病毒誘導(dǎo)基因沉默鑒定穿心蓮內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵酶ApCPS功能

諶琴琴,劉　琴,李聰聰,付羽萍,王　強(qiáng)*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所,成都 611130;2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130)

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病毒誘導(dǎo)基因沉默鑒定穿心蓮內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵酶ApCPS功能

諶琴琴1,劉琴1,李聰聰1,付羽萍2,王強(qiáng)1*

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所,成都 611130;2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,成都 611130)

摘要:該研究采用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(VIGS),以生長(zhǎng)到第8片真葉期的穿心蓮植株為實(shí)驗(yàn)材料,沉默參與穿心蓮內(nèi)酯生物合成的ent-柯巴基焦磷酸合酶基因(ApCPS),用半定量和熒光定量PCR檢測(cè)病毒誘導(dǎo)沉默后ApCPS及其上游基因的表達(dá),用HPLC法檢測(cè)ApCPS沉默后穿心蓮內(nèi)酯的積累變化,同時(shí)檢測(cè)茉莉酸甲酯(MeJA)處理后ApCPS及上游基因的表達(dá),以全面分析穿心蓮內(nèi)酯代謝以及ApCPS在穿心蓮內(nèi)酯生物合成中的作用機(jī)制,驗(yàn)證其在植物體內(nèi)的功能。結(jié)果顯示:(1)ApCPS基因被成功沉默,基因表達(dá)顯著下調(diào),進(jìn)而引起上游牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因(GGPS)的表達(dá)下調(diào),而3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(HMGR)和1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因(DXS)的表達(dá)未受影響。(2)ApCPS基因沉默15 d后穿心蓮內(nèi)酯積累量顯著下降,表明ApCPS是穿心蓮內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵酶基因,且能夠負(fù)反饋影響上游基因表達(dá)。(3)茉莉酸甲酯(MeJA)顯著誘導(dǎo)ApCPS及上游基因HMGR、DXS和GGPS的表達(dá),表明穿心蓮內(nèi)酯生物合成基因受到MeJA的廣泛調(diào)控。該研究首次使用VIGS證明ApCPS參與到穿心蓮內(nèi)酯生物合成,為利用該技術(shù)鑒定穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑中其他基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:VIGS;ent-柯巴基焦磷酸合酶;穿心蓮內(nèi)酯;生物合成;基因表達(dá)

中藥穿心蓮是爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮[Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees]的干燥地上部分,又名一見喜、印度草、欖核蓮,味苦,是清熱解毒、抗菌消炎之要藥[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明穿心蓮具有抗腫瘤[2-3]、抗病毒[4]、免疫調(diào)節(jié)及肝保護(hù)作用[5]等,主要藥效成分是穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯。 但穿心蓮內(nèi)酯類化合物的生物合成途徑還未被解析,限制了其在合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究。

穿心蓮內(nèi)酯是由1個(gè)五元內(nèi)酯環(huán)和1個(gè)半日花烷型雙環(huán)骨架組成的二萜內(nèi)酯[6],具有萜類化合物共同前體焦磷酸異戊烯酯(IPP)和焦磷酸γ,γ-二甲基烯丙酯(DMAPP)。IPP和DMAPP是由細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑(MVA)或質(zhì)體中的2C-甲基-4-磷酸-4D-赤蘚糖醇途徑(MEP)生成的[7]。MVA途徑主要為生成倍半萜、三萜等提供前體,MEP途徑為單萜、二萜和四萜等提供前體。二萜是以3個(gè)IPP和1個(gè)DMAPP頭尾相連形成的牻牛兒基牻牛兒醇焦磷酸酯(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)為直接前體[8],由二萜合酶催化成環(huán),并經(jīng)后續(xù)的氧化修飾形成[9]。穿心蓮中的一個(gè)二萜合酶-ent-柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase,簡(jiǎn)稱ApCPS)的基因序列已被報(bào)道[10]。本實(shí)驗(yàn)室用原核表達(dá)和微生物代謝工程技術(shù)鑒定了ApCPS的生化功能,即催化GGPP生成ent-焦磷酸古巴酯(ent-CPP),該反應(yīng)為穿心蓮內(nèi)酯生物合成重要步驟,可能是穿心蓮內(nèi)酯生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶[11],但該途徑在赤霉素生物合成中也存在,因此ApCPS的體內(nèi)功能仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(virus-induced gene silencing,VIGS)是一個(gè)有效的反向遺傳學(xué)工具,被廣泛應(yīng)用于植物基因體內(nèi)功能鑒定,如番茄[12]、煙草[13]等植物。在中草藥中,Singh[14]利用VIGS成功沉默了南非醉茄中的SQS基因,減少了植物體內(nèi)醉茄內(nèi)酯的積累;Li[15]利用VIGS在天仙子中鑒定了一個(gè)參與莨菪烷生物合成的細(xì)胞色素P450的功能。作者前期以穿心蓮中的八氫番茄紅素脫氫酶基因(ApPDS)為報(bào)告基因,用煙草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)為載體在穿心蓮體內(nèi)建立了病毒誘導(dǎo)基因沉默體系[16]。本研究利用TRV-VIGS在穿心蓮葉片中沉默ApCPS,并使用HPLC法測(cè)定沉默后葉片中穿心蓮內(nèi)酯的含量,同時(shí)通過qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游基因和ApCPS的表達(dá)水平,研究了ApCPS在穿心蓮內(nèi)酯生物合成中的作用機(jī)制,并驗(yàn)證了其在植物體內(nèi)的功能。

