透明質(zhì)酸修飾的介孔二氧化硅包覆金納米棒的制備及在腫瘤化療-熱療聯(lián)合治療中的應(yīng)用

金新天，劉　剛，李君哲，孫麗麗，王俊榮，李俊鋒，李　沛，陳文慶，王　強(qiáng)，佟　倜

( 1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，長春130041; 2.吉林省腫瘤醫(yī)院，長春130021; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，長春130118)

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透明質(zhì)酸修飾的介孔二氧化硅包覆金納米棒的制備及在腫瘤化療-熱療聯(lián)合治療中的應(yīng)用

金新天1，2，劉剛2，李君哲2，孫麗麗2，王俊榮2，李俊鋒3，李沛2，陳文慶2，王強(qiáng)2，佟倜1

( 1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院，長春130041; 2.吉林省腫瘤醫(yī)院，長春130021; 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)院，長春130118)

摘要通過在包覆了金納米棒的介孔硅表面修飾生物相容性的透明質(zhì)酸，得到了具有腫瘤靶向性的多功能藥物載體.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，透明質(zhì)酸可以通過酰胺鍵修飾在介孔硅表面，所得藥物載體可在透明質(zhì)酸酶作用下實(shí)現(xiàn)選擇性釋放.該體系在近紅外區(qū)域具有較高的吸收，可以在近紅外光照射下實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該多功能藥物載體可以有效靶向CD44過量表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，通過CD44介導(dǎo)的內(nèi)吞富集在腫瘤內(nèi)部，結(jié)合化學(xué)藥物治療和光熱治療，顯示出更高的腫瘤細(xì)胞凋亡效率.

關(guān)鍵詞介孔二氧化硅;金納米棒;透明質(zhì)酸;化療-熱療聯(lián)合治療

在過去的20年里，納米科技取得了很多重要突破，開發(fā)新型的智能納米材料有望開辟醫(yī)學(xué)診療的新途徑［1～7］.在醫(yī)學(xué)腫瘤的治療過程中，由于臨床使用的化療藥物無法區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，因此在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)不可避免地帶來全身毒副作用，而且多期化療之后藥物對(duì)腫瘤的殺傷性效果變?nèi)酰?，9］.為了解決這一問題，化學(xué)家和材料學(xué)家致力于研發(fā)多功能納米藥物載體，將化療藥物負(fù)載于納米載體上［10～15］，有效地運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位精確地打擊腫瘤細(xì)胞.目前納米載體的研發(fā)主要集中在保證化療藥物準(zhǔn)確有效地運(yùn)輸?shù)侥[瘤部位，而不會(huì)提前泄露［16～18］.針對(duì)這一問題，研究人員在納米載體表面化學(xué)修飾靶向性分子，以保證其精確識(shí)別腫瘤細(xì)胞;此外還設(shè)計(jì)開發(fā)了刺激-響應(yīng)的藥物控釋體系，修飾堵孔試劑充當(dāng)“門衛(wèi)”，只有在腫瘤病理?xiàng)l件下(如酸性環(huán)境、還原性環(huán)境、過高的酶活力等)才會(huì)打開釋放藥物分子［19，20］.開發(fā)新型多功能納米材料，將化療藥物載體、熱療試劑、光動(dòng)力學(xué)治療試劑及成像造影劑整合在同一種材料上也是目前研發(fā)的熱點(diǎn)［21～25］.其中，介孔二氧化硅包覆金納米棒作為一種新型的納米材料，同時(shí)具有介孔二氧化硅和金納米棒的優(yōu)勢(shì)，是一種理想化的載體:介孔二氧化硅易制備，易修飾，生物相容性好，載藥量大，在藥物載體的研發(fā)中被廣泛使用;金納米棒表面等離子體共振峰在可見( 550 nm)到近紅外( 1550 nm)范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，其對(duì)特定波長光的散射和吸收使其可以作為優(yōu)良的成像造影劑和光熱轉(zhuǎn)換劑，受到了研究者的廣泛關(guān)注和深入研究［26］.

