肉豆蔻飲片微生物計數檢查方法研究及其在霉變過程中菌落總數的測定＊

楊瑞琦，王 西，陳慧榮，李佳慧，鄒慧琴＊＊，閆永紅＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院 北京 102446；2.北京三友匯智生物技術有限公司 北京 102299）

中藥材的品質關系著中成藥的質量和臨床用藥安全。近日，國家藥典委員會發(fā)文道[1]藥品微生物檢查是藥品安全性控制的重要質控項目。世界衛(wèi)生組織、歐洲藥典、日本藥典和美國藥典均對天然藥制定了微生物檢查方法和限度標準，并作為對這類藥物的安全質控項目，如：對直接服用或炮制處理過的中藥材，需氧菌總數為105cfu·g-1，霉菌和酵母菌總數為103-104cfu·g-1；需煎煮的中藥材需氧菌總數106-107cfu·g-1，霉菌和酵母菌總數104-105cfu·g-1[2]。而我國關于中藥飲片微生物限度的檢查和限度標準的研究相對薄弱。

肉豆蔻為肉豆蔻科植物肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）的干燥種仁，又名咖拘勒、豆蔻、肉果、頂頭肉等，主產于馬來西亞、印度尼西亞、斯里蘭卡等國，我國廣東、臺灣、云南等地有引種栽培。其整體呈卵圓形或橢圓形，表面灰棕色或灰黃色。質堅，斷面顯棕黃色相雜的大理石花紋，富油性。氣香濃烈，味辛。肉豆蔻味辛、溫，具有溫中行氣、澀腸止瀉的功效。近代藥理學研究表明肉豆蔻揮發(fā)油可促進缺血再灌注損傷心肌的恢復[3]，有心肌保護作用[4]，且對行為絕望抑郁小鼠有明顯抗抑郁作用等[5]。肉豆蔻中丁香酚類成分為其止瀉主要成分[6,7]，肉豆蔻木脂素具有明顯抗炎作用[8,9]，除此之外肉豆蔻亦有抗腫瘤[10,11]、抗菌[12,13]、抗氧化[14,15]等藥理作用。

肉豆蔻的主要成分為揮發(fā)油和脂肪油等，營養(yǎng)成分豐富，極易發(fā)生霉變，是2015年版《中國藥典》規(guī)定檢測黃曲霉毒素限量的十九種中藥之一。其在儲藏過程中受到空氣中霉菌孢子的污染，在適當的溫度、濕度下即萌發(fā)為菌絲，分泌酵素，溶蝕藥材的內部組織，使之腐壞變質，失去或降低藥效，甚至產生毒素危害患者的生命安全。但是，在實驗中發(fā)現肉豆蔻在不切開的情況下很難判斷其是否霉變。

圖1 肉豆蔻不同霉變時期樣品（a：J0樣品；b：J6樣品；c：J13樣品）

有文獻報道，肉豆蔻揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌共6種細菌及黃曲霉、黑曲霉等6種真菌均有抑制作用，且對細菌的抑菌活性比對真菌的抑菌活性強[16]。

本文對極易霉變又具有抑菌作用的肉豆蔻飲片進行微生物計數方法適應性驗證，并考察其在不同霉變時期需氧菌、霉菌、酵母菌菌落總數，以期為中藥飲品微生物限度檢查法提供相關理論基礎。

1 材料

1.1 樣品

肉豆蔻藥材購自安國市興華中藥材有限公司，經北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定系閆永紅教授依性狀鑒定為肉豆蔻科植物肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.）的干燥種仁。將無霉變的肉豆蔻飲片置恒溫恒濕箱內（溫度30℃，濕度95%）加速39天，每三天取一次樣，共得到14批不同霉變程度樣品。霉變不同時期樣品（圖1（a，b，c））。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基、聚山梨酯80均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003 第4代]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501第4代]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104 第4代]、黑曲霉[CMCC（F）98003 第4代]、白色念珠菌[CMCC（F）98001第4代]均為定量工作菌株，購自于北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 儀器

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司，No：100253），MJ-70-1霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，201309）。

2 方法與結果

參照《中國藥典》2015年版第四部非無菌產品微生物限度檢查通則1105：微生物計數法建立肉豆蔻飲片微生物計數方法。

2.1 菌液制備

使用前將未開啟的西林瓶平衡至室溫，將1.1 mL無菌生理鹽水加入西林瓶中，蓋上瓶蓋，靜置約5-10 s，無菌吸管反復吹吸10次以上使其完全溶解。吸取1 mL已完全溶解的菌液加入9 mL無菌生理鹽水中，混勻，逐級進行10倍稀釋，最終使其含菌數量約500-1000 cfu·mL-1。

2.2 供試液的制備

將肉豆蔻飲片置于用酒精棉球擦拭過的萬能粉碎機中，粉碎，用滅菌的藥匙將肉豆蔻粉末移至滅菌自封袋中備用。取10 g于滅菌研缽中，加入100 mL含0.1 mL聚山梨酯80的無菌生理鹽水，迅速研磨使其溶解，制成1∶10供試液。依次制作1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000稀釋液。