1材料和方法

1.1材料

穿心蓮種子收集于廣西貴港,種植在人工氣候室,生長(zhǎng)條件為14 h光照(28 ℃)和10 h黑暗(25 ℃)。經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)王強(qiáng)教授完成鑒定。

1.2方法

1.2.1VIGS載體構(gòu)建根據(jù)NCBI上已報(bào)道ApCPS基因序列(GenBank登錄號(hào) KP982892)及pTRV2(ABRC)的多克隆位點(diǎn),使用軟件Oligo 7和Primer 3設(shè)計(jì)1對(duì)克隆引物ApCPS-TRV-F(BamHⅠ)和pCPS-TRV-R(XhoⅠ)(表1),以含有全長(zhǎng)ApCPS的pGEM-T載體為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,膠回收純化得到一段473 bp的核心保守片段rCPS。使用BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)回收產(chǎn)物及pTRV2進(jìn)行雙酶切,回收的酶切產(chǎn)物用T4-DNA(TaKaRa)連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN),通過菌落PCR及質(zhì)粒酶切鑒定獲得重組表達(dá)載體pTRV2-rCPS。

1.2.2農(nóng)桿菌浸染分別將pTRV1(ABRC)和pTRV2-rCPS用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101(本實(shí)驗(yàn)室保存),48 h后挑取單菌落接入5 mL LB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素,50 mg/L利福平,50 mg/L慶大霉素)28 ℃過夜培養(yǎng)活化,次日將活化過的菌液加入到50 mL含有10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸(MES)和20 μmol/L乙酰丁香酮(AS)的帶抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃過夜培養(yǎng),離心收集農(nóng)桿菌菌體。用侵染緩沖液(10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L MES,200 μmol/L AS)懸浮菌體,調(diào)整OD600為1.0,室溫下放置3 h后侵染。穿心蓮內(nèi)酯在生長(zhǎng)階段的葉片中積累最快[17],所以選擇8葉期植株進(jìn)行侵染。侵染時(shí)將含有pTRV1和pTRV2-rCPS的農(nóng)桿菌1∶1混合,用無針頭的注射器在葉片背面注射,使菌液充滿整個(gè)葉片,每顆苗注射2～4片葉子。將注射后的植株放在22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)光照12 h,后正常培養(yǎng)。

1.2.3基因表達(dá)檢測(cè)取浸染農(nóng)桿菌15 d后的葉片提取總RNA,以O(shè)ligo(dT)為引物,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA。使用半定量和熒光定量PCR檢測(cè)ApCPS基因沉默效果。ApCPS基因及內(nèi)參Actin基因(GenBank登錄號(hào)JX444056)的半定量及熒光定量檢測(cè)引物見表1。半定量PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min;30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。熒光定量PCR使用SsoFast Eva Green Supermix試劑在CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s;55 ℃退火15 s;72 ℃延伸20 s;40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù),采用儀器自帶軟件Bio-Rad CFX manager按2-ΔCt法處理數(shù)據(jù),使用Excel 2010作圖。

用100 μmol/L MeJA處理8葉期穿心蓮植株,在0、6、12、24和48 h取樣,提取RNA并合成cDNA用于檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游基因GGPS(GenBank登錄號(hào)AJ973133)、HMGR(GenBank登錄號(hào)AY254389)和DXS(GenBank登錄號(hào)AY254390)的表達(dá),引物見表1。

1.2.4HPLC法測(cè)定含量(1)對(duì)照品穿心蓮內(nèi)酯,脫水穿心蓮內(nèi)酯 (批號(hào)分別為110797-200307和110854-201007),購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。精密稱取穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯對(duì)照品,加甲醇制成5 g/L貯備液。

