顯脈旋覆花不同部位體內外抗氧化作用比較

賀安娜，佘朝文，曾軍英，彭圣賢

( 1．懷化學院生物與食品工程學院; 2．民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室; 3．湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室，湖南懷化　418008)

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顯脈旋覆花不同部位體內外抗氧化作用比較

賀安娜1，2，3，佘朝文2，3，曾軍英1，2，3，彭圣賢1

( 1．懷化學院生物與食品工程學院; 2．民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室; 3．湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室，湖南懷化418008)

中國圖書分類號: R282．71; R284．1; R284．2; R345．49; R349. 1; R916. 4

摘要:目的為合理利用顯脈旋覆花資源，研究了顯脈旋覆花體內外抗氧化作用。方法通過水煎法、索氏醇提法及超聲醇提法對顯脈旋覆花地上及地下部分藥用成分進行提取，并通過體內外實驗比較了不同部位超聲醇提物的抗氧化效果。結果超聲醇提所得總酚及總黃酮含量最高，提取物中總酚含量明顯高于總黃酮含量;顯脈旋覆花超聲醇提物對DPPH、ABTS及超氧陰離子自由基都有很好的清除效果，地下部分提取物的清除效果明顯優(yōu)于地上部分;提取物灌藥可明顯提高D-半乳糖致衰小鼠肝臟、腎臟及血清的過氧化氫酶( CAT)、超氧化物歧化酶( SOD)、總抗氧化能力( T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px)酶活性，并降低丙二醛( MDA)含量，地上部分高濃度抗氧化效果相當于地下部分低濃度的效果。結論顯脈旋覆花醇提物對自由基有良好的清除作用，具有較好的抗氧化能力，地下部分抗氧化的效果明顯高于地上部分。

關鍵詞:顯脈旋覆花;不同部位;提取方式;總酚;總黃酮;抗氧化

顯脈旋覆花( Inula nervosa Wall．)是菊科旋覆花屬植物，分布于我國湖南西南部、廣西北部、貴州及云南等地［1］。張鴨關等［2］研究表明，顯脈旋覆花富含蛋白質、亞油酸、α-亞麻酸及多種維生素和礦物質，平均營養(yǎng)價值很高;劉敏等［3］亞慢性毒性試驗證明顯脈旋覆花的提取物對大鼠沒有產生明顯毒性影響，衛(wèi)生部已批準顯脈旋覆花(小黑藥)為新資源食品，食用其地下部分。顯脈旋覆花中含有較多的揮發(fā)性油類物質，其中百里香酚等酚類物質占80%［4－5］，李柯等［6］研究發(fā)現(xiàn)該藥不同產地及不同部位酚類物質含量差異較大。顯脈旋覆花是一種多民族使用的藥用植物，具有補腎益肺通經絡等功效［7］，不同民族使用該藥的部位有差異［8］。目前未見顯脈旋覆花不同部位藥理藥效差異的報道，本文對顯脈旋覆花地上部分和地下部分的抗氧化效果進行了比較，旨在驗證民族用藥的科學性，也為充分合理利用該資源提供理論依據(jù)。

1　材料

1．1實驗材料與試劑顯脈旋覆花采自湖南懷化通道縣，10月挖取全草，將地上和地下部分分別洗凈曬干研磨成粉;昆明小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，8周齡，體質量( 30±2) g，許可證號SCXK(湘) 2014-0002，飼養(yǎng)于( 22±1)℃和光周期12 h動物房內，給予充足標準飼料和飲用水;沒食子酸、蘆丁標準品購于上海金穗生物，純度98%以上; Vit C、D-半乳糖購于美國Sigma公司; ABTS、DPPH、超氧陰離子自由基試劑盒、過氧化氫酶( CAT)試劑盒、超氧化物歧化酶( SOD)試劑盒、總抗氧化能力( T-AOC)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px)試劑盒、丙二醛( MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;乙醇、NaNO2、Al( NO3)3、Folin-酚、NaOH、NaCl等試劑均為分析純。

1．2儀器RE-52AA旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠) ; JY98-ⅢDN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司) ; HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(金云市醫(yī)療儀器廠) ; 5804R高速冷凍離心機(德國Eppendorf) ; UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津)。

