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    β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的作用

    2016-03-24 11:09:23蔣夢萍禤婕瀅徐春羅千江尉秀清
    新醫(yī)學(xué) 2016年2期
    關(guān)鍵詞:信號通路

    蔣夢萍 禤婕瀅 徐春 羅千江 尉秀清

    510630 廣州,中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科

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    β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的作用

    蔣夢萍禤婕瀅徐春羅千江尉秀清

    510630 廣州,中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科

    【摘要】目的探討β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的作用機制。方法建立內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷模型,將β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窩β-arrestin2野生型(WT)小鼠20只分別隨機分成實驗組及對照組(n=10),實驗組腹腔內(nèi)注射脂多糖(5 mg/kg),而對照組注射等量生理鹽水,6 h后留小鼠血清和肝臟組織標(biāo)本。實時定量PCR檢測小鼠體內(nèi) β-arrestin2表達量,ELISA檢測各組小鼠血清中ALT、AST及TNF-α水平,蛋白免疫印跡法檢測各組β-arrestin2、p-p65及p-IкBα蛋白的表達。結(jié)果β-arrestin2 WT 實驗組肝臟組織中 β-arrestin2 mRNA為0.18±0.06,明顯低于正常對照組的1.00±0.29(t=-4.669,P<0.001),β-arrestin2蛋白表達也明顯低于WT對照組;β-arrestin2 KO實驗組血清ALT為(204.33±22.33) U/L、AST為(403.40±53.45) U/L,明顯高于β-arrestin2 WT實驗組ALT的(129.33±9.69)U/L和AST(256.20±40.47) U/L(t=7.55、6.94,P均<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組血清TNF-α為(155.89±14.89)pg/L,明顯高于WT實驗組的(101.36±10.65)pg/L(t=9.25,P<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組肝臟組織中p-IкBα及p-p65的蛋白表達量明顯高于β-arrestin2 WT實驗組。結(jié)論β-arrestin2可能通過抑制NF-κB活化、減少TNT-α釋放從而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中起保護作用。

    【關(guān)鍵詞】內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷;β-arrestin2;TLR4/NF-кB/TNF-α信號通路

    內(nèi)毒素本質(zhì)是革蘭陰性細菌細胞壁上的脂多糖,當(dāng)細菌裂解或其黏附在其他細胞上時脂多糖可釋放出來。脂多糖是機體內(nèi)誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要致病成分。肝臟既是清除內(nèi)毒素的場所,也是內(nèi)毒素血癥過程中最易受損的器官之一。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是多種肝病的主要病理基礎(chǔ)[1-2]?,F(xiàn)有的大量研究表明,肝臟枯否細胞內(nèi)激活多種信號通路誘發(fā)的炎癥反應(yīng)是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷的關(guān)鍵機制[3]。β-arrestin2是Arrestins家族中成員之一,廣泛表達于哺乳動物的各種組織細胞中,尤其是免疫系統(tǒng);β-arrestin2可作為負調(diào)控因子介導(dǎo)受體脫敏和內(nèi)吞[4]。除此之外,β-arrestin2可作為“鷹架”蛋白,參與多種信號通路[5-6]。本研究旨在觀察β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中的生物學(xué)作用,并探討其可能的作用機制。

    材料與方法

    一、 實驗動物

    C57BL/6J背景的β-arrestin2+/-雌雄配對小鼠由美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Robert J.Lefkowitz教授饋贈,在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院疫苗研究所動物中心按SPF級培育,該動物實驗獲得該院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

    二、 實驗試劑和儀器

    1.主要實驗試劑及抗體

    脂多糖(Sigma,US),ALT試劑盒(Cusabio,武漢),AST試劑盒(Cusabio,武漢),TNF-α ELISA試劑盒(Cusabio,武漢),蛋白質(zhì)定量試劑盒(Genstar,北京),組織RNA提取試劑盒(Magen,北京),qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO,上海),30%丙烯酰胺(BIO-RAD, US),過硫酸鈉(BIO-RAD,US),TEMED(BIO-RAD,US),β-arrestin2抗體(美國杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Robert J.Lefkowitz教授饋贈),p-p65抗體(Cell Signaling Technology,US),p65(Santa Cruz,US),p-IкBα(Santa Cruz, US),IкBα(Santa Cruz, US),GAPDH(Santa Cruz,US)等。

