秀麗隱桿線蟲(chóng)在抗衰老領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展

游牧 胡云虎

[摘要]秀麗隱桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）是抗衰老研究中重要的模式生物之一，被廣泛應(yīng)用于抗衰老物質(zhì)的篩選和抗衰老分子機(jī)制的研究中。本文回顧了近年來(lái)秀麗隱桿線蟲(chóng)在抗衰老領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展，介紹了抗衰老物質(zhì)的篩選情況，系統(tǒng)綜述了作為抗衰老物質(zhì)篩選評(píng)價(jià)的生理指標(biāo)和反映抗衰老機(jī)制的生化指標(biāo)包括壽命、生存率、生存時(shí)間、ROS含量、脂褐質(zhì)積累以及daf-16，sod-3，gst-4，hsps基因調(diào)控情況等，指出了研究中存在的問(wèn)題，展望了秀麗隱桿線蟲(chóng)在抗衰老研究中的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]抗衰老；秀麗隱桿線蟲(chóng)；生理指標(biāo)；生化指標(biāo)

[中圖分類號(hào)]R339.3+8

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）02-0104-04

衰老是生物體必然的生理趨勢(shì)，是一種復(fù)雜多變的過(guò)程，它和老年病的發(fā)生密切相關(guān)。延緩衰老可以減少老年病的發(fā)生，如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等，具有重要意義?？顾ダ涎芯客芾в趯?shí)驗(yàn)對(duì)象選擇困難、實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)、樣本數(shù)有限等問(wèn)題，也影響抗衰老研究在分子領(lǐng)域的突破。秀麗隱桿線蟲(chóng)（下文簡(jiǎn)稱“秀麗線蟲(chóng)”）是一種非寄生性低等無(wú)脊椎生物，因其發(fā)育周期明確、時(shí)間短；品系資源充足，信息交流便利；易于大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)行大樣本量實(shí)驗(yàn)消除個(gè)體差異；信號(hào)通路高度保守等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于抗衰老藥物篩選、環(huán)境毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究。本文綜述了以秀麗線蟲(chóng)為動(dòng)物模型的抗衰老研究現(xiàn)狀，為開(kāi)展相關(guān)研究工作提供參考。

1 生理指標(biāo)

1.1 自然壽命

自然壽命是進(jìn)行抗衰老研究分析的首選指標(biāo)。秀麗線蟲(chóng)壽命實(shí)驗(yàn)通常采取同步化培養(yǎng)的L4期線蟲(chóng)，放置在涂有實(shí)驗(yàn)藥物的NGM培養(yǎng)基上，鋪板第1天記錄為第0天壽命，此后每天顯微鏡鏡檢記錄線蟲(chóng)的死亡數(shù)和存活數(shù)。藥物中可以添加FUDR抑制線蟲(chóng)產(chǎn)卵，也可以每天更換NGM培養(yǎng)基。20世紀(jì)80年代開(kāi)始使用秀麗線蟲(chóng)篩選抗衰老藥物，很多物質(zhì)如維生素E、黃酮、銀杏提取物、白藜蘆醇等效果明顯。近年研究結(jié)果顯示，大量人工合成物質(zhì)或者天然植物提取物也有明顯的抗衰老作用。Asthana等研究顯示，5μM、25μM和50μM黃金樹(shù)苷處理均能夠延長(zhǎng)生命周期，其中25μM效果最為明顯，可以延長(zhǎng)15.47%。鄭善清等使用含有5μM、10μM、50μM、500μM和2000μM綠原酸的培養(yǎng)基處理，多次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自然壽命平均能夠延長(zhǎng)21.3%，50μM處理組效果最佳，平均壽命延長(zhǎng)25.2%。王麗萍等利用自主設(shè)計(jì)合成的抗壞血酸過(guò)氧化物酶的新型模擬酶（DhHP-6）給藥處理后發(fā)現(xiàn)，野生型線蟲(chóng)平均壽命從（16.2±0.53）d提高到（19.7±0.26）d，提高21%。Kim J等報(bào)道顯示0.5nmM納米鉑處理后野生型線蟲(chóng)平均壽命延長(zhǎng)了22.3%、姜黃素、4羥基E環(huán)烯醚萜葡萄糖甙（4HEG）、側(cè)柏種子正丁醇提取物（BSPO）、4對(duì)羥基苯甲酸（4HBA）、奎尼酸、阿司匹林、葡萄籽原花青素、墨角藻黃素、齊墩果酸、淫羊藿類物質(zhì)、酪醇（特級(jí)初榨橄欖油提取物）、植物適應(yīng)原（刺五加和紅景天的提取物）等也都有類似報(bào)道，延長(zhǎng)范圍一般在15%-25%。文獻(xiàn)報(bào)道也有一些物質(zhì)延長(zhǎng)的程度更為明顯，比如Detienne等利用1.6μg/ml蜂皇乳處理可以使線蟲(chóng)壽命延長(zhǎng)33.9%； Vayndorf等研究發(fā)現(xiàn)lOmg/ml全蘋果提取物可以延長(zhǎng)39.6%，最長(zhǎng)生存天數(shù)提高25%。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)使用160mg/L濃度MDHB處理后，線蟲(chóng)壽命可以延長(zhǎng)40%。壽命實(shí)驗(yàn)多使用野生型品系，但也有研究使用fer-15（b26）等其他品系。另外，還有一些物質(zhì)雖然不能延長(zhǎng)正常狀態(tài)下的線蟲(chóng)壽命，但是在脅迫狀態(tài)下可以明顯延長(zhǎng)秀麗線蟲(chóng)的生命周期，如兒茶素（EGCG），茶氨酸，玉米活性提取物四肽、紅藻活性物等。