2　方法

2．1提取液的制備水煎法提取:取顯脈旋覆花干燥粉末10 g于鋼杯中，120 mL蒸餾水煎煮3次，參考傳統(tǒng)中藥煎煮時間，每次約20min，合并3次提取液，濃縮過濾蒸餾水定容至100 mL。索氏醇提:顯脈旋覆花粉末10 g于索氏提取器中，加入120 mL 75%乙醇回流提取4 h，重復提取3次，合并上清，蒸餾濃縮去乙醇，過濾后用蒸餾水定容至100 mL。超聲醇提:顯脈旋覆花粉末10 g于錐形瓶中，加120 mL 75%乙醇，放入超聲波細胞破碎儀，25℃超聲40 min，超聲強度為500W，重復提取3次，合并上清，濃縮蒸餾去乙醇，過濾后蒸餾水定容至100 mL。每種提取方式重復3次取樣。

2．2提取液中總酚及總黃酮含量測定總酚含量測定:取50μL提取物，蒸餾水稀釋至1 mL，加入2 mL Folin-酚試劑搖勻后靜置5min，加入1. 6 mL 1 mol·L－1Na2CO3溶液搖勻，蒸餾水定容至25 mL，50℃水浴15min，冷卻后于λ= 750 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算提取物中的總酚濃度( g· L－1)，樣品中總酚含量/% = (總酚濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)) /樣品重量?？傸S酮含量測定:取1 mL提取物于錐形瓶中，加人25 mL 30%乙醇及1. 4 mL 5% NaNO2搖勻后靜置5min，再加入1. 4 mL 10% Al( NO3)3混勻靜置6 min，最后加入10 mL 1 mol·L－1NaOH，以30%乙醇定容至50 mL，λ=510 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中總黃酮濃度( g·L－1)，樣品中總黃酮含量/% = (總黃酮濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)) /樣品重量× 100%。

2．3動物材料準備實驗動物小鼠分空白對照組、衰老模型組及6個給藥組，小鼠♀♂各半，隨機分配，每組10只。空白對照組每日皮下注射生理鹽水( 1 mg·g－1·d－1)，灌胃蒸餾水( 0. 5 mL) ;衰老模型組注射D-半乳糖( 1 mg·g－1·d－1)，灌胃蒸餾水( 0. 5 mL) ;實驗組注射D-半乳糖( 1 mg·g－1· d－1)，分別灌胃顯脈旋覆花低( L)、中( M)、高( H)劑量組( 300、600、1200 μg·g－1·d－1)。連續(xù)給藥30 d。最后1次給藥12 h后處死小鼠，收集血液、肝臟及腎臟。用冰浴的生理鹽水將肝臟及腎臟研磨成10%的組織勻漿液，勻漿及血液在4℃、3 000 r· min－1條件下離心15 min，取上清液待用。

2．4生化指標測定DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率測定參考譚娟等［9］的方法。超氧陰離子自由基清除率、SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px酶活性及MDA含量測定均按照試劑盒說明書進行操作(南京建成生物工程研究所)。

2．5統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPSS 11. 0軟件進行，采用重復測量的方差分析，結果用±s表示;成分含量測定采用Duncan法進行多重比較，組間比較采用t檢測。

Tab 1 Content of polyphenol and total flavonoids of I．nervosa Wall．by different extraction methods(±s，n =3)

Tab 1 Content of polyphenol and total flavonoids of I．nervosa Wall．by different extraction methods(±s，n =3)

Different small letters in the same column indicate significant difference at P＜0. 05

Extraction methods　Content of total polyphenol/%Content of total flavonoids/% Aboveground　Underground Decoction extraction　0．572±0．031c　1．32±0．093c　0．012±0．001c　0．018±0．001 Aboveground　Underground c Soxhlet ethanol extraction　0．912±0．078b　1．86±0．121b　0．017±0．001b　0．022±0．002bUltrasonic ethanol extraction 0．996±0．085a　2．23±0．174a　0．021±0．002a　0．027±0．002a

