小麥TaGAPC定點突變體基因載體構(gòu)建及其原核表達

郭子平,翟清華,曾令鋒,鄧西平,楊淑慎

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院,陜西 楊凌　712100;2.西北農(nóng)林科技大學 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌　712100)

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小麥TaGAPC定點突變體基因載體構(gòu)建及其原核表達

郭子平1,翟清華1,曾令鋒1,鄧西平2,楊淑慎1

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院,陜西 楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學 黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,陜西 楊凌712100)

摘要：為了研究催化活性半胱氨酸Cys154、Cys158殘基對小麥細胞質(zhì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶(TaGAPC)蛋白酶活性的影響,利用重疊延伸PCR法分別將這2個位點的半胱氨酸突變成絲氨酸,并分別連入pET28a(+)原核表達載體。在25 ℃條件下，TaGAPC及其定點基因TaCys154S/TaCys158S經(jīng)0.25 mmol/L IPTG誘導后高效表達,SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果顯示,目標重組蛋白均為可溶性且大小約為40 kDa,與預測結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上,經(jīng)超聲波破菌及鎳柱純化獲得3種純化重組蛋白。這為后續(xù)TaGAPC及其定點突變體蛋白酶活性測定及活性位點分析提供試驗材料。

關(guān)鍵詞：TaGAPC;重疊延伸PCR;定點突變;原核表達;蛋白純化

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為糖酵解反應的一種關(guān)鍵酶,在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶Ⅰ)和無機磷酸鹽存在的情況下,催化3-磷酸-甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油醛[1]。GAPDH普遍存在于原核和真核生物中,具有高度種屬保守序列[2-3]。長期以來,GAPDH由于在同種組織或細胞中相對恒定的表達量,所以一直被當作“管家基因”和內(nèi)參[4]。然而近年來大量研究發(fā)現(xiàn),GAPDH除參與糖酵解反應外,還參與許多其他代謝過程,是一種多功能蛋白質(zhì)。在哺乳動物細胞中,GAPDH作為一種介導細胞質(zhì)和細胞核之間信息傳遞的穿梭蛋白,其廣泛的生理功能涉及DNA復制與修復、基因轉(zhuǎn)錄、細胞凋亡、前體tRNA的運輸、組蛋白基因的表達調(diào)控、端粒結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、核膜融合和微管成束等[5-9]。然而有關(guān)植物GAPDH參與非糖酵解途徑的功能研究則不甚清楚。

在高等動植物中,局部序列比對顯示GAPDH蛋白底物結(jié)合位點區(qū)的第150-161的氨基酸序列高度保守,而位于第154位(Cys154)、第158位(Cys158)的半胱氨酸Cys(相應在擬南芥中的編號分別為Cys149和Cys153)是GAPDH蛋白酶催化活性位點[10]。GAPDH蛋白活性位點的Cys殘基巰基易受不同種類的翻譯后氧化還原修飾(PTMs)以響應不同的ROS-和RNS-依賴的氧化還原信號[11]。GAPDH蛋白的PTMs包括磺酸化、亞硝基化和谷胱甘肽化等,這些修飾不但影響GAPDH酶活性導致其部分或全部失活,并且進一步影響GAPDH與其他蛋白的相互作用,導致GAPDH蛋白定位改變,引發(fā)其多樣性功能[10,12-13]。在擬南芥中,細胞質(zhì)AtGAPC (AtGAPC1和AtGAPC2)活性位點半胱氨酸殘基巰基S-亞硝基化導致蛋白可逆失活[14-15],而AtGAPC1酶活性嚴格依賴催化Cys149,并且該殘基對H2O2極為敏感,但定點突變Cys153對酶活性幾乎無影響[16]。H2O2通過修飾活性位點的Cys殘基巰基促進AtGAPC與磷脂酶Dδ(Phospholipase Dδ,PLDδ)的相互作用,進而介導響應ABA和水分脅迫[17]。在粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)中,GAPDH的Cys殘基被H2O2瞬時氧化后促進GAPDH與MAPK途徑中Mcs4相互作用,但是點突變Cys152造成該相互作用減弱,進而影響H2O2脅迫信號傳導[18]。Piattoni等[19]推測小麥細胞質(zhì)TaGAPC蛋白活性位點的Cys154可能至少是受H2O2等氧化作用的一個重要氨基酸,但并未有后續(xù)試驗對該推測及另外一個位點Cys158對酶活性的影響進行證實和研究。

