補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大鼠腦缺血后血管新生及Nrf2/HO-1信號(hào)途徑的影響

佘　顏，王宇紅，邵　樂(lè)，夏相宜，劉　芳，蔡光先

( 1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙　410208)

?

補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大鼠腦缺血后血管新生及Nrf2/HO-1信號(hào)途徑的影響

佘顏1，王宇紅2，邵樂(lè)2，夏相宜2，劉芳2，蔡光先2

( 1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙410208)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào): R-332; R289．5; R322．81; R364．3; R743．310．22; R977．3; R977．6

摘要:目的觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大鼠腦缺血后血管新生及核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2( Nrf2) /血紅素加氧酶-1 ( HO-1)信號(hào)途徑的影響。方法120只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方組。采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立局灶性腦缺血模型，各組給予相應(yīng)處理。在d 1、3、7三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取腦組織進(jìn)行檢測(cè)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)血漿Ⅷ因子相關(guān)抗原( vWF)，測(cè)定微血管密度( MVD)。采用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)大鼠腦組織中Nrf2、HO-1基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果①與假手術(shù)組比，模型組vWF陽(yáng)性表達(dá)微血管在d 3時(shí)表達(dá)明顯升高( P ＜0. 05)，給藥組d 7與模型組比較差異有顯著性( P＜0. 05) ;②假手術(shù)組Nrf2、HO-1mRNA及蛋白呈少量表達(dá)，模型組Nrf2蛋白表達(dá)水平d 3與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01)，各給藥組能上調(diào)Nrf2mRNA及蛋白表達(dá)，其中Nrf2mRNA在d 7，Nrf2蛋白表達(dá)在d 1及d 7上調(diào)最明顯，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01)。模型組HO-1mRNA及蛋白在d 7與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)，各給藥組HO-1mRNA在d 3，HO-1蛋白在d 3及d 7上調(diào)最明顯，與同時(shí)段模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05，P＜0. 01)。結(jié)論補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方促進(jìn)腦缺血后血管新生，這一作用可能與調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)途徑的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方;血管新生;核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2;血紅素加氧酶-1;血漿Ⅷ因子相關(guān)抗原;微血管密度

蔡光先( 1960－)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:心腦血管疾病的防治，通訊作者，E-mail: lby1203@ sina．com

近年國(guó)外研究表明［1－4］: Nrf2/HO-1信號(hào)途徑激活在血管新生中發(fā)揮重要作用，是一個(gè)新型調(diào)控血管新生的潛在靶點(diǎn)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方是課題組在多年臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，遵循補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義，基于益氣祛瘀生新法精簡(jiǎn)方藥，并且配合醇提、超臨界CO2提取工藝制備而成。前期實(shí)驗(yàn)對(duì)精簡(jiǎn)方進(jìn)行最佳給藥劑量篩選，結(jié)果表明精簡(jiǎn)方中劑量( 2. 41 g·kg－1·d－1)可明顯改善其神經(jīng)功能缺失癥狀，恢復(fù)體質(zhì)量，減小腦梗死面積，減輕腦組織水腫［5－6］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上觀察該劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)大鼠腦缺血損傷后不同時(shí)點(diǎn)血管新生的作用，并從核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2( Nrf2) /血紅素加氧酶-1( HO-1)途徑研究其作用機(jī)制。該研究為補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方的后期新藥申報(bào)工作奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為中藥的藥效分子機(jī)制研究思路提供參考。

1　材料

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，♂，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(京) 2012-0001。

1．2藥物補(bǔ)陽(yáng)還五湯處方(生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、川芎3 g、紅花3 g、赤芍4. 5 g、桃仁3 g、地龍3 g)和補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方處方(黃芪30 g、川芎9 g、地龍6 g)中所有原藥材經(jīng)鑒定均符合2010版《中國(guó)藥典》的有關(guān)規(guī)定，補(bǔ)陽(yáng)還五湯按傳統(tǒng)水煎后濃縮干燥制備成干浸膏(每1 g干浸膏相當(dāng)于原生藥4. 5 g)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方干浸膏由湖南中醫(yī)藥研究院中藥所完成并提供(每1 g干浸膏相當(dāng)于原生藥4. 7 g)。

