小麥染色體物理圖譜的發(fā)展及應(yīng)用

劉 冰， 劉仁澤， 郝夢琪， 郭長虹， 郭東林

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150025)

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小麥染色體物理圖譜的發(fā)展及應(yīng)用

劉 冰， 劉仁澤， 郝夢琪， 郭長虹， 郭東林*

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150025)

摘要介紹了小麥染色體物理圖譜的繪制及發(fā)展，并綜述了小麥染色體物理圖譜的作用，在此基礎(chǔ)上對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞小麥；染色體；物理圖譜

Development and Application of Wheat Chromosome Physical Map

LIU Bing,LIU Ren-ze,HAO Meng-qi,GUO Dong-lin*et al(Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province,College of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Harbin,Heilongjiang 150025)

AbstractThe drawing method and the development were introduced, and the role of wheat physical map was reviewed, on this basis the application prospect was forecasted.

Key wordsWheat; Chromosome; Physical map

普通小麥?zhǔn)橇扼w作物，由A、B、D 3個染色體組構(gòu)成，基因組龐大且非常復(fù)雜。為了解決此難題，近年來利用特異BAC文庫等技術(shù)分別繪制了多條小麥染色體的物理圖譜。小麥染色體物理圖譜能夠提供功能基因的位置，并為最終獲得小麥的物理圖譜及測序奠定基礎(chǔ)?；蚪M測序為作物改良提供了遺傳工具[1]，如大麥的部分基因組序列已經(jīng)獲得，但重復(fù)基因間區(qū)域并不完全[2]。水稻[3]、高粱[4]及短柄草[5]的基因組已被完整測序，可被用來推斷小麥的基因序列。但由于普通小麥為六倍體，基因組較大，含有的重復(fù)序列較多，基因組測序受到限制[6-7]。繪制基因組物理圖譜是基因組測序的基礎(chǔ)，可以通過對基因進(jìn)行標(biāo)記，成功地將其排序，進(jìn)而繪制出物理圖譜。物理圖譜的成果以及最終的完整基因組序列，對圖位克隆和檢測基因的正確位置非常必要。物理圖譜有助于迅速鎖定控制小麥產(chǎn)量和數(shù)量的基因，從而進(jìn)行作物品質(zhì)的改良。筆者綜述了小麥染色體物理圖譜的繪制、發(fā)展及其應(yīng)用，并對其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1小麥染色體物理圖譜的繪制方法

繪制小麥染色體物理圖譜的方法很多，如序列標(biāo)簽位點作圖(STS)、限制性作圖、熒光原位雜交、基于克隆的基因組作圖等，在使用中這幾種方法各有優(yōu)缺點。

STS是一段短的DNA序列，易于識別，這類分子標(biāo)記包括SSR、SCAR、EST、SNP等，能針對大基因組繪制最詳盡的圖譜，是目前構(gòu)建詳細(xì)的大基因組物理圖譜的主流技術(shù)[8-10]。限制性作圖是指將限制性內(nèi)切酶位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置，具有作圖快速、簡便等特點，能提供詳細(xì)的定位信息，但規(guī)模受限于限制性片段的大小，不能用于較大基因組[11]。熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)，具有快速、安全、靈敏度高以及探針可長期保存等特點，但操作困難且一次定位的標(biāo)記較少[12]?；诳寺〉幕蚪M作圖中大分子DNA克隆載體包括酵母人工染色體YAC、細(xì)菌人工染色體BAC及P1人工染色體PAC，但克隆重疊群構(gòu)建費時費力且指紋作圖有時會出現(xiàn)錯誤[13]。

