解凍后囊胚形態(tài)學(xué)評分對復(fù)蘇單囊胚人工周期移植臨床妊娠的影響

李為玉　陳攀宇　方叢　梁曉燕

510610 廣州，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

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解凍后囊胚形態(tài)學(xué)評分對復(fù)蘇單囊胚人工周期移植臨床妊娠的影響

李為玉陳攀宇方叢梁曉燕

510610 廣州，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心

【摘要】目的分析在玻璃化冷凍復(fù)蘇單囊胚移植周期中，解凍后囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量對臨床妊娠的影響。方法收集1 005例第一周期復(fù)蘇單囊胚移植的資料，進(jìn)行囊胚擴(kuò)張、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞評分，采用二分類Logistic回歸(Enter法)分析，評估3項(xiàng)評分及年齡對臨床妊娠的影響。結(jié)果解凍后第5日單囊胚(D5)移植組、第6日單囊胚(D6)移植組的臨床妊娠率分別為54.61%、38.49%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，D5移植組女方年齡低于D6組(P<0.01)；D5單囊胚解凍后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分低和年齡大是臨床妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素(OR=1.733，95%CI：1.213~2.475；OR=0.938, 95%CI：0.906~0.972，P均<0.001)，囊胚擴(kuò)張程度及滋養(yǎng)細(xì)胞與妊娠結(jié)局無關(guān)(P均>0.05)；D6囊胚解凍移植中妊娠與非妊娠組的囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞均與妊娠結(jié)局無關(guān)。結(jié)論在進(jìn)行冷凍復(fù)蘇單囊胚移植時(shí)，D5囊胚優(yōu)先考慮內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】單囊胚移植；冷凍復(fù)蘇胚胎移植；形態(tài)學(xué)評分；內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；滋養(yǎng)層細(xì)胞

Morphological scoring; Inner cell mass;Trophectoderm

隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)的飛躍發(fā)展以及治療經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，多胎妊娠發(fā)生率不斷升高，單胚胎移植已成為國內(nèi)外專家的共識[1-2]。囊胚培養(yǎng)有利于挑選發(fā)育潛能較高的胚胎[3]。其中如何挑選囊胚進(jìn)行單胚胎移植成為臨床的關(guān)鍵。囊胚質(zhì)量有3項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)：胚胎擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量[4]。當(dāng)這3項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)妊娠率最高，然而每一項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測妊娠結(jié)局的能力仍不清楚。有研究認(rèn)為胚胎發(fā)育和擴(kuò)張等級是預(yù)測種植成功與否的重要指標(biāo)[5-6]。Shapiro等[7]認(rèn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量與種植率相關(guān)，Gardner等[8]認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量與種植率呈正相關(guān)。本研究回顧分析了本中心1 005例玻璃化冷凍復(fù)蘇第一周期單囊胚移植的臨床妊娠結(jié)果，探討臨床妊娠結(jié)局與囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量的相關(guān)性，以期更好地指導(dǎo)臨床工作。

材料與方法

一、研究對象

2010年6月至2015年4月在我中心第一周期行冷凍復(fù)蘇單囊胚移植1 005例。其中第5日單囊胚(D5)移植727周期(D5移植組)，第6日單囊胚(D6)移植278周期(D6移植組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者既往無冷凍移植周期，此次為第一周期復(fù)蘇單囊胚移植；②女方年齡小于或等于45歲；③已使用激素替代治療(HRT)周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備。排除標(biāo)準(zhǔn)：有子宮腺肌癥、宮腔粘連、移植日子宮內(nèi)膜小于7 mm者。

二、方　法

1. 囊胚培養(yǎng)及囊胚評分

常規(guī)體外受精或單精子胞漿內(nèi)注射受精(ICSI)，受精后第3日將符合囊胚培養(yǎng)評分標(biāo)準(zhǔn)的胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)基(G5 series，瑞典)行囊胚培養(yǎng)[9]。第5、6日觀察胚胎并按照Gardner評分系統(tǒng)對胚胎擴(kuò)張進(jìn)行評分：根據(jù)囊腔擴(kuò)張程度進(jìn)行分期，囊腔小于胚胎體積的50%為1期，超過50%為2期，占滿整個(gè)胚胎為3期，囊腔擴(kuò)張、透明帶變薄為4期，囊胚開始從透明帶里孵出為5期，囊胚完全孵出為6期[10]。對處于3~6期的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層進(jìn)行評分：①內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分，細(xì)胞數(shù)量多且分布緊密為A、細(xì)胞數(shù)量較少且分布松散為B、細(xì)胞數(shù)量極少則為C；②滋養(yǎng)外胚層評分，較多的細(xì)胞形成連接緊密的上皮層為A、較少的細(xì)胞連接松散為B、細(xì)胞少且體積大為C。以A為高、B為中、C為低。本中心胚胎冷凍的標(biāo)準(zhǔn)為：D5評分達(dá)3BB及以上的進(jìn)行冷凍，若第5日未達(dá)以上標(biāo)準(zhǔn)，則繼續(xù)培養(yǎng)至第6日再按照以上標(biāo)準(zhǔn)冷凍。當(dāng)患者無符合3BB以上標(biāo)準(zhǔn)的囊胚時(shí)，經(jīng)告知后并簽署知情同意書后對次級胚胎進(jìn)行冷凍。