1．3主要試劑兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體(批號(hào): Ab137550)，兔抗大鼠HO-1多克隆抗體(批號(hào): Ab13248)購(gòu)自Abcam公司。兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體(批號(hào): 5471)購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。兔抗大鼠vWF多克隆抗體(批號(hào): 0612)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號(hào): A0208)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SYBRGreen-PCR試劑盒(批號(hào)F-415XL)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)#K1622)購(gòu)自Thermo科技有限公司。

1．4主要儀器Multiscan MK3酶標(biāo)儀由芬蘭雷勃公司提供，F(xiàn)inesse 325型石蠟切片機(jī)由英國(guó)Shando公司提供，Bx51光學(xué)顯微鏡及IPP6．0圖像分析系統(tǒng)由日本Olympus公司生產(chǎn)提供。2400PCR擴(kuò)增儀( PE)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、芬蘭雷勃酶標(biāo)儀(型號(hào)MK3)、電泳儀(型號(hào)mini protean 3 cell)由美國(guó)BIO-RAD公司提供。

2　方法

2．1模型制備參考改良Nagasawa等［7］線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型，假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚、分離左側(cè)頸總動(dòng)脈后隨即縫合。動(dòng)物清醒2 h后參照Longal等［8］及Bedersont等［9］的5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值在1～3分者入組。評(píng)分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。剔除標(biāo)準(zhǔn):評(píng)分低于1分;蛛網(wǎng)膜下腔出血; HE染色無(wú)腦缺血病理改變;未到時(shí)間點(diǎn)死亡。因大鼠死亡等致樣本量不足時(shí)隨機(jī)替補(bǔ)。

2．2實(shí)驗(yàn)分組與處理除假手術(shù)組外，將造模成功后大鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方組，每組30只，每組按3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別于首次給藥后d 1、d 3、d 7處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只。給藥組于術(shù)后2 h給藥，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組按成人等效劑量3. 15 g·kg－1·d－1、補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方組按2. 41 g·kg－1·d－1藥液灌胃。給藥體積4 mL·kg－1。模型組和假手術(shù)組均給予等體積生理鹽水。

2．3免疫組化方法檢測(cè)大鼠腦組織vWF表達(dá)及微血管密度( MVD)測(cè)定每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠，10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，4%多聚甲醛固定。各組組織切片一抗用兔抗大鼠vWF多克隆抗體( 1∶100)，陰性對(duì)照用PBS替代，4℃冰箱孵育過(guò)夜，用生物素標(biāo)記的二抗在室溫孵育30 min，DAB顯色。每只動(dòng)物取切片5張，最后采用Image proplus16. 0成像分析系統(tǒng)分析光鏡高倍(×400)下每張免疫組化切片相同部位拍照。vWF染色陽(yáng)性表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者，1個(gè)血管計(jì)數(shù)以內(nèi)皮細(xì)胞簇者為標(biāo)準(zhǔn)，管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑之和或肌層較厚的血管予以剔除。于缺血區(qū)內(nèi)6個(gè)高倍視野(×400)鏡下進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，其均數(shù)為該切片的微血管密度［10－11］。

2．4Real-Time PCR檢測(cè)大鼠腦組織Nrf2及HO-1mRNA表達(dá)大鼠麻醉后斷頭處死，在冰盤(pán)上快速取出大鼠海馬，按TRIzol試劑盒說(shuō)明的步驟提取總RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，電泳查看RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增所用的寡核苷酸物序列由上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系( 25 μL) : SYBR Green Mix ( 12. 5 μL)、上游引物F( 0. 5 μL)、下游引物R( 0. 5 μL)、ddH2O( 9. 5 μL)、cDNA模板( 2 μL)。反應(yīng)條件:95℃、10 min; 95℃、15 s; 60℃、1 min; 95℃、15 s; 60℃、15 s( 40個(gè)循環(huán))。使用ABI 7500型熒光定量PCR儀采集待測(cè)基因及內(nèi)參照GAPDH擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)引物。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，進(jìn)行PCR定量時(shí)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用2－ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequence and product length of genes

2．5Western blot檢測(cè)大鼠腦組織Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)取100mg腦組織，按說(shuō)明書(shū)提取并測(cè)定蛋白含量，取蛋白樣品與4×SDS凝膠上樣緩沖液混合后煮沸變性，SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS溶解封閉。再分別與兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體( 1∶1 000)、兔抗大鼠HO-1多克隆抗體( 1∶250)、兔抗大鼠GAPDH抗體( 1∶1 500) 4℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST溶液洗3次。然后與HRP標(biāo)記的二抗( 1∶1 000)室溫孵育，以增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯影。將膜進(jìn)行掃描，圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的積分光密度值( IOD)，以GAPDH為內(nèi)參照，以目的條帶IOD值與GAPDH條帶IOD值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2．6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，計(jì)量資料用±s表示，相同時(shí)間點(diǎn)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。