3　結果

3．1不同提取方法所得總酚及總黃酮含量比較

以沒食子酸為標準品，測得標準曲線回歸方程為: Y =6. 2661X + 0. 0147，R2= 0. 9997，線性范圍在0～0. 4 g·L－1。以蘆丁為標準品，測得標準曲線回歸方程為: Y =0. 0244X + 0. 0037，R2= 0. 9992，線性范圍在0～0. 7 g·L－1。通過標準曲線計算顯脈旋覆花提取液中總黃酮及總酚含量，結果表明總黃酮含量遠遠低于總酚含量( Tab 1) ;相同提取方法所得總酚及總黃酮含量均表現(xiàn)為地下部分高于地上部分;采用超聲乙醇提取得到的總酚及總黃酮含量明顯高于其他兩種提取方法，水煎提取所得成分含量最低，因此文章后期體內外抗氧化實驗所用提取液均采用超聲乙醇提取。

3．2不同部位提取物體外抗氧化作用比較顯脈旋覆花地上及地下部分提取物在低濃度時對DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除效果較弱，隨濃度升高，抑制效果呈明顯線性關系( Fig 1，Tab 2)。對ABTS自由基的清除效果在低濃度時有明顯線性關系，濃度較高時則不明顯，線性范圍遠遠低于DPPH自由基、超氧陰離子自由基。地上部分提取物的半抑制濃度均高于地下部分，說明地下部分體外抗氧化的效果強于地上部分，這與顯脈旋覆花地下部分總酚及總黃酮含量高于地上部分的結果相符。

3．3不同部位提取物對衰老小鼠肝臟的影響空白對照組小鼠肝臟的抗氧化酶活性均明顯高于衰老模型組，同時MDA含量明顯低于衰老模型組( Tab 3)。顯脈旋覆花醇提物對D-半乳糖致衰小鼠肝臟CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活性有提高作用，并降低MDA含量，地上部分低濃度組的T-AOC酶活性與衰老組相比沒有明顯差異，隨灌藥濃度的增加肝臟抗氧化酶活性也得到增加?？寡趸ЧS提取物濃度的增加而增強，同等濃度的地下部分提取物抗氧化效果均優(yōu)于地上部分。

Fig 1 Clearing effects of I．nervosa Wall．on DPPH free radical，ABTS free radical and superoxide anion

Tab 2 Clearing effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on DPPH free radical，ABTs free radical and superoxide anion

Table 3 Effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on aging mouse liver(±s，n =10)

Table 3 Effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on aging mouse liver(±s，n =10)

*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs model;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control．

_Group　CAT/ kU·g－1Pro_______ SOD/ kU·g－1Pro_____ T-AOC/kU·g－1Pro__ GSH-Px/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro_ Control　57．3±5．01　56．2±4．90　15．2±1．45　350±37．1　1．49±0．34 Model　29．4±3．08##　17．1±1．36##　7．70±0．67##　166±15．4##　3．27±0．29##Aboveground-L　35．8±3．32＊＊##　26．2±3．19＊＊##　7．83±0．68##　189±17．5* ##　2．89±0．19* ##Aboveground-M　37．1±3．41＊＊##　28．6±2．68＊＊##　9．85±0．78＊＊##　233±22．1＊＊##　2．52±0．24＊＊##Aboveground-H　39．0±2．98＊＊##　38．7±3．62＊＊##　13．1±1．14＊＊#　279±25．6＊＊##　1．97±0．17＊＊##Underground-L　38．2±3．56＊＊##　31．8±3．47＊＊##　10．1±0．94＊＊##　256±21．4＊＊##　2．39±0．22＊＊##Underground-M　39．4±3．43＊＊##　44．1±4．23＊＊##　14．4±1．34＊＊　272±27．8＊＊##　1．89±0．18＊＊##_Underground-H　42．7±3．95＊＊##　54．5±5．49＊＊　14．8±1．36＊＊　343±33．9＊＊　1．67±0．14＊＊#