2. 囊胚的冷凍與復(fù)蘇

冷凍、復(fù)蘇囊胚采用本中心常規(guī)玻璃化冷凍及復(fù)蘇方法操作，囊胚在冷凍復(fù)蘇后采用激光系統(tǒng)( ZILOS-tk Laser Zona Drill System，美國Hamilton Thorn Bioscience)進(jìn)行輔助孵化，體外培養(yǎng)2～3 h后進(jìn)行胚胎移植。

3.內(nèi)膜準(zhǔn)備

采用HRT準(zhǔn)備內(nèi)膜，自月經(jīng)第3日開始使用戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳)，根據(jù)內(nèi)膜生長情況調(diào)整用量。內(nèi)膜達(dá)到7 mm及以上且雌激素作用時(shí)間不少于10 d時(shí)開始肌內(nèi)注射黃體酮40 mg/d，黃體酮注射后的第5日或第6日進(jìn)行移植。

4.妊娠結(jié)局評價(jià)

移植后12日測血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)，若β-HCG> 50 U/L，則定義為妊娠。妊娠陽性者移植35 d后行陰道B超，見孕囊為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、D5、D6移植組的一般情況及移植結(jié)局比較

根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選出1 005個(gè)周期。D5、D6移植組患者不孕年限、不孕類型、BMI、移植日子宮內(nèi)膜厚度、胚胎復(fù)蘇率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與D6移植組相比，D5移植組患者年齡較低、臨床妊娠率較高(P均<0.01)，見表1。

二、D5、D6復(fù)蘇囊胚評分與臨床妊娠關(guān)系分析

D6復(fù)蘇囊胚的妊娠與非妊娠組間年齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2組間胚胎擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。D5復(fù)蘇囊胚的妊娠與非妊娠組間的胚胎擴(kuò)張程度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組間內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞和年齡比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。Logistic回歸分析(賦值：妊娠=1；非妊娠=0)發(fā)現(xiàn)低內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分對臨床妊娠的OR值最高(1.733，95%CI：1.213～2.475，P<0.01)，年齡大也是臨床妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素(OR=0.938，95%CI：0.906～0.972)，而滋養(yǎng)細(xì)胞及胚胎擴(kuò)張程度與臨床妊娠結(jié)局無關(guān)(P均>0.05)，見表3。

表1　D5、D6移植組的一般情況及妊娠結(jié)局比較

注：胚胎復(fù)蘇率=復(fù)蘇胚胎數(shù)/解凍胚胎數(shù)

表2　D5、D6移植組囊胚評分與臨床妊娠結(jié)局的單因素分析

表3　D5移植組囊胚評分與臨床妊娠結(jié)局的多因素分析

討論

研究發(fā)現(xiàn)，在25~37歲患者中單囊胚與雙囊胚移植后妊娠率分別為73.8%、77.5%，活產(chǎn)率分別為59.0%、60.7%，而后者雙胎率高達(dá)47.6%[11]。多胎妊娠會導(dǎo)致一系列的產(chǎn)科并發(fā)癥，如早產(chǎn)、流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等[12]。具有較高發(fā)育潛能的優(yōu)質(zhì)單囊胚在保證妊娠率的同時(shí)可有效降低雙胎妊娠率，降低了產(chǎn)婦與圍生兒的危險(xiǎn)。我中心第一周期復(fù)蘇單囊胚移植1 005周期數(shù)據(jù)顯示，臨床妊娠率為50.15%(504/1 005)。