3　結(jié)果

3．1補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)間點(diǎn)vWF表達(dá)及微血管密度( MVD)表達(dá)的影響vWF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示: vWF標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，微血管管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，形態(tài)不規(guī)則。在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)視野中vWF陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目以此來(lái)反映腦梗死區(qū)中平均微血管密度。假手術(shù)組vWF在微血管有極少量陽(yáng)性表達(dá)，模型組vWF陽(yáng)性表達(dá)微血管在d 1時(shí)無(wú)明顯差異，d 3時(shí)表達(dá)明顯升高( P＜0. 05)，隨著動(dòng)物生存時(shí)間延長(zhǎng)，模型組vWF陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。給藥組d 7與模型組比較差異均有顯著性( P＜0. 05)，給藥組組間比較差異無(wú)顯著性。見(jiàn)Tab 2。

Fig 1 Expression of vWF in rats at different time points(×400)

Tab 2 Microvessel density( MVD) of rats at different time points(±s，n =5)

Tab 2 Microvessel density( MVD) of rats at different time points(±s，n =5)

△P＜0. 05 vs sham at the same time;*P＜0. 05 vs model at the same time

Group　Day 1　Day 3　Day 7 Sham　13．22±2．18　12．39±1．96　13．41±2．35 Model　14．73±3．09　20．88±2．47△　15．90±2．63 Buyang Huanwu Decoction　13．59±2．46　22．43±2．94　23．18±3．03*Thin Recipe of Buyang Huanwu Decoction_____________________________________________ _ 14．25±1．85　21．67±1．79　24．46±2．15*

3．2補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)的影響假手術(shù)組中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA呈少量表達(dá)，模型組Nrf2 mRNA表達(dá)略高，但與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0. 05)。模型組HO-1 mRNA逐漸升高，d 7與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。各給藥組能不同程度上調(diào)Nrf2及HO-1 mRNA表達(dá)，其中Nrf2 mRNA在d 7上調(diào)最明顯，HO-1 mRNA在d 3上調(diào)最明顯，與同時(shí)段模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 05)。見(jiàn)Tab 3、4。

Tab 3 Expression of Nrf2 mRNA in rats at different time points(±s，n =5)

Tab 3 Expression of Nrf2 mRNA in rats at different time points(±s，n =5)

*P＜0. 05 vs model at the same time

Group　Day 1　Day 3　Day 7 Sham　0．221±0．022　0．219±0．024　0．220±0．034 Model　0．234±0．025　0．221±0．036　0．228±0．011 Buyang Huanwu Decoction　0．240±0．031　0．259±0．029　0．292±0．038*Thin Recipe of Buyang Huanwu Decoction_____________________________________________ _0．238±0．040　0．263±0．035　0．288±0．036*

3．3補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方對(duì)腦缺血大鼠不同時(shí)間點(diǎn)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示: Nrf2蛋白定位于68 ku，HO-1蛋白定位于32 ku，內(nèi)參照物GAPDH定位于37 ku，假手術(shù)組中Nrf2、HO-1蛋白呈少量表達(dá)，模型組d 3 Nrf2蛋白、d 7HO-1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01，P＜0. 05)。各給藥組能不同程度上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，其中d 1及d 7 Nrf2蛋白表達(dá)與同時(shí)段模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組d 3及補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方組d 3、d 7 HO-1蛋白表達(dá)與同時(shí)段模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0. 01)。見(jiàn)Tab 5、6。

Tab 4 Expression of HO-1 mRNA in rats at different time points(±s，n =5)

Tab 4 Expression of HO-1 mRNA in rats at different time points(±s，n =5)

△P＜0. 05 vs sham at the same time;*P＜0. 05 vs model at the same time

Group　Day 1　Day 3　Day 7 Sham　0．256±0．029　0．249±0．044　0．251±0．038 Model　0．251±0．045　0．257±0．028　0．319±0．043△Buyang Huanwu Decoction　0．258±0．036　0．321±0．051*　0．323±0．039 Thin Recipe of Buyang Huanwu Decoction_____________________________________________ _0．253±0．038　0．318±0．037*0．337±0．035