1.2 抗性指標(biāo)

生命周期的延長(zhǎng)通常與機(jī)體對(duì)外界的抗脅迫能力有關(guān)，因此脅迫狀態(tài)下的生存時(shí)間、存活率和ROS產(chǎn)生量都是考察的重要指標(biāo)。常見(jiàn)的脅迫環(huán)境主要有：熱脅迫、氧化應(yīng)激脅迫、細(xì)菌感染、uv照射。熱脅迫一般在幼蟲(chóng)期就進(jìn)行藥物暴露，發(fā)育為成蟲(chóng)后進(jìn)行熱激，熱激溫度通常為35℃，熱激時(shí)間lOh左右。已有研究顯示，200μg/ml葡萄籽原花青素處理組線蟲(chóng)平均生存時(shí)間為19. 6h，顯著延長(zhǎng)了27.3%：0.1μg/ml EGCG處理后線蟲(chóng)生存率提高13.1%：Asthana等將線蟲(chóng)熱激37℃，4h后發(fā)現(xiàn)黃金樹(shù)苷處理組生存率提高了23.89%。

活性氧（ROS）是機(jī)體的正常代謝中間產(chǎn)物，ROS過(guò)多會(huì)造成機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致生物大分子的氧化損傷，引起氧化應(yīng)激的發(fā)生，誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生，加速衰老。氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中通常使用的強(qiáng)氧化劑主要是胡桃醌或百草枯，兩者均能迅速使機(jī)體產(chǎn)生大量ROS，抗衰老物質(zhì)大都可以明顯清除ROS，提高機(jī)體抗氧化損傷能力。Liao等使用250μM胡桃醌刺激，姜黃素處理組ROS含量明顯下降。Liu等報(bào)道BSPO處理組，在500μM胡桃醌脅迫下有效降低了蟲(chóng)體內(nèi)ROS含量。Zhang等利用5mM百草枯進(jìn)行氧化應(yīng)激脅迫，在脅迫條件下齊墩果酸暴露組ROS水平顯著降低。Shukla等使用lOmM百草枯進(jìn)行氧化脅迫刺激，20μM4HEG處理組的ROS產(chǎn)生減少43%，明顯改善線蟲(chóng)體內(nèi)ROS的積累。相似的結(jié)果還出現(xiàn)在EGCG，喹啉類藥物，MDHB等物質(zhì)的研究中。胞內(nèi)ROS水平目前主要使用分子探針CMH2DCFDA活體檢測(cè)，可避免研磨組織對(duì)ROS檢測(cè)造成的干擾。氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中比較常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是野生型，也有研究選用mev-l缺失品系，原因是由于該品系對(duì)過(guò)氧化物更加敏感，體內(nèi)氧化自由基增加幅度更大。