3．4不同部位提取物對衰老小鼠腎臟的影響衰老組小鼠的腎臟抗氧化酶活性均極明顯低于空白對照組( Tab 4)。灌胃低濃度的顯脈旋覆花地上部分提取物對衰老小鼠腎臟CAT、T-AOC酶活性及MDA含量影響不明顯，隨灌藥濃度升高，腎臟抗氧化酶活性也明顯升高。地下部分的效果同樣優(yōu)于地上部分，地下部分高濃度組的CAT、GSH-Px酶活性及MDA含量甚至與空白對照組無顯著性差異，說明此時衰老小鼠的腎臟得到了很好的修復。3．5不同部位提取物對衰老小鼠血清的影響在D-半乳糖的作用下，小鼠血清中CAT、SOD等抗氧化酶活性明顯下降，MDA含量極顯著升高( Tab 5)。顯脈旋覆花提取物對衰老小鼠血清的抗氧化酶都有不同程度的提高作用，并降低MDA含量。與衰老組相比，地上部分低濃度組T-AOC酶活性的升高及MDA含量的降低不明顯，隨濃度的增加，地上部分抗氧化的效果也逐步增加。地下部分的抗氧化效果同樣比地上部分強，各組抗氧化酶活性與衰老組相比差異均有統(tǒng)計學意義，CAT酶活性與空白對照組無顯著性差異。

Tab 4 Effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on aging mouse kidney(±s，n =10)

Tab 4 Effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on aging mouse kidney(±s，n =10)

*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs model;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control．

_Group　CAT/ kU·g－1Pro_______ SOD/ kU·g－1Pro______T-AOC/kU·g－1Pro___GSH-Px/ kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Control　19．0±1．94　34．2±3．45　8．04±0．67　312±22．4　3．67±0．41 Model　9．99±1．02##　18．3±1．85##　3．81±0．28##　168±17．1##　6．37±0．58##Aboveground-L　10．3±1．05##　20．2±1．97* ##　3．93±0．41##　206±19．4＊＊##　6．19±0．59##Aboveground-M　13．2±1．34＊＊##　21．6±1．89＊＊##　4．66±0．39＊＊##　259±25．3＊＊##　5．62±0．52* ##Aboveground-H　16．0±1．66＊＊##　22．4±2．14＊＊##　6．91±0．56＊＊##　312±30．6＊＊　4．51±0．44＊＊##Underground-L　14．4±1．34＊＊##　23．1±2．15＊＊##　4．42±0．42* ##　198±18．1＊＊##　5．87±0．57* ##Underground-M　15．5±1．37＊＊##　24．8±2．34＊＊##　6．39±0．61＊＊##　295±28．6＊＊　5．36±0．51＊＊##_Underground-H__________ _______19．3±1．56＊＊　28．2±2．18＊＊##　7．15±0．74＊＊#　311±34．2＊＊　3．55±0．37＊＊___

Tab 5 Effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on aging mouseserum(±s，n =10)

Tab 5 Effects of alcohol extraction of I．nervosa Wall．on aging mouseserum(±s，n =10)

*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs model;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs control．

_Group　CAT/ kU·g－1Pro_______ SOD/ kU·g－1Pro_____ T-AOC/kU·g－1Pro__ GSH-Px/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro_ Control　13．2±1．12　234±21．1　26．6±2．12　1613±257　6．05±0．53 Model　9．04±0．78##　114±10．1##　17．9±1．54##　411±31．8##　13．1±1．27##Aboveground-L　10．5±0．95* ##　164±15．8＊＊##　18．9±1．87##　623±58．9＊＊##　12．8±1．18##Aboveground-M　11．7±0．91＊＊#　171±15．4＊＊##　19．3±1．98* ##　842±78．8＊＊##　11．3±1．05* ##Aboveground-H　13．4±1．21＊＊　179±16．8＊＊##　22．7±2．21＊＊#　1065±100＊＊##　9．37±0．87＊＊##Underground-L　11．6±1．14＊＊　191±18．9＊＊##　22．2±2．01＊＊#　750±73．4＊＊##　11．0±0．98* ##Underground-M　12．1±1．19＊＊　212±17．9＊＊#　23．7±2．13＊＊#　944±87．5＊＊##　8．32±0．75＊＊##_Underground-H　14．5±1．31＊＊　223±15．6＊＊　25．3±1．67＊＊　1242±121＊＊##　7．86±0．64＊＊##