將靶向試劑、“門衛(wèi)”分子和多功能材料整合為一體是一個(gè)挑戰(zhàn)性的課題，同時(shí)也具有重要意義.透明質(zhì)酸( HA)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，其生物相容性好，不會(huì)引起機(jī)體免疫反應(yīng)，同時(shí)還可以和CD44受體特異性結(jié)合.研究表明［27］，多種腫瘤細(xì)胞表面會(huì)過量表達(dá)CD44，因此將透明質(zhì)酸修飾在納米載體上充當(dāng)靶向分子可以保證納米載體有效識(shí)別表達(dá)CD44的腫瘤細(xì)胞.此外，腫瘤微環(huán)境中存在透明質(zhì)酸酶，可以降解透明質(zhì)酸，因此透明質(zhì)酸還可以充當(dāng)“門衛(wèi)”分子.基于此，我們?cè)O(shè)計(jì)了智能納米載藥體系.如Scheme 1與圖1所示，金納米棒外面包覆介孔二氧化硅，介孔二氧化硅內(nèi)部負(fù)載化療藥物，表面修飾氨基，可進(jìn)一步與透明質(zhì)酸的羧基形成酰胺鍵［28，29］，將透明質(zhì)酸包覆在外表面.透明質(zhì)酸作為堵孔試劑保證藥物在正常條件下不釋放，而且作為靶向試劑可以與某些腫瘤細(xì)胞表面過量表達(dá)的CD44結(jié)合［30～32］，選擇性富集在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)的透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸，釋放藥物實(shí)現(xiàn)靶向給藥.

Scheme 1　Synthetic routes of the multifunctional drug delivery system( hyaluronic acid-modified mesoporous silica-coated gold nanorods) and the mechanism of chemo-and photothermal therapy

Fig.1　Schematic illustration of CD44 receptormediated endocytosis of nanoparticles and subsequent chemotherapy and　NIR-induced hyperthermia

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

正硅酸四乙酯( TEOS)、氫氧化鈉、3-氨基丙基-三乙氧基硅烷( APTES)、4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚( DAPI)、二甲基亞砜( DMSO)、十六烷基三甲基溴化銨( CTAB)、硼氫化鈉( NaBH4)、抗壞血酸、硝酸銀( AgNO3)和氯金酸( HAuCl4)購于西格瑪-奧德里奇公司;異硫氰酸熒光素( FITC)、透明質(zhì)酸鈉、N-羥基琥珀酰亞胺( NHS)和1-乙基-3-( 3-二甲氨基丙基)碳二亞胺( EDC)購于阿拉丁試劑公司;透明質(zhì)酸酶( Hyal-1)購于上海生工生物公司.實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

JEM-200C型透射電子顯微鏡( TEM，日本JEOL公司) ; JEM 4010型高分辨透射電子顯微鏡( HRTEM，日本JEOL公司) ; Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀( FTIR，德國Bruker公司) ; Zetasizer NanoS激光粒度儀(英國Malvern公司，λ=633 nm) ; LSM700型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司) ; FACS Aria型流式細(xì)胞儀(美國BD公司) ; UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司).

