甘蔗條紋花葉病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及自激活檢測(cè)

翟玉山,彭　磊,楊永慶,鄧宇晴,程光遠(yuǎn),鄭艷茹,徐景升

(農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建農(nóng)林大學(xué),福建 福州　350002)

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甘蔗條紋花葉病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體的構(gòu)建及自激活檢測(cè)

翟玉山,彭磊,楊永慶,鄧宇晴,程光遠(yuǎn),鄭艷茹,徐景升

(農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建農(nóng)林大學(xué),福建 福州350002)

摘要：為探索甘蔗條紋花葉病毒與甘蔗的互作機(jī)制,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技術(shù)克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的編碼區(qū),構(gòu)建到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7上,獲得了pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP 和pGBKT7-VPg4個(gè)誘餌載體。結(jié)果顯示,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生長(zhǎng)良好,表明重組誘餌質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上長(zhǎng)出白色菌落未變藍(lán),在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上不能生長(zhǎng),表明重組誘餌質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物對(duì)MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C報(bào)告基因無(wú)自激活作用。構(gòu)建的誘餌表達(dá)載體可以作為誘餌用于文庫(kù)篩選,為探索SCSMV侵染機(jī)制和發(fā)病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘蔗條紋花葉病毒;HC-Pro;P3N-PIPO;CP;VPg;誘餌載體;酵母雙雜交

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是我國(guó)和全世界主要的糖料作物和能源作物。甘蔗花葉病(Sugarcane mosaic disease,SMD)是嚴(yán)重危害甘蔗生產(chǎn)的病毒性病害之一,嚴(yán)重影響甘蔗的產(chǎn)量和品質(zhì)。甘蔗感病后,病株葉片出現(xiàn)黃綠相間的斑紋、分蘗減少、生長(zhǎng)緩慢、節(jié)間變短、品質(zhì)下降,產(chǎn)量損失可達(dá)3%~50%[1-3]。SMD最早于1892年在爪哇被發(fā)現(xiàn)[4],在20世紀(jì)20年代,SMD幾乎摧毀了阿根廷、巴西和美國(guó)的甘蔗產(chǎn)業(yè)[5-6]。甘蔗花葉病的病原主要有甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花葉病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)和甘蔗條紋花葉病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)。其中SCMV和SrMV屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)Y病毒屬(Potyvirus)。SCSMV于1978年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[7],2012年被國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)歸為馬鈴薯Y病毒科禾草毒屬(Poacevirus)(http://www.ictvonline.org)。SCSMV主要分布在中國(guó)、孟加拉、印度、日本、印度尼西亞、巴基斯坦等地[8],曾在我國(guó)云南蔗區(qū)大面積爆發(fā)[9]。SCSMV發(fā)病率達(dá)到50%時(shí),甘蔗產(chǎn)量損失達(dá)到20%[10]。

盡管SCSMV與SCMV、SrMV在分類上屬于不同的屬,但是基因組結(jié)構(gòu)極為相似,均為單鏈正義RNA病毒,編碼11個(gè)功能蛋白,從5′至3′分別是P1、HC-Pro、P3、P3N-PIPO、6K1、CI、6K2、NIa-Vpg、NIa-Pro、Nib和CP[11-14]。其中,P3N-PIPO是由P3蛋白N端與位于P3順?lè)醋觾?nèi)部以+2 移碼方式編碼的PIPO組成,移碼發(fā)生在P3內(nèi)部的高度保守序列G1-2A6-7,機(jī)制不明[15]。植物病毒作為一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生物,必須借助寄主的某些特異蛋白,才能在寄主體內(nèi)完成復(fù)制、翻譯、運(yùn)動(dòng)等基本生命活動(dòng),建立系統(tǒng)性侵染[14,16]。馬鈴薯Y病毒屬病毒在寄主體內(nèi)建立系統(tǒng)性侵染的過(guò)程中,HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg是關(guān)鍵因子,發(fā)揮了極其重要的作用。HC-Pro在病毒基因組翻譯、蛋白加工中發(fā)揮重要作用,具有HC-Pro/P3特異切割位點(diǎn)識(shí)別功能[17]。HC-Pro的N端還參與調(diào)控病毒的蚜傳、致病性、病毒復(fù)制和積累的過(guò)程[18];中間區(qū)域與病毒長(zhǎng)距離運(yùn)輸、協(xié)生以及抑制寄主植物的基因沉默效應(yīng)相關(guān)[19-21];C端則在病毒細(xì)胞間移動(dòng)中起作用[22]。突變PIPO編碼區(qū)而不改變P3蛋白,突變毒株喪失胞間移動(dòng)功能,無(wú)法完成侵染[23]。進(jìn)一步研究證實(shí)P3N-PIPO與CI互作介導(dǎo)了病毒胞間移動(dòng),表明P3N-PIPO具有運(yùn)動(dòng)蛋白功能[24]。VPg在病毒的侵染過(guò)程中執(zhí)行多種功能,可作為病毒RNA復(fù)制的引物,是病毒復(fù)制的必需蛋白[25-26];還可以充當(dāng)帽子結(jié)構(gòu),通過(guò)與寄主的真核翻譯起始因子4E(Eukaryotic translation initiation factor 4E,eIF4E)互作,啟動(dòng)病毒基因組的翻譯[27-28];此外,VPg還參與了病毒的移動(dòng)[29-30]。CP是唯一的結(jié)構(gòu)蛋白,可分為3個(gè)功能區(qū)域:暴露在病毒粒子表面的N端、C端[31]和中間區(qū)域[32]。蛋白結(jié)構(gòu)域研究表明,CP蛋白高度保守的三組份氨基酸模體(Asp-Ala-Gly,DAG)會(huì)影響病毒組裝和蚜蟲傳播病毒的能力,特別是其N末端區(qū)域DAG模體的變異往往使SMV喪失蚜傳功能[33]。另外,CP還參與了病毒的胞間移動(dòng)[14]。