4　討論

近年來天然抗氧化劑的研究開發(fā)取得了很大進展，已報道發(fā)現(xiàn)很多植物都具有一定的抗氧化效果［10］，這些研究都基于藥材的特殊用途，通過藥理實驗對藥效進行了驗證［11］。本文研究發(fā)現(xiàn)，顯脈旋覆花提取物在體外對超氧陰離子自由基、DPPH自由基及ABTS自由基都有一定的清除效果，地上部分提取物的半抑制濃度均高于地下部分。注射D-半乳糖致衰小鼠的肝臟、腎臟及血清中CAT、SOD、T-AOC、GSH-Px酶活性明顯低于空白對照組，MDA含量則明顯增高，與文獻報道的結果一致［12］，表明實驗動物造模成功。通過灌胃顯脈旋覆花提取物，致衰小鼠的抗氧化酶系統(tǒng)得到很好的修復，抗氧化效果隨提取物濃度的增加而增強。

酚類物質是有效的自由基清除劑、抑制劑和螯合劑，黃酮類化合物也都有較強的抗自由基作用，這兩類物質的抗氧化效果已有眾多報道［13－14］。顯脈旋覆花中含有較高的酚類物質，本文實驗結果表明，顯脈旋覆花地下部分提取物的總酚及總黃酮含量高于地上部分，同濃度提取物的地下部分抗氧化效果都強于地上部分，提取物體內外抗氧化的效果與總酚及總黃酮含量呈正比，可見酚類及黃酮類物質是顯脈旋覆花抗氧化的重要藥用成分。實驗通過比較地上及地下部分的活性成分及抗氧化效果，驗證了顯脈旋覆花使用部位的科學性(衛(wèi)生部公布的食用地下根莖部位)。

(致謝:本實驗在懷化學院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室完成。)

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Comparison study on in vitro and in vivo antioxidant activities of Inula nervosa Wall．extracts from different parts

HE An-na1，2，3，SHE Chao-wen2，3，ZENG Jun-ying1，2，3，PENG Sheng-xian1
( 1．College of Biological and Food Engineering，Huaihua University; 2．Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province; 3．Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plant and Ethnobotany of Hunan Higher Education，Hunan Huaihua 418008，China)

Abstract:AimTo study the in vitro and in vivo antioxidant activity of Inula nervosa wall．in order to legitimately use the resources of I. nervosa．Methods The medicinal ingredients of aboveground and underground parts of I．nervosa were extracted by different extraction methods．Ultrasonic extractions from different parts were compared by their in vitro and in vivo antioxidant effects．ResultsUltrasound alcohol extraction had the highest content of total phenols and flavonoids，with the content of total phenolics much higher than that of total flavonoids．Ultrasound alcohol extractions had very good scavenging effect on DPPH，ABTS and superoxide anion radical，with the extraction from underground part more effective than extraction from aboveground part．Ultrasound alcohol extractions significantly increased the level of catalase ( CAT)， superoxide dismutase ( SOD)，total antioxidant capacity ( T-AOC)，glutathione peroxidase ( GSH-Px) activity and decreased the level of malondialdehyde ( MDA) in liver，kidney and serum in drenching aging mice．The antioxidant activity of high concentration of the extraction from aerial part was equivalent to that of low concentration of the extraction from underground part．Conclusions Ultrasound alcohol extractions of I．nervosa have very good scavenging effect on free radicals，which indicates good antioxidant ability．Antioxidant activity of underground part is much stronger than that of the aboveground part．

Key words:Inula nervosa Wall．; different parts; extraction methods; total polyphenol; total flavonoids; antioxidant

作者簡介:賀安娜( 1981－)，女，碩士，副教授，研究方向:民族藥用植物方面，Tel: 0745-2861281，E-mail: anna99102 @ 163．com

基金項目:湖南省科技計劃重點項目( No 2013FJ4324) ;湖南省科技計劃一般項目( No 2013NK4108) ;植物學湖南省“十二五”重點建設學科資金資助( No ZWX2014-4)

收稿日期:2015－08－26，修回日期: 2015－11－26

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0079－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．017