1.2實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1介孔二氧化硅包覆金納米棒( AuNR@ SiO2)的制備及修飾金納米棒按照文獻(xiàn)［25］方法制備.首先，由NaBH4還原HAuCl4制得CTAB包覆的納米金種子.將7. 5 mL 0. 1 mol/L的CTAB與250 μL 10 mmol/L HAuCl4混合，加水至總體積為9. 4 mL.然后將0. 6 mL冰浴后的NaBH4水溶液( 0. 01 mol/L)加到上述混合溶液中形成納米金種子(在2～5 h內(nèi)使用).用100 mL 0. 1 mol/L CTAB，5 mL 0. 01 mol/L HAuCl4，0. 8 mL 10 mmol/L AgNO3，2 mL 0. 5 mol/L H2SO4以及800 μL 0. 1 mol/L抗壞血酸制成金納米棒的生長液.加入240 μL上述納米金種子后開始反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程保持在30℃恒溫狀態(tài).將合成的金納米棒進(jìn)行離心清洗(每管40 mL，轉(zhuǎn)速9500 r/min，25 min)后，向沉淀物中加水稀釋到20 mL.在攪拌條件下加入200 μL 0. 1 mol/L NaOH溶液，隨后，將3份60 μL 20%TEOS試劑(用甲醇稀釋)每隔30 min加入，加入時(shí)輕輕攪拌，在26～28℃下反應(yīng)10 h，即得到介孔二氧化硅包覆的金納米棒，記為AuNR@ SiO2.為制得氨基修飾的納米粒子( AuNR@ SiO2-NH2)，在上述反應(yīng)完成后加入含10 μL APTES的100 μL甲醇溶液，反應(yīng)5 h后離心處理，獲得紅色沉淀.將紅色沉淀置于20 mL甲醇溶液中(含0. 2 mL的HCL)回流加熱1 h，然后用熱甲醇反復(fù)清洗沉淀物，即可得到去除了CTAB的產(chǎn)物AuNR@ SiO2-NH2.將1 mg FITC與22 μL APTES溶于1 mL乙醇中，避光反應(yīng)2 h，在制備AuNR@ SiO2的過程中，在第三次加入20%TEOS后向其中加入100 μL FITC與APTES的混合溶液，即得到熒光標(biāo)記的納米顆粒.記為AuNR@ FITC-SiO2-HA.

1.2.2藥物裝載及透明質(zhì)酸堵孔將10 mg AuNR@ SiO2-NH2在阿霉素溶液( 4 mL，1 mg/mL)中浸泡24 h.納米粒子通過離心、再分散的方式反復(fù)清洗以除去未裝載的藥物分子，即得到Dox-AuNR@ SiO2-NH2.取15 mg透明質(zhì)酸在水中分散、過夜使之完全水合.隨后在含有EDC( 2 mg/mL)和NHS( 2 mg/ mL)的2-( N-嗎啡啉)乙磺酸( MES)緩沖液( pH=6. 0)中活化羧基，反應(yīng)90 min后，將溶液pH值調(diào)至8. 3，在室溫下加入10 mg Dox-AuNR@ SiO2-NH2，持續(xù)攪拌20 h后通過離心分離清除剩余的HA，即得到負(fù)載Dox并堵孔的納米載藥粒子，記為Dox-AuNR@ SiO2-HA.收集所有清洗液，通過比較Dox反應(yīng)前后的量差可以計(jì)算出載藥量.

1.2.3藥物釋放實(shí)驗(yàn)將5 mg載藥納米粒子Dox-AuNR@ SiO2-HA分散至含有或未含有Hyal-1的PBS緩沖液( 5 mL，pH=4. 5)中.定期取出50 μL溶液，通過監(jiān)測(cè)Dox的光譜吸收值得到Dox釋放曲線.

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)將MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞以及NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基中( Gibco)進(jìn)行培養(yǎng)( 37℃，5%CO2)，每3 d更換一次培養(yǎng)基質(zhì)，細(xì)胞通過胰蛋白酶消化作用進(jìn)行傳代繁殖.

