瞬時(shí)受體電位C1對(duì)人卵巢癌細(xì)胞ES-2增殖和凋亡的影響

高蕾　郁蘭芳

314300 嘉興，浙江省海鹽縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(高蕾)；310003杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(郁蘭芳)

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瞬時(shí)受體電位C1對(duì)人卵巢癌細(xì)胞ES-2增殖和凋亡的影響

高蕾郁蘭芳

314300 嘉興，浙江省海鹽縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(高蕾)；310003杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(郁蘭芳)

【摘要】目的探討瞬時(shí)受體電位C1(TRPC1)對(duì)人卵巢癌細(xì)胞ES-2增殖和凋亡的影響。方法利用熒光定量PCR檢測(cè)人卵巢癌細(xì)胞ES-2、SKOV3、OV1以及OV2和正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80中TRPC1的表達(dá)水平。設(shè)計(jì)并合成靶向TRPC1的特異性短發(fā)卡RNA(shRNA)，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染TRPC1表達(dá)最高的人卵巢癌細(xì)胞ES-2以構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)TRPC1細(xì)胞株ES-2/shRNA，通過(guò)蛋白免疫印跡法和熒光定量PCR檢測(cè)shRNA的干擾效率、MTT比色法檢測(cè)干擾后細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況、蛋白免疫印跡法檢測(cè)磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)以及B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)的表達(dá)水平。結(jié)果在4種卵巢癌細(xì)胞株中，ES-2 的TRPC1表達(dá)水平最高。特異性靶向轉(zhuǎn)染TRPC1 shRNA能夠有效下調(diào)ES-2細(xì)胞中TRPC1表達(dá)水平；ES-2/shRNA細(xì)胞的增殖速度較轉(zhuǎn)染空白載體的ES-2/Con及ES-2細(xì)胞明顯減慢(P<0.01)。ES-2/shRNA細(xì)胞的凋亡率明顯高于ES-2/Con及ES-2細(xì)胞(P<0.01)。TRPC1干擾組細(xì)胞的p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2的蛋白表達(dá)強(qiáng)度比ES-2/Con及ES-2明顯減弱。結(jié)論采用RNA干擾技術(shù)能夠有效沉默ES-2細(xì)胞的TRPC1基因，并致使其細(xì)胞增殖能力下降以及細(xì)胞凋亡率升高，其中可能的機(jī)制為通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子PI3K的調(diào)控影響人卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

【關(guān)鍵詞】瞬時(shí)受體電位C1；增殖；凋亡；卵巢癌

在女性生殖器官惡性腫瘤中，卵巢癌發(fā)病率占第3位，然而病死率一直位居首位。究其原因，大多數(shù)卵巢癌發(fā)病隱匿，約75%的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于晚期。針對(duì)晚期卵巢癌，癌細(xì)胞減滅術(shù)加紫杉醇或鉑類聯(lián)合化學(xué)治療，能暫時(shí)緩解疾病進(jìn)展，但是腫瘤復(fù)發(fā)率卻在80%以上[1-4]。因此，迫切需要尋找卵巢癌的治療新方法。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，分子靶向治療已成為當(dāng)今卵巢癌防治研究的熱點(diǎn)。瞬時(shí)受體電位C1(TRPC1)是瞬時(shí)受體電位通道蛋白(TRP)家族中的一員，可通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流參與細(xì)胞多種生理及病理活動(dòng)。既往研究表明，TRP與多種腫瘤的發(fā)生及預(yù)后密切關(guān)聯(lián)[5-6]。本研究擬采用特異性靶向TRPC1的短發(fā)夾RNA(shRNA)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株ES-2，篩選并構(gòu)建低表達(dá)TRPC1的穩(wěn)定細(xì)胞株，通過(guò)對(duì)比轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組細(xì)胞，觀察TRPC1基因表達(dá)變化對(duì)ES-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步探討TRPC1在人卵巢癌細(xì)胞中的分子作用機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株ES-2、SKOV3、OV1以及OV2與正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE80購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。5株細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培基中，并置于5%CO2以及37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%用含依地酸二鈉(EDTA)的胰酶消化并傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二、TRPC1的特異性shRNA轉(zhuǎn)染

TRPC1 shRNA購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(Cat. sc-270467-SH)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，具體操作流程參照英韋創(chuàng)津公司的Lipofectamine2000產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染48 h后加入篩選抗生素G418，濃度為400 μg/ml，維持培養(yǎng)6 d后，G418濃度改為200 μg/ml；細(xì)胞擴(kuò)增后，提取蛋白和RNA，進(jìn)行熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法鑒定。