囊胚的選擇是單胚胎移植技術(shù)的關(guān)鍵，現(xiàn)階段國內(nèi)普遍采用囊胚Gardner形態(tài)學(xué)評分這一經(jīng)典方法。胚胎擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞這三者之間具有相對獨(dú)立性，移植時(shí)給囊胚選擇帶來困惑[13]。Honnma等[14]對1 087例冷凍復(fù)蘇第一周期單囊胚移植進(jìn)行分析，認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞與繼續(xù)妊娠率有關(guān)，而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及胚胎擴(kuò)張程度對繼續(xù)妊娠率沒有影響，考慮以后發(fā)育為胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞在著床過程中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)胎盤分泌HCG介導(dǎo)母胎界面的免疫抑制，為胚胎的繼續(xù)發(fā)育提供保障，所以滋養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)量對臨床妊娠有重要的預(yù)測作用。Kovacic等[15]對1 396個(gè)囊胚和桑椹胚分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與植入潛能相關(guān)性最大，Takahashi等[16-18]也有相似的結(jié)論，認(rèn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將來發(fā)育成為胎兒，是妊娠的關(guān)鍵因素，胎兒的異常直接影響滋養(yǎng)層細(xì)胞功能以及胚胎發(fā)育速度，由此認(rèn)為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)比滋養(yǎng)細(xì)胞層和胚胎擴(kuò)張程度有更重要的意義。本中心數(shù)據(jù)顯示，1 005周期冷凍復(fù)蘇第一周期單囊胚移植中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞及年齡與臨床妊娠率均有相關(guān)，囊胚擴(kuò)張程度與妊娠率沒有相關(guān)性，這與Kovacic和Takahashi等報(bào)道一致。根據(jù)胚胎發(fā)育天數(shù)分為D5和D6，分別對兩亞組分析，數(shù)據(jù)顯示在D5單囊胚解凍后內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分低、年齡大均是臨床妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，滋養(yǎng)細(xì)胞及囊胚擴(kuò)張程度與妊娠結(jié)局無關(guān)，D6囊胚解凍移植中妊娠組與非妊娠組的囊胚擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、滋養(yǎng)細(xì)胞比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明D6單囊胚妊娠結(jié)局除胚胎形態(tài)學(xué)評分之外仍有其他重要的影響因素，但不排除由于樣本量較少而得不到有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)在冷凍復(fù)蘇第一周期單囊胚移植中，D5囊胚移植的臨床妊娠率顯著高于D6囊胚，這與李城等[19]的報(bào)道一致。

綜上所述，第一周期解凍后D5內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分以及患者年齡升高是影響臨床妊娠率的危險(xiǎn)因素，其中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評分低的相對風(fēng)險(xiǎn)值更高，提示我們在進(jìn)行冷凍復(fù)蘇單囊胚移植時(shí)，對于D5胚胎優(yōu)先考慮內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量。

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(本文編輯：林燕薇)

Effect of blastocyst morphological scoring on clinical pregnancy in single frozen-thawed blastocyst transfer cycles

LiWeiyu,ChenPanyu,FangCong,LiangXiaoyan.

ReproductiveCenter，theSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity，Guangzhou510610，China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of embryo expansion, inner cell mass and trophectoderm quality on clinical pregnancyduringsingle frozen-thawed blastocyst transfer cycles. MethodsA total of 1 005 cycles of single blastocyst transfer were collected for grading of embryo expansion, inner cell mass and trophectoderm scoring.Binary logistic regression was utilized to assess the effect of these morphological scores on clinical pregnancy. ResultsClinical pregnancy rate in the embryo at 5 d aftersingle embryo transfer (D5) was 54.61%, significantly higher compared with 38.49% in the D6 (P<0.01). The age of patients in the D5 transfer group weresignificantly younger than those in the D6 group (P<0.01). Low-inner cell mass scoring and high-age were risk factors of clinical pregnancy in D5 single frozen-thawed balstocyst transfer (OR=1.733，95%CI: 1.213~2.475; OR=0.938, 95%CI: 0.906~0.972，both P<0.001), whereas embryo expansion and trophectoderm were not correlated with clinical pregnancy (both P>0.05). Embryo expansion, inner cell mass and trophectoderm scoringwere not associated with clinical pregnancy in D6 single blastocyst transferbetween pregnant and non-pregnant groups. ConclusionIn D5 frozen-thawed single blastocyst transfer, inner cell mass scoring should be emphasized.

【Key words】Single blastocyst transfer;Frozen-thawed embryo transfer;

(收稿日期：2015-11-20)

Corresponding author，F(xiàn)ang Cong，E-mail: fangconggd@163. com

通訊作者，方叢， E-mail: fangconggd@foxmail.com

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(s20130100113404)

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.012

·臨床研究論著·