1.2.5共聚焦熒光成像與流式細(xì)胞檢測(cè)分析細(xì)胞對(duì)納米粒子的內(nèi)吞效率可以利用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行量化分析.在24孔板(用于共聚焦熒光成像)或6孔板(用于流式細(xì)胞分析)上培育MDA-MB-231和NIH-3T3細(xì)胞，密度約為105個(gè)/孔，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，細(xì)胞黏附、生長至覆蓋基底70%面積.將培養(yǎng)基去除，替換為含有納米粒子AuNR@ FITC-SiO2-HA( 70 μg/mL)的培養(yǎng)基，于37℃下孵育5 h.測(cè)試前，用PBS( pH=7. 4)清洗樣本3次以去除多余的納米粒子.細(xì)胞核用DAPI根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案染色，樣品直接用共聚焦顯微鏡觀察(熒光激發(fā)波長為488 nm).用于流式細(xì)胞分析的樣品在用PBS清洗后，用0. 25%的胰酶消化收集，細(xì)胞用300目細(xì)胞篩過濾后，用流式細(xì)胞儀測(cè)試(激發(fā)波長為488 nm)并收集FITC通道的信號(hào).

1.2.6細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)將MDA-MB-231和NIH-3T3細(xì)胞接種至96孔板中，密度約為104Cell/孔.培育24 h后，將一定濃度的Dox或Dox-AuNR@ SiO2-HA加入到細(xì)胞中并繼續(xù)培育24 h，隨后用MTT比色法研究細(xì)胞存活率.具體操作為:每孔加入20 μL MTT溶液( 5 mg/mL)，培養(yǎng)4 h后吸去液體，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀( OD為490 nm)處測(cè)量各孔的吸光值.以沒有藥物處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，活性記為100%，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值.為證實(shí)在激光輻照下納米粒子的光熱效應(yīng)可以有效殺滅癌細(xì)胞，MDA-MB-231細(xì)胞在96孔板中培育24 h后，用帶有一定濃度Dox-AuNR@ SiO2-HA的細(xì)胞培養(yǎng)基取代原培養(yǎng)液，經(jīng)6 h培育后，用激光照射培養(yǎng)皿(λ=808 nm，1 W) 5 min并繼續(xù)培育24 h.隨后用MTT法測(cè)試細(xì)胞存活率.

2　結(jié)果與討論

2.1介孔二氧化硅包覆金納米棒( AuNR@SiO2)的制備及功能化

介孔二氧化硅包覆的金納米棒AuNR@ SiO2參照文獻(xiàn)［25］方法制備.首先得到CTAB包覆的納米金種子，然后納米金種子在CTAB的保護(hù)下進(jìn)一步生長為納米棒，在生長過程中通過UV-Vis光譜監(jiān)測(cè)確保其吸收峰位置在790 nm左右.金納米棒表面的CTAB可以作為模板通過溶膠-凝膠方法包覆介孔硅再進(jìn)行表面氨基化.由TEM照片(圖2)可見，產(chǎn)物為尺寸均一的核殼結(jié)構(gòu)，尺寸約為70 nm，表面可以看到介孔的微結(jié)構(gòu).UV-Vis光譜的吸收峰位于790 nm，表明該材料可以吸收790 nm附近的近紅外光，實(shí)現(xiàn)光熱轉(zhuǎn)換［圖3( A)］.介孔硅內(nèi)部裝載藥物，且表面的氨基與透明質(zhì)酸的羧基反應(yīng)形成酰胺鍵后，可以將透明質(zhì)酸嫁接到介孔硅表面作為堵孔試劑，同時(shí)由于透明質(zhì)酸與細(xì)胞表面的CD44的結(jié)合作用，可以作為靶向基團(tuán).由圖2( B)和( C)的TEM照片可見，修飾透明質(zhì)酸后，介孔硅表面有聚合物，孔道變得模糊，圖2( C)中箭頭所指處.紅外光譜［圖3( B)］表明，氨基修飾的AuNR@ SiO2-NH2在1568 cm－1處有明顯的氨基峰，修飾透明質(zhì)酸后的AuNR@ SiO2-HA在1560和1637 cm－1處出現(xiàn)明顯的酰胺鍵特征峰.Zeta電勢(shì)結(jié)果(圖4)表明，AuNR@ SiO2表面帶負(fù)電荷，修飾氨基后的AuNR@ SiO2-NH2表面帶正電荷，修飾透明質(zhì)酸后的AuNR@ SiO2-HA表面帶大量負(fù)電荷，這就保證了其在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，有利于應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn).同時(shí)水合粒徑分布圖(圖5)也表明，修飾透明質(zhì)酸的AuNR@ SiO2-HA水合粒徑由AuNR@ SiO2的70 nm增大到120 nm. 2.2 AuNR@SiO2-HA的光熱轉(zhuǎn)換性能