Fig 2 Expression of Nrf2，HO-1 protein in rats at different time points

Tab 5 Nrf2/GAPDH optical density ratio in rats at different time points(±s，n =5)

Tab 5 Nrf2/GAPDH optical density ratio in rats at different time points(±s，n =5)

△△P＜0. 01 vs sham at the same time;＊＊P＜0. 01 vs model at the same time

Group　Day 1　Day 3　Day 7 Sham　0．319±0．038　0．278±0．033　0．368±0．042 Model　0．306±0．024　0．845±0．051△△　0．259±0．045 Buyang Huanwu Decoction　0．695±0．047＊＊0．745±0．043　0．631±0．057＊＊Thin Recipe of Buyang Huanwu Decoction_____________________________________________________ _0．721±0．052＊＊0．612±0．048　0．845±0．061＊＊

Tab 6 HO-1/GAPDH optical density ratio in rats at different time points(±s，n =5)

Tab 6 HO-1/GAPDH optical density ratio in rats at different time points(±s，n =5)

△P＜0. 05 vs sham at the same time;＊＊P＜0. 01 vs model at the same time

Group　Day 1　Day 3　Day 7 Sham　0．425±0．059　0．373±0．023　0．369±0．041 Model　0．491±0．060　0．382±0．034　0．411±0．037△Buyang Huanwu Decoction　0．523±0．044　0．867±0．042＊＊0．218±0．043 Thin Recipe of Buyang Huanwu Decoction　0．542±0．037　0．824±0．033＊＊0．904±0．058＊＊

4　討論

腦組織在缺血缺氧損傷作用下，缺血半暗帶神經(jīng)元發(fā)生一系列神經(jīng)功能缺損形態(tài)學(xué)變化，這種腦組織缺血性神經(jīng)功能損傷在一定時(shí)限內(nèi)是可逆性的，主要取決于缺血區(qū)血供情況。血管新生通過(guò)啟動(dòng)損傷區(qū)微血管網(wǎng)重建，改善缺血區(qū)周?chē)慕M織灌流，為損傷神經(jīng)元的修復(fù)、突觸重建和神經(jīng)發(fā)生創(chuàng)造良好的微環(huán)境［12－14］。然而，腦缺血后血管新生是一系列相互銜接、精密調(diào)控的過(guò)程，諸多調(diào)控因子參與其中，相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍未完全明確。

研究表明［1－4］，Nrf2/HO-1信號(hào)途徑在血管新生中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。靜息情況下Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中，半衰期較短，在胞質(zhì)中與肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Keapl結(jié)合而處于失活狀態(tài)，且被泛素蛋白酶體途徑迅速降解。當(dāng)受到來(lái)源于親電子物質(zhì)或活性氧的信號(hào)攻擊后，Nrf2從Keapl-Nrf2復(fù)合物中解離，Nrf2的半衰期明顯延長(zhǎng)，然后穩(wěn)定狀態(tài)的Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE特異性位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)ARE調(diào)控的二相酶及抗氧化酶的基因表達(dá)［15－16］。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方由黃芪、川芎等組成，遵循補(bǔ)陽(yáng)還五湯之方義，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的觀念而發(fā)展起來(lái)的。并且配合醇提、超臨界CO2提取工藝制備而成，旨在尋找一種物質(zhì)基礎(chǔ)明確、藥效相當(dāng)甚至更優(yōu)于原方的新型復(fù)方。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:與模型組比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方組大鼠腦缺血區(qū)vWF陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯增多，微血管密度增加，并隨著動(dòng)物生存時(shí)間延長(zhǎng)，vWF表達(dá)維持在較高水平，說(shuō)明藥物的干預(yù)彌補(bǔ)了自身血管新生的不足，這也可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方減輕缺血腦區(qū)病理?yè)p傷，改善缺血后神經(jīng)行為學(xué)障礙的因素之一。從分子生物水平，Nrf2蛋白表達(dá)水平在腦缺血損傷d 1即開(kāi)始升高，d 3到達(dá)高峰，隨后逐漸下降，證明Nrf2在缺血性損傷早期即被激活，但Nrf2mRNA在腦缺血損傷后各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化的表達(dá)，這與Nrf2蛋白的表達(dá)不相一致，這提示Nrf2調(diào)控并非發(fā)生于基因轉(zhuǎn)錄水平，HO-1蛋白及mRNA早期表達(dá)不明顯，表達(dá)升高在Nrf2表達(dá)高峰之后的d 7，因此推測(cè)下游調(diào)控的抗氧化和解毒酶HO-1的表達(dá)在Nrf2誘導(dǎo)下發(fā)生。補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方上調(diào)了Nrf2的表達(dá)且促進(jìn)了其下游基因H0-1的表達(dá)，且作用時(shí)間與血管新生的時(shí)相基本一致，推測(cè)該方通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)途徑發(fā)揮對(duì)腦缺血后血管新生調(diào)控作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方與補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方藥效學(xué)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于補(bǔ)陽(yáng)還五湯精簡(jiǎn)方采用的現(xiàn)代制備工藝和設(shè)備能更大程度的將藥材中的有效成分溶出，在不改變藥效藥理作用的前提下具有有效節(jié)約中藥資源，改善傳統(tǒng)水煎液的服用不便等優(yōu)勢(shì)，為中藥現(xiàn)代化發(fā)展方向提供參考。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)完成于湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中得到該實(shí)驗(yàn)室全體老師的指導(dǎo)及同學(xué)的協(xié)助，在此表示感謝。)