2小麥染色體物理圖譜的發(fā)展

自1989年第1張RFLP小麥遺傳連鎖圖譜[14]出現(xiàn)后，許多學(xué)者相繼報道了小麥的遺傳圖譜，如Hohmann等[15]構(gòu)建了小麥細(xì)胞遺傳階梯圖。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，三大糧食作物中水稻和玉米的基因組測序工作分別于2002和2009年完成。在水稻和玉米基因組被破解多年后，最復(fù)雜、最困難的小麥基因組測序工作也有了突破性進(jìn)展。2008年，Paux等[16]首次繪制了一個以BAC文庫為基礎(chǔ)的含有995個堿基的小麥3B染色體物理圖譜，隨后小麥其他多條染色體的物理圖譜也陸續(xù)被報道。2010年，馬金彪[17]繪制了小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄基因物理圖譜，對已經(jīng)構(gòu)建好的小麥與小麥條銹菌親和性cDNA文庫進(jìn)行大規(guī)模測序，獲得了5 796條高質(zhì)量的EST序列。2013年，Breen等[18]繪制了小麥1AS染色體的物理圖譜，在1AS特異BAC文庫的25 918個高通量指紋圖譜的集合中，715個物理重疊群覆蓋了99%的染色體臂；Lucas等[19]創(chuàng)建了小麥1AL染色體的BAC文庫，獲得了累積長度為7.57 Mb的13 345個有用序列，代表了1.43%的小麥1AL染色體，約占A基因組的14%；Raats等[20]對小麥1BS染色體實物圖進(jìn)行最后組裝和分析，繪制了小麥1BS染色體物理圖譜；Philippe等[21]使用高通量基因檢測，繪制了高密度標(biāo)記的小麥1BL染色體物理圖譜，獲得了關(guān)于染色體進(jìn)化的新見解。2014年，國際小麥基因組測序協(xié)會對中國春小麥的每個染色體臂進(jìn)行了分離、測序及組裝，繪制出普通小麥的基因組草圖，這張草圖為小麥物理圖譜的繪制做出了重要貢獻(xiàn)。2015年，Akpinar等[22]繪制了高品質(zhì)的5DS染色體物理圖譜，揭示了基因組的重排。

3小麥染色體物理圖譜的作用

3.1小麥染色體物理圖譜及相應(yīng)資源為圖位克隆提供幫助小麥1BS染色體物理圖譜對應(yīng)基因組的資源包括：①深覆蓋BAC文庫；②高通量的BAC指紋數(shù)據(jù)集；③組裝的BAC重疊群；④UniGene表達(dá)序列標(biāo)簽(EST序列)集群；⑤基于序列標(biāo)記的數(shù)據(jù)集，包括1BS序列、BAC末端序列和遺傳標(biāo)記[20]。1BS物理圖譜的繪制及相應(yīng)資源不僅為基因和數(shù)量性狀位點的圖位克隆提供了幫助，而且提供了一個獨特的基因空間組織見解。

小麥具有復(fù)雜的多倍體基因組，高品質(zhì)的小麥基因組序列有17 Gb。為了克服這些困難，小麥基因組學(xué)使用了以BAC文庫、個別染色體測序為基礎(chǔ)的物理圖譜繪制方法。繪制物理圖譜最重要的一個資源是BAC文庫(Bacterial Artificial Chromosome，細(xì)菌人工染色體)。國際小麥基因組測序聯(lián)盟(IWGSC)通過流式細(xì)胞技術(shù)分析染色體和染色體臂，構(gòu)建特定BAC文庫。通過BAC文庫建立了3B染色體的物理圖譜。在小麥3B染色體物理圖譜的繪制過程中，Etienne[16]等用一個特異的染色體BAC文庫將82%的染色體裝配到含有1 443個分子標(biāo)記的1 036個重疊群中，為遺傳和基因組研究提供了重要資源。該物理圖譜為其他小麥染色體創(chuàng)建了范例，并說明了在較大的、復(fù)雜的六倍體小麥染色體中構(gòu)建物理圖譜的可能性。BAC文庫在小麥基因克隆、基因組及基因區(qū)物理圖譜的構(gòu)建以及比較基因組學(xué)等方面的研究中具有重要意義[23]。BAC文庫不僅在小麥染色體物理圖譜繪制中應(yīng)用廣泛，在其他作物中也有應(yīng)用，如擬南芥[24]、水稻和玉米[25-26]。