Fig.2　TEM images of AuNR@SiO2( A) and AuNR@SiO2-HA( B，C)

Fig.3　Absorption spectra( A) of AuNR@SiO2( a)，AuNR@SiO2-HA( b) and Dox-AuNR@SiO2-HA( c) and FTIR spectra( B) of AuNR@SiO2-NH2( a) and AuNR@SiO2-HA( b)

Fig.4　Zeta potential of AuNR@SiO2( a)，AuNR@ SiO2-NH2( b) and AuNR@SiO2-HA( c)

Fig.5　Hydrodynamic diameters of AuNR @ SiO2and AuNR@SiO2-HA

Fig.6　Photothermal curves of H2O and AuNR@ SiO2-HA under NIR laser irradiation as a function of time

AuNR@ SiO2-HA的光熱效果如圖6所示.在808 nm激光照射條件下( 1. 8 W/cm2，8 min)，水沒有表現(xiàn)出溫度升高的現(xiàn)象.而0. 1 mg/mL AuNR@ SiO2-HA溶液照射8 min后，溶液溫度從19℃升高至30. 3℃.此外，AuNR@ SiO2-HA溶液的光熱效果隨濃度增加而升高.圖7為紅外攝像機(jī)成像圖.進(jìn)一步證明了AuNR@ SiO2-HA溶液的光熱效果.

2.3藥物釋放實(shí)驗(yàn)

Fig.7　Thermographs of H2O( a) and AuNR@SiO2-HA( 808 nm，1. 8 W/cm2，8 min) ( b) measured by infrared thermal imaging camera

Fig.8　Drug release profiles from Dox-AuNR @ SiO2-HA at different conditions

介孔硅表面修飾的透明質(zhì)酸作為堵孔試劑可以保護(hù)藥物在進(jìn)入細(xì)胞前不發(fā)生泄漏，當(dāng)載藥體系通過HA與腫瘤細(xì)胞表面的CD44相互作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后，細(xì)胞內(nèi)部過量的透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸，打開堵孔試劑，實(shí)現(xiàn)藥物釋放.本實(shí)驗(yàn)中負(fù)載的藥物模型為阿霉素，載藥量為46 μg Dox/mg納米粒子，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4. 6%，其載藥量可能與材料的比表面積或者實(shí)驗(yàn)中所使用的Dox和AuNR@ SiO2的濃度有關(guān)［25］.如圖3( A)中所示，Dox-AuNR@ SiO2-HA的紫外-可見吸收光譜中出現(xiàn)了Dox的吸收峰.如圖8所示，Dox-AuNR@ SiO2-HA中的Dox在生理PBS緩沖液( pH=7. 4)中，36 h內(nèi)只釋放4. 6%，表明藥物在血液循環(huán)過程中不會(huì)泄露;在pH=4. 5的PBS中，36 h內(nèi)只釋放8. 6%(因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)透明質(zhì)酸酶活性pH值為4. 5，所以增加此對(duì)照組) ;在透明質(zhì)酸酶存在的條件下，36 h釋放69. 1%.證明該體系是透明質(zhì)酸酶觸發(fā)的可控釋放體系.