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system,Y2HS)是Fields 和Song[34]建立的一種可用于檢測(cè)和篩選與目標(biāo)蛋白具有相互作用的高通量技術(shù),是目前研究病毒因子間、病毒因子與寄主因子互作最有效的技術(shù)。Y2HS已被成功應(yīng)用于病毒蛋白間和病毒與寄主間的互作分析[35-36],如研究蕪菁花葉病毒[14-15](Turnipmosaicpotyvirus,TuMV)、大豆花葉病毒[37](Soybeanmosaicvirus,SMV)、胡蔥黃條病毒[38](Shallotyellowstripevirus,SYSV)和高粱花葉病毒[39](Sorghummosaicvirus,SrMV)等病毒與寄主蛋白之間互作關(guān)系。為研究SCSMV對(duì)甘蔗的侵染機(jī)制,本研究構(gòu)建了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因的誘餌載體,并轉(zhuǎn)化酵母進(jìn)行自激活活性和毒性檢測(cè),為分離與SCSMV互作的甘蔗因子基因,研究SCSMV編碼蛋白之間以及SCSMV編碼蛋白與寄主因子互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1主要試劑

試驗(yàn)所需內(nèi)切酶NcoⅠ、BamH Ⅰ、NdeⅠ、EcoR Ⅰ、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司,100 bp DNA Ladder、EXTaq酶、pMD19-T和RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0購(gòu)自TaKaRa公司,RNA提取試劑TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司,感受態(tài)大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司,引物合成及序列測(cè)定由上海生工生物工程公司完成,酵母菌株Y2HGold、載體pGBKT7和酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基均購(gòu)自Clontech公司。

1.2病毒材料

SCSMV分離物采集自福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗試驗(yàn)田中具有明顯甘蔗花葉病癥狀的熱帶種Badila葉片。稱取感病甘蔗葉片2.0 g,在液氮中充分研磨后,用TRIzol試劑提取總RNA,用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,確定無(wú)降解。按照RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,使用特異性引物(表1)檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證后為SCSMV的分離物,置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因克隆

依據(jù)GenBank上公布的SCSMV參考序列(IND671,JN941985.1;TPT,GQ246187.1;THA-NP3,JN163911.1;ID,JF488066.1;JP2,JF488065.1;JP1,JF488064.1;PAK,NC_014037.1)設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)的特異引物(表1),以SCSMV分離物cDNA為模板,對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTPs 2.0 μL,前引物(10 μmol/L)1.0 μL,后引物(10 μmol/L)1.0 μL,EXTaq酶(5 U/μL)0.125 μL,ddH2O 17.375 μL,模板(cDNA)1.0 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1　試驗(yàn)中用到的PCR引物

1.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后與 pMD19-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,37 ℃ 培養(yǎng)12~16 h,挑取白色克隆進(jìn)行菌液 PCR 鑒定,陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒并雙酶切,分別回收HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg目的片段,用T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切酵母表達(dá)載體 pGBKT7 連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α,進(jìn)行陽(yáng)性克隆子篩選,提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒雙酶切檢測(cè),陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆即為重組誘餌質(zhì)粒。