    2.主要儀器

    低溫高速冷凍離心機(Eppendorf公司,Germany),SDS-PAGE電泳槽(BIO-RAD,US),轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD,US),PCR儀(Labnet,US),Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(Thermo Scientific,US)等。

    三、實驗方法

    1.內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷模型建立

    選取6~8周齡(22~25 g)的雄性β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窩來源的β-arrestin2野生型(WT)雄性小鼠20只,分別將它們隨機分成實驗組和對照組,每組10只。實驗組小鼠腹腔注射5 mg/kg脂多糖,對照組小鼠注射等量的生理鹽水。

    2.標(biāo)本采集與處理

    6 h后,10%水合氯醛麻醉后行開腹手術(shù),腹腔下靜脈取血,迅速取肝臟組織,將部分肝臟組織放入10%中性福爾馬林中固定制作石蠟標(biāo)本,剩余部分保存于液氮中,待提取蛋白質(zhì)或RNA;血漿在室溫靜置1 h后離心留血清保存于-80℃。

    3.ELISA檢測ALT、AST及TNF-α水平

    根據(jù)各試劑盒說明書,檢測各組血清中ALT、AST及TNF-α水平。

    4.肝臟組織RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄

    取適量肝臟組織,按組織RNA提取試劑盒說明書進行提取RNA,并用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計測定RNA濃度及純度,再根據(jù)qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

    5.肝臟組織蛋白提取及蛋白質(zhì)電泳

    取適量肝臟組織,按蛋白質(zhì)提取裂解液說明書提取組織總蛋白,并用BCA法檢測蛋白濃度。分裝蛋白并進行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)、封閉后,用相應(yīng)目的蛋白的抗體孵育,4℃冰箱搖床過夜,其中對總蛋白分別用抗β-arrestin2、p-p65、p65、p-IкBα、IкBα的一抗孵育。次日復(fù)溫30 min后,HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h,暗房曝光。

    四、統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié)果

    一、 β-arrestin2 WT小鼠在腹腔注射脂多糖后實驗組與對照組肝臟組織中β-arrestin2水平比較

    腹腔注射脂多糖 6 h后觀察,實驗組小鼠均活動減弱,體毛寒立,蜷曲姿勢,眼睛可見膿性分泌物,解剖時見肝臟腫脹較對照組略大。通過提取肝臟組織RNA,再檢測β-arrestin2的表達量,實驗發(fā)現(xiàn)β-arrestin2 WT小鼠腹腔注射脂多糖后肝臟組織中β-arrestin2 mRNA表達量0.18±0.06,對照組1.00±0.29,實驗組比對照組低,此差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.669,P<0.001,圖1A)。進一步提取肝臟組織蛋白,通過蛋白免疫印跡法檢測,發(fā)現(xiàn)小鼠在腹腔注射脂多糖后肝臟組織中β-arrestin2蛋白水平也明顯下降(圖1B)。

    圖1 β-arrestin2 WT小鼠注射脂多糖6 h后肝臟組織中β-arrestin2水平變化

    A:β-arrestin2 WT實驗組與對照組肝臟β-arrestin2 mRNA水平比較,*P<0.05;B:蛋白免疫印跡電泳圖β-arrestin2 KO小鼠注射脂多糖后肝臟損傷加重

    β-arrestin2 KO實驗組的ALT、AST高于β-arrestin2 WT實驗組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.55,P<0.001;t=6.94,P<0.001)。β-arrestin2 KO實驗組血清TNF-α為(155.89±14.89)pg/L,而其β-arrestin2 WT實驗組血清中TNF-α為(101.36±10.65)pg/L,前者分泌更多TNF-α(t=9.25,P<0.001),見表1。