(2)色譜條件高效液相色譜儀(Agilent-1100),色譜柱Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相甲醇(A)-水(B),梯度洗脫(0～12 min,30 ～60% A;12～20 min,60% A;20～23 min,60%～30% A;23～25 min,30% A);柱溫25 ℃;穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯檢測(cè)波長(zhǎng)分別為225和254 nm;流速0.8 mL/min[18];進(jìn)樣量10 μL。穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的保留時(shí)間分別是9.4和16.5 min,與其他組分分離良好。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取對(duì)照品貯備液稀釋成5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,以峰面積對(duì)標(biāo)品含量進(jìn)行回歸分析,即得對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:穿心蓮內(nèi)酯,Y=1 983X+1 500.1(R2=0.999 1);脫水穿心蓮內(nèi)酯,Y=1 623.4X+68.967(R2=0.999 7)。

(4)供試品溶液的制備稱取穿心蓮葉片鮮重0.5 g,研勻,加入10 mL甲醇,浸漬1 h,超聲處理(功率220 W,頻率33 kHz)30 min,4 000 r/min離心10 min,取上清;沉淀用10 mL甲醇再提取1次,合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用甲醇溶解定容至1 mL,HPLC測(cè)定含量前用0.45 μm的濾膜過濾,各處理4個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)樣品取自4棵植株,3個(gè)重復(fù)。相對(duì)積累量的計(jì)算方法:

表1　片段擴(kuò)增及檢測(cè)引物

注:下劃線為酶切位點(diǎn)序列。

Note:The underline for enzyme locus sequence.

穿心蓮內(nèi)酯相對(duì)積累量=(浸染15 d后內(nèi)酯含量-8葉期內(nèi)酯含量)/8葉期內(nèi)酯含量×100%

2結(jié)果與分析

2.1RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)ApCPS基因表達(dá)

采用葉片注射法浸染穿心蓮8葉期植株(圖1,A)。15 d后觀察,侵染pTRV2-rCPS與空載體pTRV2的植株沒有明顯的表型差異(圖1,B)。取浸染后生長(zhǎng)15 d的葉片進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè),RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ApCPS基因表達(dá)有明顯的下調(diào)(圖1,C)。進(jìn)一步使用qRT-PCR定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ApCPS基因表達(dá)下調(diào)了49.8%(圖1,D),證明ApCPS基因被pTRV2-rCPS病毒載體成功沉默,效果明顯。

2.2沉默ApCPS后穿心蓮內(nèi)酯的積累變化

收集穿心蓮8葉期及農(nóng)桿菌浸染15 d后的葉片,HPLC法測(cè)定體內(nèi)穿心蓮內(nèi)酯及脫水穿心蓮內(nèi)酯含量。結(jié)果顯示相對(duì)于8葉期,生長(zhǎng)15 d后的TRV空白對(duì)照和ApCPS沉默植株中穿心蓮內(nèi)酯含量均顯著增加(圖2,A),相對(duì)于8葉期的積累量分別增加了106.43%和52.91%,但ApCPS沉默植株中穿心蓮內(nèi)酯積累量顯著低于空白對(duì)照(圖2,B)。沉默ApCPS基因?qū)е麓┬纳弮?nèi)酯的積累量顯著下降,符合其生化功能分析[11],證明ApCPS催化

穿心蓮內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵步驟。脫水穿心蓮內(nèi)酯在整個(gè)生長(zhǎng)期含量較低,差異變化不明顯。

2.3穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游基因的表達(dá)檢測(cè)

穿心蓮內(nèi)酯含量可以被茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)增加[19],ApCPS基因表達(dá)也能夠被MeJA誘導(dǎo)[11]。為了分析穿心蓮內(nèi)酯生物合成上游基因是否與ApCPS具有相同表達(dá)模式,對(duì)穿心蓮MVA途徑中的HMGR、MEP途徑中的DXS以及生成ApCPS催化底物GGPP的GGPS基因進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果(圖3,A)顯示,MeJA處理穿心蓮后,ApCPS在12 h被誘導(dǎo)表達(dá)量達(dá)到最大,HMGR、DXS、GGPS在6 h分別被誘導(dǎo)上調(diào)了9.08、3.31和5.80倍,除了HMGR在12 h持續(xù)被誘導(dǎo)表達(dá)外,DXS和GGPS在12 h已恢復(fù)到正常表達(dá)水平。病毒誘導(dǎo)ApCPS基因沉默后,HMGR和DXS的表達(dá)沒有受到影響,但GGPS的表達(dá)下調(diào)了64.36 %(圖3,B),暗示穿心蓮內(nèi)酯生物合成中有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的存在。

A.葉片注射法浸染8葉期的穿心蓮;B.沉默ApCPS基因15 d后的

A.8葉期及浸染生長(zhǎng)15 d后穿心蓮內(nèi)酯含量;B.穿心蓮內(nèi)酯的相對(duì)積累量。圖中的TRV表示浸染pTRV2的空白對(duì)照植株,