參考文獻(xiàn):

［1］Afonyushkin T，Oskolkova O V，Philippova M，et al．Oxidized phospholipids regulate expression of ATF4 and VEGF in endothelial cells via NRF2-dependent mechanism novel point of convergence between electrophilic and unfolded protein stress pathway ［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010; 30( 5) : 1007－13．

［2］Uno K，Prow T W，Bhutto I A，et al．Role of Nrf2 in retinal vascular development and the vaso-obliterative phase of oxygen-induced retin-opathy［J］．Exp Eye Res，2010; 90( 7) : 493－500．

［3］Tongers J，Knapp J W，Korf M，et al．Haeme oxygenase promotes progenitor cell mobilization，neovascularization and functional recovery after critical hindlimb ischaemia in mice［J］．Cardiovasc Res，2008，78( 9) : 294－300．

［4］Ryter S W，Morse D，Chol A M．Carbon monoxide and bilirubin: potential therapies for Pulmonary for pulmonary /vascular injury and disease［J］．Am J Respir Cell Molbiol，2007，36( 2) : 175－82．

［5］夏相宜，劉芳，佘顏，等．腦健膠囊對(duì)MCAO大鼠腦水腫及梗死面積的影響［J］．中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29( 4) : 532－4．

［5］Xia X Y，Liu F，She Y，et al．Effect of Naojian Capsule on Encephaledema，Area of Cerebral Infarction and Body Quality in MCAO Rats［J］．China J Chin Med，2014，29( 4) : 532－4．

［6］劉青萍．補(bǔ)陽(yáng)還五精簡(jiǎn)方腦健片治療腦缺血后腦損傷的譜效關(guān)系和藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型研究［D］．長(zhǎng)沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2014，5．

［6］Liu Q P．Thin recipe of Buyang Huanwu Decoction( NAOJIAN tablets) in the treatment of cerebral ischemia injury spectrum effect relationship and pharmacokinetics mathematical model Research ［D］．Changsha: Hunan University of Chinese Medicine．2014，5．

［7］Nagasawa H，Kogure K．Correlation between cerebral blood and histologic changes in a new rat model of cerebral artery occlusion stroke［J］．Stroke，1989，20( 6) : 1037．

［8］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20( 1) : 84－91．

［9］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al．Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］．Stroke，1986，17( 3) : 472－6．

［10］李靈娟．microRNA-376b-5p對(duì)腦缺血后血管新生的調(diào)控作用及機(jī)制研究［D］．長(zhǎng)沙:中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，2014，5．

［10］Li L J．The regulation role of microRNA-376b-5p on angiogenesis after cerebral ischemia and mechanism［D］．Changsha: Central South University，2014，5．

［11］孫笑．血管增生促進(jìn)缺血損傷腦內(nèi)神經(jīng)血管單元重構(gòu)的細(xì)胞機(jī)制研究［D］．上海:復(fù)旦大學(xué)，2013，5．

［11］Sun X．Cellular mechanisms of vascular proliferation in the reconstruction of nerve cells in the brain of ischemic injury［D］．Shanghai: Fudan University，2013，5．

［12］Wei L，F(xiàn)raser J L，Lu Z Y，et al．Transplantation of hypoxia preconditioned bone marrow mesenchymal stem cells enhances angiogenesis and neurogenesis after cerebral ischemia in rat［J］．Neurobiol Dis，2012，46( 3) : 635－45．