本試驗在已構(gòu)建成功的pMD19T-TaGAPC載體的基礎(chǔ)上,通過重疊延伸PCR技術(shù)分別獲得TaGAPC保守區(qū)活性位點Cys154、Cys158定點突變基因全長TaCys154S、TaCys158S,然后構(gòu)建原核表達載體,在大腸桿菌中用IPTG誘導表達得到可溶性的重組蛋白并進行了純化,這為后續(xù)TaGAPC及其定點突變體蛋白酶活性測定及TaGAPC催化活性位點的分析提供論證基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試劑和載體及菌種

高保真DNA聚合酶pfu、DNA聚合酶Taq、T4DNA 連接酶、IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、克隆載體pGEM-T easy、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自TIANGEN公司;限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ、DNA分子量標記DL15000和DL2000購自THERMO公司;Ni-Agrose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)購自CWBIO公司;大腸桿菌DH5α菌株和pMD19T載體為西北農(nóng)林科技大學生命科學學院楊淑慎教授實驗室保存。pET28a(+)原核表達質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學生命科學學院陳坤明教授惠贈。

1.2引物

所有引物均合成于北京奧科鼎盛生物科技有限公司,其序列如下(表1)。

表1　本試驗所用引物

注：斜體部分為保護堿基；下劃線部分為酶切位點；粗體部分為引入的定點突變堿基。

Note:Italics sections are protective bases；Underlined sequences are restriction enzyme sites；Bold sequences are the site-directed bases.

1.3試驗方法

1.3.1pET28a(+)-TaGAPC表達載體的構(gòu)建以野生型靶基因TaGAPC(NCBI登錄號:N° EF592180,基因全長1 014 bp,已克隆在pMD19T載體上,重組質(zhì)粒命名為pMD19T-TaGAPC)為模板,設計引物TaGAPC-for、TaGAPC-rev擴增TaGAPC基因,PCR擴增體系為20 μL:TaqBuffer 4 μL,MgCl21.5 μL,dNTP 0.8 μL,正、反向引物各0.5 μL,模板1 μL,Taq聚合酶0.2 μL,ddH2O 11.5 μL;PCR反應體系為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應完成后在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR產(chǎn)物,DNA膠回收試劑盒純化回收位置正確的條帶。之后對純化的PCR產(chǎn)物、pET28a(+)質(zhì)粒進行NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切并連接。連接反應體系為10 μL:TaGAPC片段6 μL、pET28a(+)載體2.0 μL、T4Buffer 1 μL、T4連接酶1 μL輕柔混勻后16 ℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后涂布于LB平板上(含100 mg/mL卡那霉素)培養(yǎng)至長出單菌落,挑取單菌落進行PCR檢測和提取重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證,并送交北京奧科公司測序驗證。

1.3.2pGEM-T easy-TaCys154S/TaCys158S載體的構(gòu)建利用重疊延伸PCR法將TaGAPC基因第154,158位的半胱氨酸殘基突變成絲氨酸[20-22]。以TaGAPC基因為模板,采用pfu聚合酶,在第一輪PCR中,以TaGAPC-for/TaCys154S-down、TaCys154S-up/TaGAPC-rev,或TaGAPC-for/TaCys158S-down、TaCys158S-up/TaGAPC-rev這4對引物分別擴增TaCys154S/TaCys158S基因小片段。PCR反應體系為50 μL:10×pfu Buffer(+MgSO4) 5 μL,dNTP 5 μL,正、反向引物各1 μL,模板1 μL,pfu聚合酶1 μL,ddH2O 36 μL。反應參數(shù)為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸40 s,32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應完成后在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR產(chǎn)物,DNA膠回收試劑盒純化回收位置正確的條帶。

以上述分別獲得的TaCys154S/TaCys158基因小片段為模板,進行第二輪PCR反應合成相應的全長片段。PCR反應體系為20 μL:10×pfu Buffer(+MgSO4) 5 μL,dNTP 1 μL,TaGAPC-for、TaGAPC-rev引物各0.5 μL,模板分別為2 μL/1 μL,pfu高保真聚合酶0.2 μL,ddH2O 9.8 μL。反應參數(shù)為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應完成后電泳檢測PCR產(chǎn)物,取條帶位置正確的PCR產(chǎn)物進行末端加尾反應,體系為100 μL:4 μL dNTP,0.5 μLTaq聚合酶,95.5 μL PCR產(chǎn)物,于72 ℃,PCR延伸15 min,反應完成后DNA膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物。

將TaCys154S/TaCys158S基因全長片段分別連接至pGEM-T easy載體。將基因全長片段5.7 μL、pGEM-T easy載體0.3 μL、T4Buffer 3 μL、T4連接酶1 μL共10 μL輕柔混勻后16 ℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后涂布于LB平板上(含100 mg/mL卡那霉素,24 mg/mL IPTG,及20 mg/mL X-gal),37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR檢測和提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證,將陽性質(zhì)粒送交北京奧科公司測序。