2.4細(xì)胞對(duì)納米粒子的內(nèi)吞效果實(shí)驗(yàn)

為了將該載藥體系應(yīng)用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，考察其在細(xì)胞中的效果，首先需要證明AuNR@ SiO2-HA可以有效地、選擇性地進(jìn)入靶向腫瘤細(xì)胞.為此應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞分析儀對(duì)其進(jìn)行了分析.選用的細(xì)胞模型為MDA-MB-231(乳腺癌細(xì)胞)，該腫瘤細(xì)胞表面有大量CD44受體作為靶向細(xì)胞.AuNR@ SiO2-HA通過FITC進(jìn)行熒光標(biāo)記，記為AuNR@ FITC-SiO2-HA.將其和細(xì)胞共孵育一段時(shí)間后，進(jìn)行細(xì)胞成像，通過FITC的熒光觀測(cè)其是否進(jìn)入細(xì)胞(圖9).其中圖9( A)為細(xì)胞核染色圖，圖9( B)為納米粒子綠色熒光圖，圖9( C)為明場(chǎng)圖，圖9( D)為復(fù)合圖.可見納米粒子的綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)，證明其大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).

Fig.9　Confocal laser scanning microscopy investigation of the localization of AuNR@FITC-SiO2-HA to MDA-MB-231 cells( A) Blue fluorescence from nuclear stain DAPI; ( B) green fluorescence from AuNR@ FITC-SiO2-HA; ( C) bright-field image; ( D) combined image of ( A) to ( C).

圖10為流式細(xì)胞分析結(jié)果.實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞模型為MDA-MB-231，對(duì)照細(xì)胞為NIH-3T3(成纖維細(xì)胞)，其表面缺少CD44受體.圖10( A)為MDA-MB-231的細(xì)胞分析結(jié)果，其中紅色部分表示為AuNR @ FITC-SiO2進(jìn)入細(xì)胞的量，綠色部分表示修飾后AuNR@ FITC-SiO2-HA進(jìn)入細(xì)胞的量，可以看到，納米粒子表面修飾HA后，進(jìn)入該細(xì)胞的量明顯增加.圖10( B)為NIH-3T3的細(xì)胞分析結(jié)果，其中紅色部分表示為AuNR@ FITC-SiO2進(jìn)入細(xì)胞的量，綠色為修飾后AuNR@ FITC-SiO2-HA進(jìn)入細(xì)胞的量，可以看到，納米粒子表面修飾HA后，進(jìn)入該細(xì)胞的量無變化.由這2組數(shù)據(jù)對(duì)照可知，AuNR@ FITC-SiO2對(duì)于2組細(xì)胞沒有選擇性，而修飾透明質(zhì)酸后AuNR@ FITC-SiO2-HA進(jìn)入MDA-MB-231細(xì)胞的量明顯增大，證明其對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有靶向性.

Fig.10　Flow cytometry analysis of uptake efficiency of nanoparticles by MDA-MB-231( A) and NIH-3T3( B) cellsRed: AuNR@ FITC-SiO2; green: AuNR@ FITC-SiO2-HA.

2.5細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

圖11為MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果.可以看到，單獨(dú)的納米粒子AuNR@ SiO2-HA對(duì)細(xì)胞沒有毒性，而負(fù)載藥物阿霉素( Dox)之后得到的Dox-AuNR@ SiO2-HA對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性高于單獨(dú)的藥物.這是因?yàn)閷⒌攘克幬锔患诩{米粒子上，通過透明質(zhì)酸與腫瘤細(xì)胞表面的CD44結(jié)合進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，改變了藥物分子進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的途徑，避免了藥物飽和和藥物泵出，因此對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果更好.圖12為對(duì)NIH-3T3正常細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.可以看到，單獨(dú)的納米粒子AuNR@ SiO2-HA對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性，而負(fù)載藥物阿霉素( Dox)之后得到Dox-AuNR@ SiO2-HA對(duì)正常細(xì)胞的毒性反而低于單獨(dú)的藥物.這是因?yàn)镹IH-3T3表面缺少CD44受體，納米粒子修飾透明質(zhì)酸后帶負(fù)電，而細(xì)胞膜也帶負(fù)電，排斥效應(yīng)導(dǎo)致其進(jìn)入細(xì)胞的量減少.