    表1 各組小鼠肝臟損傷情況比較

    注:與β-arrestin2 KO對照組比較,aP<0.01;與β-arrestin2 WT實驗組比較,bP<0.01;與β-arrestin2 WT對照組比較,cP<0.01

    二、 β-arrestin2 WT組和KO組注射脂多糖6 h后肝臟損傷指標(biāo)比較

    比較β-arrestin2 WT實驗組與β-arrestin2 KO實驗組的肝臟組織中p-IкBα及p-p65蛋白的表達量,我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin2 KO實驗組高于β-arrestin2 WT 實驗組(圖2)。

    討論

    有關(guān)肝臟損傷的研究仍是生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一,而其中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是許多其他肝臟疾病的主要病理基礎(chǔ)。大量研究表明,肝臟枯否細胞是肝臟內(nèi)產(chǎn)生炎癥遞質(zhì)的主要來源,它是機體防御內(nèi)源性、外源性感染的重要效應(yīng)細胞。脂多糖的受體是Toll樣受體4(TLR4),它在枯否細胞的細胞膜上大量表達,當(dāng)脂多糖與其受體TLR4結(jié)合后可引發(fā)枯否細胞內(nèi)一系列的信號通路激活從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[7]。激活后的枯否細胞可釋放多種炎癥介質(zhì),間接作用于肝細胞從而引起肝細胞的壞死、凋亡和損傷[8]。其中,TLR4/NF-кB 信號通路激活是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷的重要機制之一,TNF-α一方面誘導(dǎo)中性粒細胞在肝內(nèi)聚集,另一方面又可誘導(dǎo)激活肝內(nèi)凝血系統(tǒng),進一步加重肝臟損傷。

    圖2 β-arrestin2 WT實驗組與β-arrestin2 KO實驗組肝臟組織中p-IкBα及p-p65蛋白表達水平比較

    β-arrestin2最早被發(fā)現(xiàn)是作為G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的重要負性調(diào)節(jié)因子,可介導(dǎo)細胞膜表面多種受體的脫敏和內(nèi)吞作用。實際上,β-arrestin2是一種多功能“鷹架”蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin2可以與IкBα 結(jié)合進一步干擾IкBα的磷酸化、降解和抑制NF-кB活化。另外有研究指出,在脂多糖或IL-1β刺激下,β-arrestins能直接結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)而阻止后者的寡聚化和泛素化。TRAF6和IкBα都是TLR4/NF-кB 信號通路中重要的信號分子;我們以此推測β-arrestin2可以負性調(diào)控TLR4/NF-кB 信號通路。在本實驗中,我們的結(jié)果顯示β-arrestin2 WT小鼠在腹腔內(nèi)注射脂多糖(5 mg/kg)6 h后,肝臟組織β-arrestin 2 mRNA和蛋白表達均明顯下降;接著我們發(fā)現(xiàn)β-arrestin2 KO實驗組的炎癥因子表達量高于β-arrestin2 WT實驗組,而且前者的血清ALT、AST和TNF-α含量都高于后者,這說明了β-arrestin2 KO實驗組的肝臟損傷情況比β-arrestin2 WT實驗組的嚴(yán)重。β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中起保護作用,在肝臟損傷過程,β-arrestin2表達受到抑制,進而內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)更加強烈。同時,我們的結(jié)果分析提示了β-arrestin2起保護作用的機制可能與抑制NF-кB 磷酸化和核內(nèi)移、減少TNF-α釋放有關(guān)。

    綜上所述,β-arrestin2在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷中起保護作用,其機制可能是抑制了NF-кB活化,減少促炎因子TNF-α釋放,進而抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)放大,但具體的分子機制尚需進一步深入研究。

    參考文獻

    [1]Enomoto N, Ikejima K, Bradford BU, Rivera CA, Kono H, Goto M, Yamashina S, Schemmer P, Kitamura T, Oide H, Takei Y, Hirose M, Shimizu H, Miyazaki A, Brenner DA, Sato N, Thurman RG. Role of Kupffer cells and gut-derived endotoxins in alcoholic liver injury. J Gastroenterol Hepatol, 2000, 15(Suppl): D20-D25.