三、TRPC1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

采用熒光定量PCR法檢測(cè)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，用Trizol提取總RNA，計(jì)算各組RNA濃度和純度，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃反應(yīng)60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min。熒光定量PCR：將反應(yīng)管置入ABI7500系統(tǒng)中，設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)。引物序列如下： TRPC1上游5’-GATGTGCTTGGGA-GAAATGC-3’，下游5’-CAAGACGAAACCTGGAATGC-3’，長(zhǎng)度232 bp； 內(nèi)參GAPDH上游5’- ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’， 下游5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，長(zhǎng)度452 bp。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、TRPC1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)。TRPC1、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)以及GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam公司。提取細(xì)胞總蛋白后，采用BCA法定量計(jì)算總蛋白濃度，蛋白質(zhì)凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，加入第一抗體(TRPC1、p-PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2)，4℃孵育過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)并進(jìn)行灰度分析。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

五、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRPC1特異性shRNA的ES-2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2細(xì)胞分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白對(duì)照孔(不加shRNA，僅加培養(yǎng)基)，分別培養(yǎng)24、48、72 h。用MTT法檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處各個(gè)小孔的光密度(OD)值， 并繪制生長(zhǎng)曲線。

六、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

ES-2/shRNA、ES-2/Con及ES-2細(xì)胞分別接種于6孔板的小孔中：棄RPMI1640培養(yǎng)基，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，收集于小離心管中，低速離心5 min，棄上清液。按Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，完成后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、細(xì)胞TRPC1 mRNA表達(dá)水平

相對(duì)于正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80(設(shè)定為1)，4株人卵巢癌細(xì)胞(ES-2、SKOV3、OV1以及OV2細(xì)胞)的TRPC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為5.02±0.08、3.23±0.05、1.78±0.08、2.13±0.04，見(jiàn)圖1。因ES-2的TRPC1 mRNA表達(dá)水平最高，故選擇ES-2作為研究對(duì)象進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1　TRPC1 mRNA在4株人卵巢癌細(xì)胞和1株正常卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平

二、特異性靶向TRPC1 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES-2細(xì)胞后TRPC1的表達(dá)

特異性靶向TRPC1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ES-2細(xì)胞后，使用PCR及蛋白免疫印跡法驗(yàn)證沉默效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TRPC1 shRNA的ES-2細(xì)胞(ES-2/shRNA)、轉(zhuǎn)染空載體的ES-2細(xì)胞(ES-2/Con)、未轉(zhuǎn)染的ES-2細(xì)胞間TRPC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F分別為48.374、42.542，P均<0.001)；與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空載體的ES-2細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染TRPC1 shRNA的ES-2細(xì)胞mRNA(t分別為10.453、9.649，P均<0.01,圖2B)及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(t分別為9.488、8.845，P均<0.01,圖2C)。

圖2　shRNA明顯抑制ES-2細(xì)胞的TRPC1表達(dá)

A：蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果；B：mRNA定量結(jié)果；C：蛋白定量結(jié)果；與ES-2及ES-2/Con細(xì)胞比較，**P<0.01

三、TRPC1基因沉默對(duì)ES-2細(xì)胞增殖能力的影響

ES-2/shRNA、ES-2/Con、ES-2的增殖速度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.251，P<0.001)，ES-2/shRNA細(xì)胞的增殖速度比ES-2/Con及ES-2細(xì)胞明顯減慢(F分別為48.857、37.413，P均<0.001)，ES-2/Con與ES-2細(xì)胞的增殖速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.645，P=0.481)，見(jiàn)圖3。

圖3　TRPC1對(duì)ES-2細(xì)胞體外增殖能力的影響

四、TRPC1基因沉默對(duì)ES-2細(xì)胞凋亡的影響

ES-2、ES-2/Con和ES-2/shRNA細(xì)胞的凋亡率分別為(17.2±3.4)%、(18.3±2.5)%，(34.1±4.7)%，3組細(xì)胞的凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.220，P<0.001)。ES-2/shRNA細(xì)胞凋亡率明顯高于ES-2及ES-2/Con細(xì)胞(t分別為5.046、5.141，P均<0.01)。ES-2細(xì)胞凋亡率與ES-2/Con細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.451，P=0.675)，見(jiàn)圖4。

五、TRPC1基因沉默對(duì)ES-2細(xì)胞的PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表達(dá)強(qiáng)度的影響

ES-2/shRNA細(xì)胞的Cyclin D1、Bcl-2、p-PI3K的表達(dá)均較ES-2和ES-2/Con細(xì)胞減弱,見(jiàn)圖5。

討論

卵巢癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤。由于卵巢癌早期缺少癥狀，癥狀缺乏特異性，篩查的作用有限，因此早期診斷比較困難， 多數(shù)患者在就診時(shí)已為晚期，而晚期病例的療效欠佳。因此，卵巢癌的早期診斷顯得非常重要[7]。鈣離子是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中重要的第二信使，細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡的紊亂參與腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，如腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲和分化,是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的重要因素[8]。TRP可通過(guò)介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。TRPC1是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道，已被證實(shí)在前列腺癌、肺癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，并預(yù)示預(yù)后較差[9-12]。本研究表明，在人卵巢癌細(xì)胞中，TRPC1表達(dá)升高；通過(guò)RNA干擾法成功構(gòu)建TRPC1低表達(dá)的ES-2細(xì)胞株后，發(fā)現(xiàn)ES-2/shRNA細(xì)胞的增殖能力較ES-2/Con和ES-2細(xì)胞下降。此外，ES-2/shRNA細(xì)胞的凋亡率比ES-2/Con和ES-2細(xì)胞升高。由此推測(cè)，TRPC1可能是卵巢癌的促癌基因。

