0.005

2.3 6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體蛋白表達(dá)

表3圖1顯示，Western Blot檢測6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體蛋白表達(dá)水平，并與內(nèi)參β?actin相比較，蛋白單條條帶清晰，片段大小與目的蛋白相符，6組蛋白條帶灰度掃描與β?actin蛋白條帶灰度比值為5?HT、5?HT 2A受體蛋白表達(dá)水平。方差分析結(jié)果顯示，大腦灰質(zhì)5?HT（P＜0.01），5?HT 2A受體（P＜0.01），脊髓5?HT（P＜0.01），5?HT 2A受體（P＜0.01）。大腦、脊髓5?HT、5?HT 2A受體蛋白表達(dá)水平在6組大鼠之間分布差異明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。進(jìn)一步LSD多重比較顯示，與空白對照組比較，電針各穴位組、藥物組均明顯升高，各組升高作用由低至高依次為空白組＜血海組＜合谷組＜合谷加三陰交組＜三陰交組＜藥物組。

3 討論

杜冷丁注射是目前臨床常用的分娩鎮(zhèn)痛藥物，但其有可能通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)對新生兒產(chǎn)生一過性的不良影響。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，分娩疼痛的產(chǎn)生是由于產(chǎn)時胎頭壓迫產(chǎn)道使氣血運行障礙，“不通則痛、不榮亦痛”。針刺有通經(jīng)脈、調(diào)血氣“通則不痛”的鎮(zhèn)痛機(jī)制。三陰交屬于足太陰脾經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)、足少陰腎經(jīng)的交會穴，針刺其穴可以同時激發(fā)肝、脾、腎、任脈等多條經(jīng)脈的經(jīng)氣，從而“氣至病所”，起到緩解分娩疼痛的作用。合谷穴為手陽明經(jīng)原穴，陽明為多氣多血之經(jīng)，能行氣活血、振奮周身之陽氣；三陰交加合谷穴為遠(yuǎn)隔配穴，遠(yuǎn)近相承，陰陽互濟(jì)，可理氣行血?！夺樉拇蟪伞酚小昂瞎妊a(bǔ)即墜胎”，它是傳統(tǒng)的下胎方；血海穴為足太陰脾經(jīng)要穴之一，因善治血證而得此名，有疏肝、調(diào)氣血、調(diào)經(jīng)的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針不同穴位可不同程度地提高分娩大鼠痛閾值，由低至高依次為血海組＜合谷加三陰交組＜合谷組＜三陰交組，由此說明經(jīng)絡(luò)腧穴間具有不同針效作用。

表3 6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體蛋白灰度值比較（±s）

表3 6組大鼠中樞5?HT、5?HT 2A受體蛋白灰度值比較（±s）

注：與空白組比較：??P＜0.01；與三陰交組比較：§§P＜0.01；與血海組比較：＃＃P＜0.01

組別 例數(shù) 大腦灰質(zhì)脊髓膨大段腰5?HT 5?HT 2A受體 5?HT 5?HT 2A受體空 白 對 照 組 20 0.2245±0.0011 0.4540±0.0167 0.2070±0.0035 0.0918±0.0305電 針 三 陰 交 穴 20 0.2695±0.0032?? 1.9464±0.0256?? 0.2930±0.0005?? 1.7513±0.0141??電 針 合 谷 穴 20 0.2268±0.0024 1.4200±0.0086 0.1755±0.0012 1.1510±0.0033電針合谷加三陰交 20 0.2340±0.0003 1.6700±0.0300 0.1780±0.0004 1.4900±0.0093電 針 血 海 穴 20 0.2250±0.0015??§§ 0.7800±0.0974??§§ 0.1740±0.0004??§§ 0.8000±0.0370??§§藥 物 組 20 0.2745±0.0002??§§＃＃ 1.9750±0.0302??§§＃＃ 0.3023±0.0035??§§＃＃ 1.7800±0.0140??§§＃＃F 3273.675 3860.178 17509.260 18148.677 P 0.000 00.000 0.000 0.000

圖1 6組大鼠大腦、脊髓5?HT、5?HT 2A受體蛋白表達(dá)