1.3.3pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S原核表達載體的構(gòu)建對重組質(zhì)粒pGEM-T easy-TaCys154S/TaCys158S進行NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切試驗。雙酶切體系為50 μL:10×Tango Buffer 5 μL,NdeⅠ0.5 μL,BamHⅠ0.5 μL,質(zhì)粒20 μL,ddH2O 24 μL。酶切反應于37 ℃水浴中保持12 h后,利用DNA膠回收試劑盒純化回收位置正確的條帶。然后將其連接到同樣經(jīng)NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切的pET28a(+)載體。連接反應體系為10 μL:TaCys154S/TaCys158S基因全長片段6 μL、pET28a(+)載體2.0 μL、T4Buffer 1 μL、T4連接酶1 μL輕柔混勻后16 ℃連接過夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,然后涂布于LB平板上(含100 mg/mL卡那霉素),37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取單克隆進行菌落PCR檢測和提取質(zhì)粒進行雙酶切驗證,將陽性質(zhì)粒送交北京奧科公司測序。

1.3.4TaGAPC和TaCys154S/TaCys158S基因的原核表達純化將已構(gòu)建的原核表達載體pET28a(+)-TaGAPC/TaCys154S/TaCys158S分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)進行誘導表達,方法參照[16,23],但略有優(yōu)化。在37 ℃培養(yǎng)的LB平板(含100 mg/mL卡那霉素)上挑取陽性單菌落進行擴大培養(yǎng),至OD600為0.4~0.6,于25 ℃,0.25 mmol/L IPTG誘導表達12 h,6 500 r/min離心收集菌體,25 mmol/L Tris-HCl(pH值7.5)清洗2次后放于-80 ℃保存。超聲波工作條件為:250 W,工作4 s,間歇6 s,共1 h。SDS-PAGE電泳檢測表達蛋白均為可溶性蛋白,10 400 r/min離心2次取上清,使用Ni-Agrose His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)純化蛋白,按照說明書中的步驟操作。SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化效果。

2結(jié)果與分析

2.1pGEM-T-easy-TaCys154S/TaCys158S克隆重組載體的構(gòu)建

通過重疊延伸PCR法在TaGAPC基因中引入定點突變,即將Cys154、Cys158殘基定點突變成絲氨酸,之后連接pGEMT-easy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌并培養(yǎng)單克隆。對菌落PCR檢測為陽性的單克隆進行測序，結(jié)果顯示定點突變成功。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、BamH Ⅰ雙酶切的電泳檢測結(jié)果如圖1所示。

2.2 pET28a(+)-TaGAPC/TaCys154S/TaCys158S原核表達重組載體的構(gòu)建

對擴增的TaGAPC產(chǎn)物及重組質(zhì)粒pGEMT-easy-TaCys154S/TaCys158S,分別經(jīng)NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切后電泳檢測,并分別純化回收目的條帶,將其連接到經(jīng)同樣NdeⅠ、BamHⅠ雙酶切的pET28a(+)表達載體。選取菌落PCR檢測為陽性的單菌落,搖菌提取質(zhì)粒進行雙酶切及測序驗證,得到約1 014 bp片段(圖2),與預期大小一致,說明重組原核表達載體pET28a(+)-TaGAPC/TaCys154S/TaCys158S構(gòu)建成功。

M.DL15000分子量標準;1.pGEM-T easy-TaCys154S

A:M.DL15000分子量標準;1.pET28a(+)-TaGAPC雙酶切片段;B:M.DL2000分子量標準;1.pET28a(+)-TaCys154S雙酶切片段;2.pET28a(+)-TaCys158S雙酶切片段。

A:M.DL15000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments of pET28a(+)-TaGAPC;B:M.DL2000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments of pET28a(+)-TaCys154S;2.Restriction enzyme fragments of pET28a(+)-TaCys158S.

圖2重組質(zhì)粒pET28a(+)-TaGAPC(A)和

pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S(B)酶切鑒定

Fig.2Restriction enzyme digestion of the recombinant

expression vectors pET28a(+)-TaGAPC(A) and

pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S(B)

2.3TaGAPC和TaCys154S/TaCys158S重組蛋白的原核表達及純化

將TaGAPC及其TaCys154S/TaCys158S原核表達重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),于37 ℃條件下,200 r/min搖菌至OD600為0.4～0.6,在25 ℃條件下,0.25 mmol/L ITPG誘導表達12 h,離心收集菌體,經(jīng)超聲波破菌及Ni-IDA柱純化得到可溶性重組蛋白(圖3)。從圖3可看出,純化蛋白分子量約為40.0 kDa(純化蛋白N端含6×His標簽),與預期結(jié)果一致,并且獲得較高純度的重組蛋白。