［13］常麗萍，張秋燕，韓建科，等．通心絡(luò)超微粉對(duì)缺血性腦卒中大鼠微血管新生影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28 ( 7) : 1015－8．

［13］Chang L P，Zhang Q Y，Han J K，et al．Experimental study on the interventional effects of Tongxinluo supermicropowder on angiogenesis of ischemic stroke rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2012，28 ( 7) : 1015－8．

［14］Ergul A，Alhusban A，F(xiàn)agan S C．Angiogenesis: A harmonized target for recovery after stroke［J］．Stroke，2012，43( 8) : 2270－4．

［15］Dhakshinamoorthy S，Jaiswal A K．Functional characterization and role of Nrf2 in antioxidant response element-mediated expression and antioxidant induction of NAD( P) H: quinine oxidoreductasel gene［J］．Oncogene，2001，20( 29) : 3906－17．

［16］Ogborne R M，Rushworth S A，O’Connell M A．Epigallocatechin activates haem oxygenase-1 expression via protein kinase C deta and Nrf2［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008，373( 9) : 584 －8．

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

Effects of thin recipe of Buyang Huanwu Decoction on angiogenesis and signal pathway of Nrf2/HO-1 after cerebral ischemic injury in rat

SHE Yan1，WANG Yu-hong2，SHAO Le2，XIA Xiang-yi2，LIU Fang2，CAI Guang-xian2
( 1. Medical College，Hunan University of Traditional Chinese Medicine; 2. Training Bases，Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincel and Ministry，Changsha 410208，China)

Abstract:AimTo observe the effects of thin recipe of Buyang Huanwu Decoction on angiogenesis and the signal pathway of Nrf2/HO-1 after cerebral ischemic injury in rats．MethodsTotally 120 SD rats were randomly divided into four groups: sham operation group，model group，Buyang Huanwu Decoction group and thin recipe of Buyang Huanwu Decoction group．The focal cerebral ischemia rat model was established by middle cerebral arterial occlusion．Each group was treated with corresponding treatment．Each group wasbook=128,ebook=137detected after cerebral ischemia for day 1，day 3 and day 7，respectively．Immunohistochemical method was used to detect the plasma levels of factor VIII related antigen( vWF)，determination of microvessel density ( MVD)．The expression of Nrf2，HO-1 gene and protein in brain tissues was detected by Real-Time PCR ( RT-PCR) and Western blot．Results①Compared with sham-operation group，the expression of vWF in the model group was significantly increased on day 3( P ＜0. 05)．Compared with model group，the expression levels increased differently in each drug group on day 7 ( P＜0. 05)．②The expression of Nrf2，HO-1 gene and protein in sham operation group showed a small amount of gamma expression．Compared with sham operation group at the same time point，the expression of Nrf2 protein was significantly increased on day 3( P＜0. 01)．Compared with model group at the same time point，the Nrf2mRNA and protein expression was upregulated in each drug group．The Nrf2mRNA on day 1，the Nrf2 protein on day 1 and day 7 were significantly increased( P＜0. 01)．Compared with sham operation group at the same time point，the expression of HO-1mRNA and protein in the model group was significantly increased on day 7( P＜0. 05)．Compared with model group at the same time point，the HO-1mRNA on day 3，the HO-1 protein on day 3 and day 7 in each drug group were significantly increased ( P＜0. 05，P＜0. 01)．Conclusions The thin recipe of Buyang Huanwu Decoction promotes brain angiogenesis after ischemia．The effect may be related wih the expression of Nrf2/HO-1 signal pathway．

Key words:thin recipe of Buyang Huanwu Decoction; angiogenesis; nuclear factor-erythroid 2 related factor 2 ( Nrf2) ; heme oxygenase-1 ( HO-1) ; von willebrand factor related antigen ( vWF ) ; microvessel density ( MVD)

作者簡(jiǎn)介:佘顏( 1982－)，女，博士，講師，研究方向:心腦血管疾病的防治，E-mail: sheyan21@ sina．com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃( 973計(jì)劃)項(xiàng)目( No 2012 CB723503) ;湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計(jì)劃一般項(xiàng)目( No 2013SK3107) ;湖南省中醫(yī)內(nèi)科學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金( No ZYNK201406)

收稿日期:2015－09－02，修回日期: 2015－11－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0123－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．026