圖4　TRPC1對(duì)ES-2細(xì)胞凋亡率的影響

圖5　TRPC1對(duì)ES-2細(xì)胞中PI3K、Cyclin D1以及Bcl-2表達(dá)的影響

PI3K/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)通路已被證實(shí)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。PI3K作為PI3K/AKT通路中重要的調(diào)節(jié)因子，其在腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[13-14]。一方面，PI3K對(duì)Cyclin D1有著間接調(diào)節(jié)作用，其磷酸化之后可活化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)從而增加Cyclin D1 mRNA翻譯，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；另一方面，PI3K磷酸化后活化AKT能夠直接磷酸化促凋亡分子BAD，而磷酸化的BAD與Bcl-2發(fā)生結(jié)聚，從而使游離的Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用；此外，PI3K還能通過(guò)磷酸化forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制凋亡相關(guān)基因如Fas-L、IGFBP1和Bim的轉(zhuǎn)錄[15]。因此，我們推測(cè)TRPC1調(diào)控人卵巢癌細(xì)胞的增殖以及凋亡可能與PI3K/AKT通路相關(guān)。

為了驗(yàn)證以上猜測(cè)，本研究檢測(cè)了人卵巢癌細(xì)胞ES-2細(xì)胞在TRPC1下調(diào)后，p-PI3K、CyclinD1以及Bcl-2的表達(dá)水平均比2個(gè)對(duì)照組明顯下降。提示了TRPC1調(diào)節(jié)人卵巢癌細(xì)胞的惡性行為的部分機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控，從而調(diào)節(jié)增殖以及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平。然而值得注意的是，腫瘤發(fā)生、發(fā)展與多條信號(hào)通路相關(guān)，且這些信號(hào)通路之間可能還存在著交叉作用，下一步我們將對(duì)TRPC1在卵巢癌中的分子機(jī)制進(jìn)行更全面及深入的研究。

綜上所述，本研究探討了TRPC1對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)TRPC1可通過(guò)活化PI3K等因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及抑制其凋亡。這為進(jìn)一步揭示TRPC1基因與卵巢癌的關(guān)系提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，更為進(jìn)一步探索卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的思路。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of TRPC1 on proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell ES-2

GaoLei,YuLanfang.

DepartmentofGynaecology&Obstetrics,HaiyanPeople’sHospital,Jiaxing314300,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) upon the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cell ES-2. MethodsThe expression levels of TRPC1 in human ovarian carcinoma cell ES-2, SKOV3, OV1 and OV2, and normal human ovarian epithelial cell ISOE80 were detected by fluorescent quantitative PCR. Specific short hairpin RNA (shRNA) targeting TRPC1 was designed, synthesized, and then transfected into the ES-2 cells with the highest expression of TRPC1 via liposome to construct ES-2/shRNA cell line stably and lowly expressing TRPC1. The interfering efficiency of shRNA was validated by western blot and fluorescent quantitative PCR. The proliferation and apoptosis of ES-2 were detected by using MTT assay and flow cytometry. The expression levels of phosphatidylinositol 3-kinase (p-PI3K), Cyclin D1 and B-cell lymphoma (Bcl-2) were measured by western blot. ResultsAmong four human ovarian carcinoma cell lines, ES-2 expressed the highest level of TRPC1. TRPC1-targeted shRNA could effectively down-regulate the expression level of TRPC1 in ES-2 cells. Compared with those of ES-2/Con and ES-2, the proliferation rate of ES-2/shRNA was significantly lower (P<0.01) whereas the apoptosis rate was considerably higher(P<0.01). The expression levels of p-PI3K, Cyclin D1 and Bcl-2 in the shRNA interference group were significantly down-regulated compared with those in the ES-2/Con and ES-2 cells. ConclusionsRNA interference technique can effectively silence the TRPC1 in ES-2 cells, decrease cell proliferation ability and enhance cell apoptosis, probably by regulating cytokine PI3K to affect the proliferation and apoptosis of human ovarian carcinoma cells.

【Key words】Transient receptor potential channel 1; Proliferation; Apoptosis; Ovarian carcinoma

(收稿日期：2015-08-02)

Corresponding author, Yu Lanfang

通訊作者，郁蘭芳

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.008

·基礎(chǔ)研究論著·