小麥1D染色體的高密度圖譜已被構(gòu)建，其中包含57個微衛(wèi)星標(biāo)記和白粉病抗性基因Pm24，有12個標(biāo)記位點與Pm24緊密連鎖。其中，有24個被標(biāo)記到1D染色體的短臂基因組區(qū)末端，33個被標(biāo)記到1D染色體的長臂基因組區(qū)。與Pm24相鄰的位點為Xgwm789 (Xgwm603) 和Xbarc229。Xgwm1291與Pm24分離，Xgwm1291被標(biāo)記到1D染色體的短臂。由此可推斷Pm24位于小麥的一個高度重組區(qū)，這為Pm24的圖位克隆提供了基礎(chǔ)[27]。

3.2小麥染色體物理圖譜是染色體完整測序的基礎(chǔ)對A組染色體的理解能夠更好地促進(jìn)小麥和未來全基因組測序的發(fā)展。在小麥1AL染色體物理圖譜的繪制中，Lucas等[19]獲得了累積長度為7.57 Mb的13 345個有用序列，這些序列的GC含量為44.7%，估計90%的染色體含有重復(fù)序列。從這些序列數(shù)據(jù)中鑒別出大量可利用的分子標(biāo)記(362個SSR標(biāo)記和6 948個ISBP標(biāo)記)，對于構(gòu)建染色體圖譜和分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。Lucas等[19]創(chuàng)建了小麥1AL染色體BAC文庫，在開發(fā)的44個ISBP標(biāo)記中，有23個是可用的，BAC末端序列數(shù)據(jù)使基因和染色體的鑒定成為可能。

1A染色體短臂是較小的小麥染色體臂之一，通過細(xì)胞學(xué)估計，1A染色體短臂只有275 Mb。1A染色體短臂上含有一些抗性基因，如基因Pm3和Lr10，也有一些與品質(zhì)相關(guān)的基因，如低分子量谷蛋白基因和分蘗抑制基因。此外，還含有至少3個抗性家族衍生物的基因(RGAs)。在小麥1AS染色體物理圖譜繪制中，為了輔助圖位克隆和基因組測序，Breen等[18]使用基因芯片、PCR標(biāo)記篩選和BAC末端序列，基于水稻和高粱的同線性，重排了160個物理重疊群，占1AS染色體臂的35.3%。來源于微陣列雜交的BAC文庫末端序列和信息被用來錨定1AS BAC文庫重疊群中的Illumina序列。1AS物理圖譜不僅為未來的遺傳圖譜項目提供了框架，還成為染色體完整測序的基礎(chǔ)。

3.3高分子量物理圖譜為小麥基因組進(jìn)化提供全新見解5DS 物理圖譜由164個重疊群組成，其中45個重疊群被組建成21個超重疊群。58個重疊群大小都大于1 Mb，該圖譜有1 864個分子標(biāo)記，密度是10.5個標(biāo)記/Mb。5DS的基因空間分析表明，組建到端粒部分的基因按梯度增多，在0.67~0.78缺失區(qū)域中的基因密度最高為5.17個基因/Mb，是其他區(qū)域的1.4~1.6倍。在小麥5DS染色體物理圖譜及小麥D基因組的演變研究中， Akpinar等[22]通過使用基因映射標(biāo)記數(shù)據(jù)、SSR、表達(dá)序列標(biāo)簽、COS標(biāo)記及被報道的圖譜數(shù)據(jù)對5DS物理圖譜重疊群進(jìn)行排序，提出了染色體特異性的觀點，揭示了基因組的重排。

在小麥1BL染色體物理圖譜的繪制中， Philippe等[21]開發(fā)出新的分子標(biāo)記并將它們錨定到1BL物理重疊群上，使用高效的裝配工具和高通量平臺，繪制小麥1BL染色體物理圖譜。起源于小麥中國春的1BL染色體，其特定的BAC文庫中含有92 160個克隆，共有65 413個高密度的指紋圖譜被包含在內(nèi)，并被用于構(gòu)建物理圖譜。