Fig.11　In vitro viability of MDA-MB-231 cells in the presence of AuNR@SiO2-HA and Dox-AuNR@SiO2-HA

Fig.12　In vitro viability of NIH-3T3 cells in the presence　of AuNR@SiO2-HA　and Dox-AuNR@SiO2-HA

Fig.13　In vitro viability of MDA-MB-231 cells in the presence of Dox-AuNR@SiO2-HA with or without laser irradiation

進(jìn)一步評(píng)價(jià)了該載藥體系對(duì)腫瘤細(xì)胞MDAMB-231的化療-熱療協(xié)同殺傷效果.由圖13可見，單獨(dú)使用Dox-AuNR@ SiO2-HA化療的效果好于阿霉素; AuNR@ SiO2-HA進(jìn)入細(xì)胞后，再使用808 nm近紅外光照射，納米粒子的光熱效果導(dǎo)致局部溫度過高，在沒有藥物的作用下，本身就可以殺死腫瘤細(xì)胞，證明該納米粒子具有光熱凋亡腫瘤細(xì)胞的效果.Dox-AuNR@ SiO2-HA進(jìn)入細(xì)胞后，再使用808 nm近紅外光照射，藥物治療和過高溫治療協(xié)同后對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性效果更高，顯著高于單獨(dú)使用阿霉素組.原因是納米粒子載藥使得細(xì)胞內(nèi)富集藥物濃度更高，且在光熱條件下細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性更差.

3　結(jié)　論

設(shè)計(jì)了基于介孔硅包覆納米金棒的多功能載藥體系，該載體表面修飾透明質(zhì)酸后具有多種優(yōu)勢(shì):通過一步的透明質(zhì)酸修飾完成堵孔和靶向的雙重功能;結(jié)合藥物治療和光熱治療，表現(xiàn)出更高的凋亡效率.該載藥體系可以實(shí)現(xiàn)透明質(zhì)酸酶觸發(fā)的可控性釋放，同時(shí)具有光熱效果，可選擇性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞特異性殺傷作用，有望解決化療藥物的全身毒副作用以及長期使用藥物引發(fā)的耐藥性.

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Preparation of Hyaluronic Acid-modified Mesoporous Silica-coated Gold Nanorods and Their Application in Chemo-Photothermal Therapy of Cancer

JIN Xintian1，2，LIU Gang2，LI Junzhe2，SUN Lili2，WANG Junrong2，LI Junfeng3，
LI Pei2，CHEN Wenqing2，WANG Qiang2，TONG Ti1*
( 1.The Second Hospital of Jilin University，Changchun 130041，China; 2.The Jilin Province Cancer Hospital，Changchun 130021，China; 3.The Hospital of Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

Abstract A tumor-targeting multifunctional drug delivery system was obtained through modifying mesoporous silica-coated gold nanorods with biocompatible hyaluronic acid.The experimental results demonstrated hyaluronic acid could be modified on the surface of mesoporous silica through the formation of amide bond.The resulted drug carrier could realize enzyme-responsive drug release in the presence of hyaluronidase.UV-Vis spectra showed that the system had a high absorption in the near infrared region，thus exhibiting photothermal effect upon the near infrared light irradiation.Besides，cell experiments demonstrated the multifunctional drug carrier could effectively target CD44 over-expressed breast cancer cells.It could be accumulated in the tumor region through CD44 receptor mediated endocytosis.Combining chemo-and photothermal therapy resulted in improved tumor apoptosis efficiency.

Keywords Mesoporous silica; Gold nanorods; Hyaluronic acid; Chemo-photothermal therapy

( Ed.: F，K，M)

收稿日期:2015-08-20.網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-01-13.

doi:10.7503/cjcu20150662

中圖分類號(hào)O614; O643; O657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡介:佟倜，男，博士，教授，主要從事胸部腫瘤納米載體靶向化療的研究.E-mail: TTi666@ 163.com