1.5誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)及快速篩選

參照Clontech公司酵母雙雜交手冊(cè)進(jìn)行酵母菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將分別轉(zhuǎn)化pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg的 Y2HGold 酵母菌涂布于SD/-Trp平板,倒置放30 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)2~4 d,挑取 SD/-Trp平板上菌落生長(zhǎng)良好,直徑在2~3 mm 菌落于2 mL無(wú)菌離心管中,加入SD/-Trp液體酵母培養(yǎng)基1 mL(卡那霉素為50 μg/mL),并用封口膜封口,200 r/min,30 ℃培養(yǎng) 8~10 h,進(jìn)行PCR鑒定。方法如下:吸取200 μL活化的酵母菌液于PCR管中,5 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入30 μL 0.2%SDS,渦旋振蕩數(shù)秒鐘,然后沸水浴中處理5 min,14 000 r/min離心30 s,取上清液 1 μL 作為 PCR反應(yīng)的模板。使用pGBKT7載體上的測(cè)序引物(pGBKT7-F、pGBKT7-R,表1),進(jìn)行 PCR 鑒定。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6誘餌蛋白毒性檢測(cè)

分別將轉(zhuǎn)化重組誘餌載體pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP、pGBKT7-VPg和空載體pGBKT7的酵母菌Y2HGold涂布100 μL(3個(gè)梯度100,10-1,10-2)稀釋液于 SD/-Trp平板,倒置放30 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)2~4 d,分別挑取 SD/-Trp平板上生長(zhǎng)良好,直徑在2~3 mm的菌落,用10 mL SD/-Trp 液體酵母培養(yǎng)基(卡那霉素為50 μg/mL),250 r/min,30 ℃培養(yǎng) 22~24 h,分別測(cè)定OD600。

1.7誘餌載體轉(zhuǎn)錄自激活活性的檢測(cè)

參照Clontech公司 Matchmaker TM Gold 酵母雙雜交系統(tǒng)手冊(cè)進(jìn)行[40]。將轉(zhuǎn)化了重組誘餌載體、pGBKT7空載體、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的酵母菌Y2HGold分別點(diǎn)板于SD/-Trp、 SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/X-α-Gal 和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 平板上。倒置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2~4 d,觀察并記錄結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1甘蔗感病葉片總RNA的提取

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定,感病葉片總RNA純度OD260/280=1.95,濃度為1.25 μg/μL。1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示,18S rRNA和28S rRNA條帶清晰,無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象(圖1),表明 RNA純度高,沒(méi)有降解。

M.D2000 DNA Marker;1,2.總RNA。

2.2目的基因擴(kuò)增

經(jīng)特異性引物擴(kuò)增后獲得4種PCR產(chǎn)物,分別是SCSMV-HC-Pro(1 410 bp)、SCSMV-P3N-PIPO(825 bp)、SCSMV-CP(846 bp)和SCSMV-VPg(594 bp),瓊脂糖膠電泳檢測(cè)片段大小與預(yù)期一致(圖2)。測(cè)序后經(jīng)Blast比對(duì)表明均為目的片段序列。

M.100 bp DNA Ladder;1.SCSMV-HC-Pro;2.SCSMV-P3N-PIPO;

2.3誘餌載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

提取上述4種測(cè)序驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒,根據(jù)各自引物上所帶酶切位點(diǎn),分別利用NcoⅠ、BamH Ⅰ、NdeⅠ和EcoR Ⅰ進(jìn)行雙酶切,隨后用T4DNA連接酶連接到誘餌載體pGBKT7上,構(gòu)建好的載體再進(jìn)行雙酶切鑒定,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明載體構(gòu)建成功(圖3)。使用pGBKT7載體上的引物做測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明，4個(gè)片段連接到載體中的方向和讀碼框均正確,分別將這4個(gè)誘餌載體命名為pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg。

M1.D15000+2000 DNA Marker;M2.100 bp DNA Ladder;1.pGBKT7-HC-Pro;2.pGBKT7-P3N-PIPO;3.pGBKT7-CP;4.pGBKT7-VPg。

M1.D15000+2000 DNA Marker;M2.100 bp DNA Ladder;1.pGBKT7-HC-Pro;2.pGBKT7-P3N-PIPO;3.pGBKT7-CP;4.pGBKT7-VPg.