其次，從神經(jīng)解剖學(xué)顯示，支配子宮的交感神經(jīng)來自T10?S2節(jié)段［5］，副交感神經(jīng)來自L6?S1神經(jīng)節(jié)段［6?7］，即支配大鼠子宮的神經(jīng)纖維來自T10?S2，峰值在T13?L2和L6?S10。而支配大鼠三陰交穴神經(jīng)纖維來自L3?6，合谷穴相應(yīng)的神經(jīng)節(jié)段主要分布在C5?T1范圍內(nèi)，血海穴神經(jīng)纖維來自L3?4［8］。因此，出現(xiàn)電針不同穴位針效作用差異性是與該穴位經(jīng)絡(luò)腧穴功能及其所處位置的神經(jīng)節(jié)段支配有關(guān)。

隨著針刺作用機(jī)制研究的不斷深入，5?HT系統(tǒng)作為研究疼痛的靶點越來越受到人們的關(guān)注。5?HT是一種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，分布在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，研究證實5?HT2A受體參與疼痛產(chǎn)生或調(diào)制［9］。陳瑾等［10］發(fā)現(xiàn)，中樞及外周5?HT及2A受體不但參與針刺鎮(zhèn)痛的即時效應(yīng)，而且參與了較為顯著的后效應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，電針不同穴位可產(chǎn)生不同的鎮(zhèn)痛作用，由低至高依次為血海組＜合谷加三陰交組＜合谷組＜三陰交組，不同程度降低血清5?HT表達(dá)水平，提高了中樞5?HT、2A受體mRNA與蛋白表達(dá)。提示各穴位在痛閾值、外周及中樞5?HT表達(dá)，穴位間變化趨勢一致；而不同穴位針效作用以三陰交組較好，血海相對較差。穴位間出現(xiàn)的這種差異性，推測可能與該穴位所在的經(jīng)絡(luò)腧穴功效及其所處的神經(jīng)解剖學(xué)位置有關(guān)，由此揭示5?HT及2A受體參與電針穴位鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。本研究成果可為分娩鎮(zhèn)痛提供一種有效、操作簡單、對母嬰安全、無損傷的治療方法，為電針分娩鎮(zhèn)痛的進(jìn)一步研究提供了科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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Effects of Electric Acupuncture Acupoints for Childbirth Analgesia Rats and 5?HT mRNA and Protein Expression

JIANG Qiu?yan，WANG Mei?li，LI Li，LI Yan?ling，WANG Meng?ying
（First affiliated hospital of Guangxi TCM University，Nanning 530023，China）

Objective：To explore the analgesic effect of electric acupuncture on labor of pregnant rat，mRNA and protein of central 5?HT and receptor，Method：120 successful models of pregnant rats into control group，model group，Sanyinjiao group，Hegu group，Hegu plus Sanyinjiao group，Xuehai group，Meperidine group.observing the analgesic effect through hot flick method of measurement of pain.Detecting the serum 5?HT level by ELISA method，detect expression of the rat central 5?HT and receptor mRNA and Western blot by Real?time PCR.Results：Before treatment，the differences of pain threshold among the groups are not statistically significant（F＝0.736）；After treatment（F＝216.361），there were statistically significant differences between groups.Serum 5?HT，cerebral spinal 5?HT mRNA and protein 2A receptor，and，significant differences between the groups was statistically significant.Electrical Acupuncture from low to high were model group＜Xuehai group＜Hegu plus＋Sanyinjiao group＜Hegu group＜Sanyinjiao group＜Meperidine group.Varying degrees of reduction of serum expression levels of 5?HT.Improving and increasing the pain threshold of rat brain，spinal cord and the 5?HT 2A receptor mRNA and protein expression levels.Conclusion：Electrical Acupuncture needles have different effects and EA effect to vary degrees to reduce serum levels of 5?HT expression and improve the central 5?HT，2A receptor mRNA and protein expression associated reveals 5?HT 2A receptor is involved and EA acupuncture analgesia mechanism.

Electric acupuncture；Labor analgesia；5?HT 2A receptor；mRNA and protein expression

R245.9＋7

：B

：1006?3250（2016）10?1376?04

2016?03?10

2012年國家自然科學(xué)基金資助項目（81260547）?不同穴位電針對分娩疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)mRNA及蛋白表達(dá)影響的研究

蔣秋燕，女，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，從事針灸無痛分娩的臨床與研究。