圖3　ApCPS上游基因在MeJA誘導(dǎo)(A)和

3討論

本研究使用VIGS法成功沉默了穿心蓮葉片中ApCPS的基因表達(dá),通過HPLC法檢測(cè)到穿心蓮內(nèi)酯積累量明顯下降,證明ApCPS在植物體內(nèi)參與穿心蓮內(nèi)酯生物合成,符合以往的生化研究[11]。同時(shí)ApCPS基因沉默后,穿心蓮植株并未有表型變化,顯示赤霉素代謝未受到影響。

在ApCPS被MeJA誘導(dǎo)上調(diào)后,上游的HMGR、DXS和GGPS也被誘導(dǎo)上調(diào),并且誘導(dǎo)時(shí)間早于ApCPS,表明MeJA能夠廣泛調(diào)控穿心蓮萜類代謝相關(guān)基因表達(dá),和以往研究中MeJA誘導(dǎo)穿心蓮懸浮細(xì)胞穿心蓮內(nèi)酯積累的結(jié)果一致[19]。MeJA處理能引起植物的抗病反應(yīng)[20],本研究中MeJA誘導(dǎo)穿心蓮MVA途徑的HMGR上調(diào)水平明顯大于MEP途徑的DXS,推測(cè)MVA途徑增加的法尼基焦磷酸用來參與甾醇生物合成,改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)去抵抗MeJA模擬的病原菌浸染。ApCPS被沉默后,GGPS的基因表達(dá)顯著降低,可能是ApCPS催化底物GGPP的積累負(fù)反饋調(diào)節(jié)上游基因GGPS的表達(dá),但早期的HMGR、DXS并沒有受到影響,暗示穿心蓮內(nèi)酯生物合成調(diào)控主要集中在GGPS和ApCPS這兩個(gè)基因。然而ApCPS沉默后其下游基因的表達(dá)情況,以及與其它萜類代謝流之間的相互作用仍不清楚,需要進(jìn)一步的研究。

大多數(shù)的藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)發(fā)展都比較滯后,使用VIGS技術(shù)鑒定重要藥用成分的生物合成基因功能是一個(gè)可靠便捷的方法。然而VIGS技術(shù)由于病毒載體的局限性,能用于此方法的植物仍有限,即使對(duì)于現(xiàn)在常用的表達(dá)穩(wěn)定、沉默效果好、對(duì)植物毒副作用小的TRV病毒載體適用范圍也是較低的,所以獲得適用范圍廣的病毒載體是急需解決的問題[21]。另外作者在實(shí)驗(yàn)中嘗試過不同的農(nóng)桿菌浸染方法,最后用針尖刺傷葉片后再用無針頭注射器注射農(nóng)桿菌的沉默效果最好,并且注射8葉期之前的幼苗存活率較低,表明針對(duì)不同植物應(yīng)當(dāng)篩選最佳的侵染時(shí)期和方法。

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(編輯:宋亞珍)

Functional Characterization of ApCPS Involved in Andrographolides Biosynthesis by Virus-induced Gene Silencing

SHEN Qinqin1,LIU Qin1,LI Congcong1,FU Yuping2,WANG Qiang1*

(1 Institute of Ecological Agriculture,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;2 College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China)

Abstract:The ent-copalyl diphosphate synthase gene (ApCPS) with putative invovlment in andrographolides biosynthesis was silenced successfully in the 8-leaf stage of Andrographis paniculata through TRV virus-induced gene silencing (VIGS),which was verified by semiquatitative RT-PCR and quatitative RT-PCR.(1)Gene silencing of ApCPS resulted in decreased accumulation of andrographolides significantly with HPLC analysis.(2)In order to comprehensively investigate gene expression of andrographolides biosynthesis,the uptream genes,HMGR,DXS and GGPS were chosen to be analyzed by qRT-PCR.In VIGS plants,GGPS showed decreased trascript accumulation,which might be resulted from negetive feedback of GGPP accumulated after ApCPS gene silencing.No significant change was observed for HMGR and DXS upon ApCPS gene silencing.(3)HMGR,DXS and GGPS exhibited inducible gene expression with MeJA treatment,as well as ApCPS,indicating pleiotropic regultion of MeJA on andrographolides biosynthesis.It is the first report to characterize ApCPS involved in andrographolides biosynthesis in vivo through VIGS,which lays the foundation for further investigation of other andrographolides biosynthetic genes.

Key words:VIGS;ent-copalyl diphosphate synthase;andrographolides;biosynthesis pathway;gene expression

中圖分類號(hào):Q786;Q789

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:諶琴琴(1990-),女,在讀碩士研究生,主要從事穿心蓮內(nèi)酯生物代謝調(diào)控研究。E-mail:shenqin2000@sina.cn*通信作者:王強(qiáng),博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事作物次生代謝調(diào)控與分子育種研究。E-mail:qwang@sicau.edu.cn

基金項(xiàng)目:四川省杰出青年基金(2014JQ0038)

收稿日期:2015-09-19;修改稿收到日期:2015-11-11

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0017-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0017