圖3重組誘餌載體雙酶切驗(yàn)證

Fig.3Double restriction enzyme digestion for bait vectors

2.4誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母鑒定

將上述構(gòu)建好的4個(gè)誘餌載體分別轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2HGold中,挑取酵母單菌落培養(yǎng)過(guò)夜并進(jìn)行菌液PCR,PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖4),4種轉(zhuǎn)化后酵母菌落PCR產(chǎn)物條帶大小與靶標(biāo)基因大小一致,說(shuō)明重組誘餌質(zhì)粒載體pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg轉(zhuǎn)化酵母成功。

圖4　誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母PCR檢測(cè)

2.5重組誘餌載體的蛋白毒性檢測(cè)

培養(yǎng)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)有重組誘餌載體的SD/-Trp平板和轉(zhuǎn)有空載體的平板上菌落密集程度相似,生長(zhǎng)均正常,菌落大小均介于2～3 mm。重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP、pGBKT7-VPg和空載體pGBKT7的菌液OD600值分別為1.215,1.193,1.304,1.227,1.189,均超過(guò)了0.8的判斷標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明重組誘餌蛋白對(duì)酵母菌Y2HGold生長(zhǎng)無(wú)毒性,可用于下一步的文庫(kù)篩選。

2.6誘餌蛋白自激活作用的檢測(cè)

將攜帶誘餌載體的酵母菌株點(diǎn)于不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上,試驗(yàn)結(jié)果表明，攜帶誘餌載體的菌株均可在SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),而在SD/-Leu缺陷培養(yǎng)基上只有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照能正常生長(zhǎng)(圖5-A),這是因?yàn)锳D和BD質(zhì)粒載體上分別攜帶有Leu和Trp編碼基因,可以分別合成缺陷的營(yíng)養(yǎng)元素使酵母菌株在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上復(fù)蘇,表明轉(zhuǎn)入酵母菌株的誘餌載體正確。進(jìn)一步利用 SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His缺陷型培養(yǎng)基檢驗(yàn)誘餌蛋白是否對(duì)ADE2 和HIS3 報(bào)告基因具有激活作用。結(jié)果顯示,只有陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGADT7-T+pGBKT7-53可在SD/-Trp/-Ade和 SD/-Trp/-His 營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上復(fù)蘇,陰性對(duì)照pGADT7-T+pGBKT7-Lam、重組誘餌載體pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP、pGBKT7-VPg和空載體pGBKT7均不能正常生長(zhǎng)(圖5-B),表明誘餌蛋白對(duì)ADE2 和HIS3報(bào)告基因均無(wú)自激活活性。

A、B、C.圖中自上而下依次為陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、重組誘餌載體

為進(jìn)一步確認(rèn)誘餌蛋白無(wú)自激活活性,減少文庫(kù)篩選過(guò)程中假陽(yáng)性克隆的出現(xiàn),將攜帶重組誘餌質(zhì)粒的菌株分別在SD/-Trp/X-α-gal和SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上進(jìn)行復(fù)蘇檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖5-C),所有菌株均可在SD/-Trp/X-α-gal復(fù)蘇,但僅有陽(yáng)性對(duì)照pGADT7-T+pGBKT7-53變藍(lán)。在含有AbA抗性的平板上,也只有同時(shí)攜帶AD和BD載體且存在互作的pGADT7-T+pGBKT7-53獲得了復(fù)蘇,結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明pGBKT7-HC-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg對(duì)MEL1和AUR1-C報(bào)告基因無(wú)自激活活性。

3討論

SCSMV是甘蔗花葉病的主要病原之一,He等[9]研究表明SCSMV 在云南某些甘蔗主栽區(qū)大范圍流行,部分地區(qū)呈現(xiàn)爆發(fā)趨勢(shì)。闡明病毒的侵染機(jī)制,對(duì)于研究防治策略,篩選培育抗病品種,具有重要意義。在模式植物煙草、擬南芥等上,馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬病毒的侵染機(jī)制已經(jīng)有比較深入的研究[41-42],為研究SCSMV侵染甘蔗的分子機(jī)制提供了良好的借鑒。但是,SCSMV是禾草毒屬的新病毒,有關(guān)SCSMV侵染甘蔗分子機(jī)制的研究基本處于空白狀態(tài)。