小麥的組1和組3染色體分別起源于A5和A1染色體，這是由初始A5染色體復(fù)制造成的。小麥3號染色體的祖先直接從A1染色體進(jìn)化而來且未發(fā)生重排，小麥1號染色體的祖先起源于A5染色體中A10染色體的插入部分[28]。在水稻中，12個保留了相同結(jié)構(gòu)的染色體被作為祖基因組，其中與小麥3號染色體和1號染色體有共線性的分別是1號染色體和5號染色體。Murat等[29]鑒定了63個起源于A5染色體祖先的基因，這些基因在水稻、短柄草、高粱中被保存下來。在128個水稻基因和來源于所有小麥染色體序列的Illumina重疊群中，小麥1BL和3BL染色體上的12個基因被鑒定出來，此結(jié)果支持了小麥比水稻有更多重排的說法，也表明小麥并不是草染色體改造的良好模式作物[30-31]。該高分子量物理圖譜不僅為1BL的測序提供了有效工具，還為小麥基因組進(jìn)化提供了全新見解。

4展望

物理圖譜與遺傳圖譜相比具有很多優(yōu)點，其不需要等位基因的多態(tài)性，還可以準(zhǔn)確地在DNA水平上描述出可識別標(biāo)記的準(zhǔn)確位置及其相互之間的距離。高分辨率的物理圖譜可以證實標(biāo)記在染色體上的實際分布情況和標(biāo)記間真實的物理距離，既能為基因克隆提供有效信息，也能為近緣物種間比較基因組的研究提供重要工具。物理圖譜的繪制已成為基因組學(xué)研究的活躍領(lǐng)域，物理圖譜在繪制過程中與各種基因組的資源和數(shù)據(jù)相互整合，如遺傳連鎖圖、分子細(xì)胞遺傳圖、DNA序列圖、EST數(shù)據(jù)等，將提高物理圖譜在基因組學(xué)研究中的使用價值和應(yīng)用范圍。隨著分子細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的不斷進(jìn)步，相關(guān)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，小麥多條染

色體物理圖譜的成功繪制，小麥的遺傳育種應(yīng)用前景將會更加廣闊。小麥物理圖譜也將逐步代替以往所使用的非整倍體，確定小麥染色體標(biāo)記的位置和特征，更有助于提高對相關(guān)重組的理解。

參考文獻(xiàn)

[1] GILL B S,APPELS R,BOTHA-OBERHOLSTER A M,et al.A workshop report on wheat genome sequencing:International genome research on wheat consortium[J].Genetics,2004,168:1087-1096.

[2] International Barley Genome Sequencing Consortium.A physical genetic and functional sequence assembly of the barley genome[J].Nature,2012,491:711-716.

[3] International Rice Genome Sequencing Project.The map-based sequence of the rice genome[J].Nature,2005,436:793-800.

[4] PATERSON A H,BOWERS J E,BRUGGMANN R,et al.TheSorghumbicolorgenome and the diversification of grasses[J].Nature,2009,457:551-556.

[5] International Brachypodium Initiative.Genome sequencing and analysis of the model grassBrachypodiumdistachyon[J].Nature,2010,463:763-768.

[6] BENNETT M D,SMITH J B.Nuclear DNA amounts in angiosperms[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,1976,274:227-274.

[7] PAUX E,ROGER D,BADAEVA E,et al.Characterizing the composition and evolution of homoeologous genomes in hexaploid wheat through BAC-end sequencing on chromosome 3B[J].Plant J,2006,48:463-474.

[8] ZIETKIEWICZ E,RAFALSKI A,LABUDA D.Genomic fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[9] LAN T H,DEL MONTE T A,REISCHMANN K P,et al.An EST-enriched comparative map ofBrassicaoleraceaandArabidopsisthaliana[J].Genome Res,2000,10:776-788.

[10] 甘四明,蘇曉華.林木基因組學(xué)研究進(jìn)展[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報,2006,32(2):133-142.

[11] 吳汝平,楊勝利,姜增連.青霉素酸化酶基因的克隆與表達(dá)[J].生物工程學(xué)報,1985,1(3):12-19.

[12] 鐘筱波.用熒光原位雜交技術(shù)構(gòu)建高分辨率的DNA物理圖譜[J].遺傳,1997,19(3):44-48.