M.蛋白Marker(LOW);WT.TaGAPC蛋白;

3討論

作為糖酵解代謝的一種關(guān)鍵酶,GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化為生命活動提供能量[1]。GAPDH基因幾乎在各組織或器官中相對穩(wěn)定且高水平表達,故被廣泛用作標準化內(nèi)參研究生物體內(nèi)其他基因和蛋白的表達[4,24]。但最近大量研究表明,GAPDH 是一種多功能蛋白質(zhì),除參與糖酵解以外,還參與其他非生物代謝過程[5-9]。相對于動物細胞僅含有一種GAPDH同工酶,高等植物GAPDH包含4種由不同基因編碼的同工酶,不同的同工酶由于其亞細胞定位不同導致其參與的生理過程具有多樣性[7]。

在高等植物中,位于GAPDH底物結(jié)合區(qū)約150-161的氨基酸序列高度保守,而位于該保守區(qū)的活性殘基Cys154、Cys158對GAPDH酶活性及調(diào)節(jié)GAPDH參與非糖酵解代謝過程至關(guān)重要[10]。在擬南芥中,細胞質(zhì)AtGAPC1活性嚴格依賴Cys149,該位點的突變導致該酶幾乎無活性,而殘基Cys153的突變對酶活性影響甚微[16]。小麥細胞質(zhì)GAPDH底物(G3P和NAD+)結(jié)合試驗表明,Cys154可能至少是受氧化作用的活性位點之一,該研究與在人類或擬南芥GAPDH同源酶中的發(fā)現(xiàn)相同[19]。GAPDH蛋白活性位點的Cys殘基巰基容易受生理或體外H2O2、NO、GSH等作用發(fā)生氧化還原修飾,如磺酸化、硝基化和谷胱甘肽化等,導致GAPDH蛋白可逆或不可逆失活,而失活的GAPDH通過與其他蛋白相互作用改變其亞細胞定位,參與不同生理過程[12-13,17-18]。

本研究在獲得小麥細胞質(zhì)TaGAPC基因cDNA全長序列的基礎(chǔ)上,采用重疊延伸PCR法對其催化活性位點的Cys154、Cys158殘基分別進行定點突變,連接pGEM-T easy克隆載體進行測序等驗證突變成功,并且未引入其他突變位點。然后構(gòu)建了原核表達載體pET28a(+)-TaCys154S/TaCys158S,并采用鎳柱純化技術(shù)獲得可溶性重組蛋白,為后續(xù)TaGAPC的Cys154、Cys158這2個重要半胱氨酸活性位點分析及研究TaGAPC在小麥細胞中參與的調(diào)控機制提供試驗材料。本研究在TaGAPC基因中引入突變位點時采用了重疊延伸PCR技術(shù)。該技術(shù)運用廣泛、靈活,不受突變位置及突變類型的限制,可對DNA片段進行定點突變甚至多點突變,在闡明基因的調(diào)控機理、改造蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等分子生物學領(lǐng)域中具有潛在的應用價值[22]。

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Construction ofTaGAPCSite-directed Mutagenesis Gene Vector and Prokaryotic Expression Analysis from Wheat

GUO Ziping1,ZHAI Qinghua1,ZENG Lingfeng1,DENG Xiping2,YANG Shushen1

(1.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling712100,China;2.State Key Laboratory of Soil Erosion and Dryland Farming on Loess Plateau,Northwest A&F University,Yangling712100,China)

Abstract：In order to elucidate the roles of catalytic active Cys154,Cys158in Triticum aestivum L.cytoplasmic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (TaGAPC),these two cysteins were site-directed mutated into serine by overlap-extension PCR.Then recombinant prokaryotic expression vectors of TaGAPC and its mutants TaCys154S/TaCys158S were constructed and transformed into E.coli BL21.The recombinant protein were induced by 0.25 mmol/L IPTG at 25 ℃ and subsequently purified by Ni2+-IDA column.These researches could lay the foundation for the enzyme activity assay of TaGAPC and its mutants TaCys154S/TaCys158S and cysteine active sites.

Key words:TaGAPC;Overlap-extension PCR;Site-directed mutagenesis;Prokaryotic expression;Protein purification

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.008

中圖分類號：Q78;S512.03

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0046-05

作者簡介：郭子平(1989-),男,河南商丘人,在讀碩士,主要從事植物逆境細胞分子生物學研究。通訊作者：楊淑慎(1956-),女,陜西黃陵人,教授,博士,主要從事植物抗逆生理、植物細胞培養(yǎng)工程方面的研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(31271625);黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點實驗室專項 (10502)

收稿日期：2015-11-27