近年來(lái),酵母雙雜交技術(shù)在植物病毒學(xué)研究中已逐漸成為一種主要手段,廣泛應(yīng)用于植物病毒蛋白與寄主編碼蛋白之間相互作用的研究,在分析病毒侵染、復(fù)制、細(xì)胞間的運(yùn)動(dòng)和長(zhǎng)距離運(yùn)輸,探討病毒對(duì)植物正常生理功能影響的分子機(jī)制等方面發(fā)揮了重要的作用[35]。HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg蛋白被認(rèn)為在病毒侵染過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,利用Y2HS篩選甘蔗內(nèi)與SCSMV這些蛋白互作的寄主因子,將有可能從甘蔗中分離鑒定出參與病毒沉默抑制、胞間移動(dòng)、長(zhǎng)距離運(yùn)輸和翻譯等重要環(huán)節(jié)的寄主因子基因。2014年,筆者與團(tuán)隊(duì)其他成員合作構(gòu)建了易感甘蔗花葉病的甘蔗 cDNA 文庫(kù)[43],文庫(kù)容量為2.0×107cfu,隨機(jī)挑取的24個(gè)克隆的重組率為100%,cDNA插入片段長(zhǎng)度主要分布在1~2 kb,文庫(kù)質(zhì)量合格,為篩選與SCSMV互作的甘蔗因子基因奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

在利用Y2HS篩選文庫(kù)及研究蛋白之間的互作關(guān)系過(guò)程中,誘餌蛋白的正確表達(dá)至關(guān)重要。一方面,由于某些誘餌蛋白本身可能具有轉(zhuǎn)錄激活的作用,能夠直接激活報(bào)告基因的表達(dá),造成過(guò)多假陽(yáng)性結(jié)果;另一方面,某些誘餌蛋白的表達(dá)可能對(duì)酵母菌株產(chǎn)生毒害作用,將導(dǎo)致酵母細(xì)胞不能正常生長(zhǎng),影響后繼的篩選工作。因此,必須對(duì)誘餌蛋白進(jìn)行毒性與自激活檢測(cè)。本研究中構(gòu)建了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg這4個(gè)基因的誘餌載體,試驗(yàn)結(jié)果表明，這4個(gè)誘餌載體均無(wú)毒性和自激活作用,可以應(yīng)用甘蔗cDNA文庫(kù)篩選和蛋白間的互作研究。本研究為闡明SCSMV侵染機(jī)制奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction and Self-activated Detection of the Baits ofHC-Pro,P3N-PIPO,CPandVPgfromSugarcanestreakmosaicvirusfor Yeast Two Hybrid System

ZHAI Yushan,PENG Lei,YANG Yongqing,DENG Yuqing,CHENG Guangyuan,ZHENG Yanru,XU Jingsheng

(Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding,MOA,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou350002,China)

Abstract：Sugarcane streak mosaic virus (SCSMV) is one of the main pathogens causing mosaic syndrome on sugarcane.Yeast two hybrid system (Y2HS) is the main technique to investigate the mechanism between pathogen with host plant.In order to elucidate the interaction between the SCSMV and sugarcane by Y2HS,the coding sequences of HC-Pro,P3N-PIPO,CP and VPg from SCSMV were cloned into the pGBKT7,respectively,to generate 4 bait vectors,pGBKT7-HC-Pro,pGBKT7-P3N-PIPO,pGBKT7-CP and pGBKT7-VPg.Then the 4 bait vectors were transformed into the yeast strain Y2HGold,respectively.All the Y2HGold strains containing the bait vectors grew well on the SD/-Trp media as the control.It suggested that the proteins encoded by the baits were not toxic to yeast.All these 4 transformed yeast strains developed white but not blue plaques on the SD/-Trp/X-α-gal media.And they could not survive on the SD/-Leu,SD/-Trp/-Ade,SD/-Trp/-His or SD/-Trp/X-α-gal/AbA media,which indicating the bait proteins could not activate the report genes,such as MEL1,ADE2,HIS3 or AUR1-C.These 4 bait vectors constructed in this study could be used to screen the host proteins interacting with them to investigate the molecular mechanism and pathogenesis of SCSMV infection on sugarcane.

Key words:Sugarcane streak mosaic virus;HC-Pro;P3N-PIPO;CP;VPg;Bait vector;Yeast two hybrid system

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.014

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)01-0083-07

作者簡(jiǎn)介：翟玉山(1989-),男,安徽渦陽(yáng)人,在讀碩士,主要從事甘蔗病原侵染分子機(jī)制等方面的研究。通訊作者：徐景升(1973-),男,黑龍江佳木斯人,副研究員,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事甘蔗功能基因組學(xué)、甘蔗生物學(xué)等方面的研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”項(xiàng)目(2013AA102604);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171605;31371688)

收稿日期：2011-10-09