[13] 湯飛宇,張?zhí)煺?重疊群物理圖譜的構(gòu)建及其應(yīng)用[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2009,28(1):195-201.

[14] CHAO S,SHARP P J,WORLAND A J,et al.RFLP-based genetic maps of wheat homoeologous group 7 chromosomes[J].Theor Appl Genet,1989,78:495-504.

[15] HOHMANN U,GRANER A,ENDO T R,et al.Comparison of wheat physical maps with barley linkage maps for group 7 chromosomes[J].Theoretical and applied genetics,1995,91(4):618-626.

[16] PAUX E,SOURDILLE P,SALSE J,et al.A physical map of the 1-gigabase bread wheat chromosome 3B[J].Science,2008,322(5898):101-104.

[17] 馬金彪.小麥與條銹菌親和互作表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析和條銹菌轉(zhuǎn)錄基因物理圖譜構(gòu)建[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2010.

[18] BREEN J,WICKER T,SHATALINA M,et al.A physical map of the short arm of wheat chromosome 1A[J].PLOS ONE,2013,8(11):80272.

[19] LUCAS S J,AKP I NAR B A,KANTAR M,et al.Physical mapping integrated with syntenic analysis to characterize the gene space of the long arm of wheat chromosome 1A[J].PLOS ONE,2013,8(4):59542.

[20] RAATS D,FRENKEL Z,KRUGMAN T,et al.The physical map of wheat chromosome 1BS provides insights into its gene space organization and evolution[J].Genome biology,2013,14:138.

[21] PHILIPPE R,PAUX E,ISABELLE I,et al.A high density physical map of chromosome 1BL supports evolutionary studies,map-based cloning and sequencing in wheat[J].Genome biology,2013,14:64.

[22] AKPINAR B A,MAGNI F,YUCE M,et al.The physical map of wheat chromosome 5DS revealed gene duplications and small rearrangements[J].BMC genomics,2015,16:453.

[23] 劉越,孔秀英,吳佳潔，等.細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫及其在小麥中的應(yīng)用[J].麥類作物學(xué)報,2006,26(3):159-163.

[24] Arabidopsis Genome Initiative.Analysis of the genome sequence of the flowering plantArabidopsisthaliana[J].Nature,2000,408:796-815.

[25] WEI F,COE E,NELSON W,et al.Physical and genetic structure of the maize genome reflects its complex evolutionary history[J].PLOS genet,2007,3(7):123.

[26] WEI F,STEIN J C,LIANG C,et al.Detailed analysis of a contiguous 22-Mb region of the maize genome[J].PLOS genet,2009,5:1000728.

[27] HUANG X Q,R?DER M S.High-density genetic and physical bin mapping of wheat chromosome 1D reveals that the powdery mildew resistance gene Pm24 is located in a highly recombinogenic region[J].Genetica,2011,139(9):1179-1187.

[28] SALSE J,ABROUK M,BOLOT S,et al.Reconstruction of monocotelydoneous proto-chromosomes reveals faster evolution in plants than in animals[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:14908-14913.

[29] MURAT F,XU J H,TANNIER E,et al.Ancestral grass karyotype reconstruction unravels new mechanisms of genome shuffling as a source of plant evolution[J].Genome Rese,2010,20:1545-1557.

[30] LA ROTA M,SORRELLS M E.Comparative DNA sequence analysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genome relationships between rice and wheat[J].Funct Integr Genomics,2004,4:34-46.

[31] LUO M C,DEAL K R,AKHUNOV E D,et al.Genome comparisons reveal a dominant mechanism of chromosome number reduction in grasses and accelerated genome evolution in Triticeae[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106:15780-15785.

收稿日期2015-12-28

作者簡介劉冰(1990- )，女，黑龍江寶清人，碩士研究生，研究方向：植物遺傳學(xué)與基因工程。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物遺傳學(xué)研究。

基金項目國際科技合作項目(2009DFA32470)；國家重點基礎(chǔ)研究計劃(973計劃)前期項目(2011CB111505)；黑龍江省教育廳科研項目(12521143)。

中圖分類號S 188+.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-126-02