    [2]Kudo H, Takahara T, Yata Y, Kawai K, Zhang W, Sugiyama T. Lipopolysaccharide triggered TNF-alpha-induced hepatocyte apoptosis in a murine non-alcoholic steatohepatitis model. J Hepatol, 2009, 51(1):168-175.

    [3]Li JD, Peng Y, Li Q, Xiao JW, Gong JP, Liu ZJ. Potential protective effect of nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotides on endotoxin-induced liver injury. Transplant Proc, 2011, 43(10):3613-3617.

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    [6]DeWire SM, Ahn S, Lefkowitz RJ, Shenoy SK. Beta-arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol, 2007, 69:483-510.

    [7]何卉欣,蔣夢萍,劉慧玲,江潔,尉秀清.阻斷TLR4信號通路對結(jié)腸癌細胞CT26裸鼠種植瘤生長和凋亡的影響.新醫(yī)學(xué),2015,46(4):216-220.

    [8]Hoque R, Farooq A, Ghani A, Gorelick F, Mehal WZ. Lactate reduces liver and pancreatic injury in Toll-like receptor-and inflammasome-mediated inflammation via GPR81-mediated suppression of innate immunity. Gastroenterology, 2014, 146(7):1763-1774.

    (本文編輯:楊江瑜)

    Effect of β-arrestin2 in endotoxin-induced liver injury

    JiangMengping,XuanJieying,XuChun,LuoQianjiang,WeiXiuqing.

    DepartmentofGastroenterology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China

    【Abstract】ObjectiveTo investigate the mechanism of the function of β-arrestin2 in the endotoxin-induced liver injury. MethodsEndotoxin-induced liver injury mouse models were established. Twenty β-arrestin2 knockout (KO) mice and twenty β-arrestin2 wild-type (WT) littermates were randomly divided into the experimental and control groups(n=10). In the experimental group, liver injury was induced by intraperitoneal injection of 5 mg/kg of lipopolysaccharide, and the control mice were administered with an equivalent quantity of normal saline. Six hours later, serum sampling and liver tissue were collected. The expression of β-arrestin2 in the mouse liver was measured by quantitative real-time PCR. The serum levels of ALT, AST and TNF-α were detected by ELISA. The expression of β-arrestin2, p-p65 and p-IкBα proteins was determined by Western blot. ResultsThe expression level of β-arrestin2 mRNA in the β-arrestin2 WT group was 0.18±0.06, significantly lower than 1.00±0.29 in the control group (t=-4.669, P<0.001). The expression of β-arrestin2 protein was also obviously down-regulated. In the β-arrestin2 KO group, the values of ALT and AST were (204.33±22.33)U/L and (403.40±53.45)U/L, significantly higher compared with (129.33±9.69)U/L and (256.20±40.47) in the β-arrestin2 WT group (t=7.55, P<0.001; t=6.94, P<0.001). The serum level of TNF-α in the β-arrestin2 KO group was (155.89±14.89) pg/L, significantly higher than (101.36±10.65) pg/L in the β-arrestin2 WT group (t=9.25,P<0.001). In the β-arrestin2 KO group, the expression of p-IкBα and p-p65 proteins within the mouse liver was significantly higher compared with that in the β-arrestin2 WT group. Conclusionβ-arrestin2 alleviates endotoxin-induced inflammatory response probably inhibiting the activation of NF-кB and reducing the production of TNF-α, which plays a protective role in endotoxin-induced liver injury.

    【Key words】Endotoxin-induced liver injury; β-arrestin2; TLR4/NF-кB/TNF-α signaling pathway

    (收稿日期:2015-11-06)

    Corresponding author, Wei Xiuqing, E-mail: wei-xiuqing@163.com

    通訊作者,尉秀清,E-mail: wei-xiuqing@163.com

    基金項目:國家自然科學(xué)基金項目(81470848)

    DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.005

    ·基礎(chǔ)研究論著·

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