細(xì)菌脅迫通常使用銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌，Vavndorf等用銅綠假單胞菌PA14感染秀麗線蟲(chóng)，每8-13h檢查存活的蟲(chóng)體，結(jié)果顯示對(duì)照組平均存活時(shí)間為（82±2.6）h，2.5mg/ml，5mg/ml和lOmg/ml處理組分別為（100±3.8）h， （111±4.4）h和（102±4.4）h，改善效果明顯。

uv脅迫是將線蟲(chóng)暴露在紫外線下照射，張健煒等使用L4期線蟲(chóng)，紫外強(qiáng)度為2000J/㎡，50mg/L紅茶水提取物處理后可以使線蟲(chóng)的平均存活時(shí)間延長(zhǎng)20.5%； Wiegant等使用紫外強(qiáng)度為IOOOJ/㎡，結(jié)果顯示紫外線暴露后線蟲(chóng)的平均壽命由14.6d降低到9.6d，植物適應(yīng)原處理組降低到11.ld，起到明顯的保護(hù)作用。此外還有學(xué)者制造高糖環(huán)境脅迫。目前研究認(rèn)為抗衰老物質(zhì)延緩線蟲(chóng)衰老的效果可能是通過(guò)改善應(yīng)激條件下的生存狀態(tài)，抗衰老物質(zhì)的效用與其在各種脅迫狀態(tài)下的保護(hù)作用密切相關(guān)。

1.3 健康壽命

秀麗線蟲(chóng)中健康壽命指標(biāo)主要有體長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)能力（爬行、咽泵、排便）等，脂褐質(zhì)是近年來(lái)出現(xiàn)的健康壽命的新指標(biāo)。脂褐質(zhì)又被稱為“年齡斑塊”，是一種內(nèi)源性自發(fā)熒光物質(zhì)，主要沉積于神經(jīng)、心肌、肝臟組織衰老細(xì)胞中，是溶酶體消解后的剩余物質(zhì)形成的殘余體。在線蟲(chóng)中，脂褐質(zhì)只分布在腸道附近，可以通過(guò)檢查其自發(fā)熒光強(qiáng)度來(lái)觀測(cè)。Kim DK等使用40μM 4-HBA處理后，脂褐質(zhì)積累減少了83.3%； Kim J等研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的納米鉑暴露lOd后，0.5mM納米鉑處理組脂褐質(zhì)積累情況得到有效改善。全蘋果提取物、BSPO、中藥虎杖提取物等也都具有明顯降低脂褐質(zhì)積累的功效。

2 生化指標(biāo)

2.1 DAF-16蛋白核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)

對(duì)抗衰老物質(zhì)的研究除了觀察對(duì)秀麗線蟲(chóng)生理指標(biāo)的改善，更多的是分析抗衰老物質(zhì)的分子調(diào)控機(jī)制。由于秀麗線蟲(chóng)基因的保守性和同源性，使其具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。2008年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Chalfie M[30]以秀麗線蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料證明了綠色熒光蛋白（GFP）作為發(fā)光遺傳標(biāo)記的價(jià)值。目前全球線蟲(chóng)資源庫(kù)中有大量攜帶GFP的轉(zhuǎn)基因品系，使得對(duì)分子機(jī)理的研究更為便利和直觀。目前已知daf-16基因是哺乳動(dòng)物FOXO基因的同源基因，是胰島素途徑下游的核心轉(zhuǎn)錄因子。正常生理狀態(tài)下，一系列磷酸化反應(yīng)使DAF-16蛋白分散在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)機(jī)體遇到脅迫時(shí)，DAF-16蛋白磷酸化水平降低，遷移入核發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，活化大量抗脅迫基因。該實(shí)驗(yàn)常用TJ356（DAF-16∷GFP）品系，對(duì)照組在熒光顯微鏡下通體綠色，發(fā)生核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)后，DAF-16蛋白聚集，蟲(chóng)體出現(xiàn)大量綠色耀眼斑塊。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸處理組核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)比率由6.5%提高到34.8%。Shukla等研究發(fā)現(xiàn)20μM 4HEG處理4h后核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)比率提高到45%。次血紅素六肽、酪醇等物質(zhì)均可以調(diào)控DAF-16蛋白核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的發(fā)生，激活下游抗衰老基因的轉(zhuǎn)錄，達(dá)到對(duì)線蟲(chóng)抗衰老的調(diào)控。

2.2 抗氧化酶基因表達(dá)

抗氧化酶是維持機(jī)體氧化還原平衡的一類酶。機(jī)體內(nèi)一旦形成過(guò)氧化物，它們可以把過(guò)氧化物轉(zhuǎn)換為毒害較低的物質(zhì)，進(jìn)行氧化防御。在報(bào)道中比較常見(jiàn)的指標(biāo)主要是：SOD-3，GST4/7，GSH等。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸處理組中SOD3基因表達(dá)量明顯增加，Asthana等利用CF1553（SO-3∷GFP），CL2166（GST-4∷GFP）品系在25μM黃金樹(shù)苷暴露72h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SOD3和GST4的表達(dá)量有顯著增加；Shukla等挑選野生型成蟲(chóng)在20μM 4-HEG充分暴露后利用QRTPCR技術(shù)檢測(cè)，SOD-3基因的表達(dá)量增加了1.4倍。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)0.1mg/ml奎尼酸（QA）處理野生型后，其SOD-3的含量大大提升。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用daf-16缺失品系CF1038[daf-16（mu86）I]時(shí)，QA無(wú)法對(duì)SOD-3的含量產(chǎn)生影響，而daf-16； daf-2雙基因缺失品系中的結(jié)果也表現(xiàn)一致，推測(cè)藥物促進(jìn)DAF-16蛋白入核，提高了其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)了下游基因抗氧化酶基因表達(dá)，增加了SOD-3等的表達(dá)量，有助于清除ROS。DhHP-6、EGCG、4HBA、玉米四肽、紅藻活性物、阿司匹林等都有相似結(jié)論。

2.3 熱休克蛋白基因表達(dá)情況

熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是一類結(jié)構(gòu)和功能高度保守的蛋白質(zhì)。HSP-16.2通常被認(rèn)為是敏感的抗應(yīng)激標(biāo)志物，也是較常見(jiàn)的檢測(cè)指標(biāo)。Shukla等使用CL2070[dvls70（HSP-16.2∷GFP）]品系經(jīng)過(guò)4HEG處理后發(fā)現(xiàn)HSP-16.2的表達(dá)量增加了1.5倍。Liu等將秀麗線蟲(chóng)先35℃熱激1h，再20℃恢復(fù)24h，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)顯示100μg/ml BSPO處理組的HSP-16.2∷GFP表達(dá)量提高到122.O%。KimDK等處理使用轉(zhuǎn)基因品系HSP-16.2∷GFP，36℃熱激2h，20℃恢復(fù)4h，發(fā)現(xiàn)單純熱激沒(méi)有提高HSP-16.2的表達(dá)量，熱激后加入4-HBA表達(dá)量大大提高。但Zhang等發(fā)現(xiàn)正常情況下奎尼酸不能增加HSP-16.2的產(chǎn)生量，但是熱激后可以增加HSP-16.2的產(chǎn)生量。推測(cè)是由于HSP-16.2也是daf-16的下游基因，daf-16基因的活化也導(dǎo)致了HSP-16.2表達(dá)的增加。阿司匹林、紅藻活性物、玉米四肽，黃金樹(shù)苷、齊墩果酸等也有類似結(jié)果。但Wiegant等通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析認(rèn)為植物適應(yīng)原的加入沒(méi)有能夠促進(jìn)HSP-16.2的合成，其合成量遠(yuǎn)沒(méi)有熱激產(chǎn)生量多。張健煒等研究顯示紅茶提取物組HSP-16.2∷GFP基因表達(dá)水平較正常對(duì)照組下調(diào)31.7%，認(rèn)為可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減少有關(guān)。

3 展望

目前應(yīng)用秀麗線蟲(chóng)對(duì)抗衰老物質(zhì)的篩選和抗衰老機(jī)制的研究已取得了豐碩的成果，研究工作相對(duì)系統(tǒng)全而，大量的抗衰老物質(zhì)和一些重要信號(hào)通路已得到揭示和闡明。但是還有很多細(xì)節(jié)不明確，很多觀點(diǎn)還停留在假說(shuō)上，缺乏足夠的證據(jù)予以證實(shí)。今后的工作可以采用基因組技術(shù)，廣泛搜集基因位點(diǎn)，建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行比較。此外要避免生理指標(biāo)對(duì)抗衰老評(píng)價(jià)的偏差，增加客觀性和真實(shí)性。