2.3 培養(yǎng)基適用性試驗

2.3.1 需氧菌培養(yǎng)基適用性試驗

分別移取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌菌液1 mL（含菌量50-100 cfu）至滅菌平皿中，分別傾倒胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基15 mL，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30-35℃培養(yǎng)48 h。每個菌種每種類型培養(yǎng)基各做3個平行。測定菌落數。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數比值應在0.5-2范圍內，且菌落形態(tài)大小與應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致[17]。結果（表1，圖2），被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數均在0.5-2范圍內。被檢固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)大小與比值對照培養(yǎng)基上的菌落一致。

表1 需氧菌培養(yǎng)基適用性試驗結果

表2 黑曲霉、白色念珠菌培養(yǎng)基適用性試驗結果

2.3.2 霉菌、酵母菌培養(yǎng)基適用性試驗

分別移取黑曲霉、白色念珠菌菌液1 mL（含菌量50-100 cfu）至滅菌平皿中，分別傾倒沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基15 mL，待其凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中20-25℃培養(yǎng)72 h。每個菌種每種類型培養(yǎng)基各做3個平行。測定菌落數。

被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數比值應在0.5-2范圍內，且菌落形態(tài)大小與應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。結果（表2，圖3），被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數均在0.5-2范圍內。被檢固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。

2.4 計數方法適用性試驗

2.4.1 需氧菌總數計數方法適用性試驗

試驗組：分別移取1∶1000、1∶10000、1∶100000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu。從試管中移取1 mL至滅菌平皿中，立刻傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后倒置于霉菌培養(yǎng)箱中30-35℃培養(yǎng)48 h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數。

圖2 a金黃色葡萄球菌；b銅綠假單胞菌；c枯草芽孢桿菌

圖3 a黑曲霉；b白色念珠菌

表3 需氧菌總數計數方法適用性試驗結果

供試品對照組：分別移取1∶1000、1∶10000、1∶100000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入0.1 mL無菌生理鹽水，其余按試驗組操作。測定供試品對照組菌落數。

菌液對照組：取9.9 mL無菌生理鹽水于滅菌試管中，加入與試驗組相同的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu，其余按試驗組操作。測定菌液對照組菌落數，進行微生物回收試驗。

陰性對照組：移取1 mL無菌生理鹽水于滅菌平皿中，其余按試驗組操作。平行制備2個平皿。

按回收率=[（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數]計算回收率，結果（表3）。根據2015年版《中國藥典》，采用平皿法時，回收率應在0.5-2范圍內?？傻贸?，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉需稀釋至1∶10000，白色念珠菌需稀釋至1∶100000方能達到回收率要求。

2.4.2 霉菌、酵母菌總數計數方法適用性試驗

分別移取1∶10000、1∶100000、1∶1000000供試液9.9 mL于滅菌試管中，加入制備好的黑曲霉、白色念珠菌菌液0.1 mL，使其終濃度為每1 mL供試液中含菌量不大于100 cfu。從試管中移取1 mL至滅菌平皿中，立刻傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待其凝固后倒置于霉菌培養(yǎng)箱中20-25℃培養(yǎng)72 h。每個菌種平行制備2個平皿，測定試驗組菌落數。

同法測定供試品對照組、菌液對照組和陰性對照組菌落數。

按回收率=[（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數]計算回收率，結果（表4）。根據2015年版《中國藥典》，采用平皿法時，回收率應在0.5-2范圍內?？傻贸?，黑曲霉需稀釋至1∶10000，白色念珠菌需稀釋至1∶1000000方能達到回收率要求。

表4 霉菌、酵母菌總數計數方法適用性試驗結果

表5 不同霉變程度肉豆蔻飲片菌落總數

2.5 不同霉變程度樣品菌落總數測定

綜上，選用 1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四個稀釋度的供試液來測定不同霉變程度肉豆蔻飲片中需氧菌、霉菌及酵母菌的菌落總數。結果（表5）。顯示，隨著加速時間的延長，肉豆蔻樣品中需氧菌菌落總數、霉菌、酵母菌菌落總數均呈上升趨勢，且增長迅速。

3 討論

實驗結果表明金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉采用1:10普通平皿法進行方法適用性驗證時，菌落數量較多，難以計數，不適合作為肉豆蔻飲片的微生物計數方法。經試驗選用1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000四個稀釋度來進行肉豆蔻飲片微生物計數的方法學驗證。其中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌需稀釋至1∶10000回收率可達到要求，而銅綠假單胞菌需稀釋至1∶100000稀釋級，才能達到回收率要求。黑曲霉和白色念珠菌分別在1∶10000、1∶100000稀釋級時才能達到回收率要求。

通過對不同霉變程度肉豆蔻飲片微生物計數結果研究發(fā)現，隨著加速時間的延長，肉豆蔻飲片霉變現象逐漸嚴重，且需氧菌和霉菌、酵母菌菌落總數均呈上升趨勢，且加速0-6天時增長緩慢，6-9天呈爆發(fā)式增長，9-39天勻速增長。提示我們肉豆蔻作為常用藥食兩用藥材在儲藏過程中應實時監(jiān)控其菌落總數，必要時增設微生物限度檢查以保證用藥的安全性與有效性。

有文獻報道，中藥飲片普遍受到多種微生物的污染，污染程度十分嚴重且污染的優(yōu)勢菌屬大都是已知的產毒霉菌[18,19]，因此在后續(xù)研究中應進一步研究肉豆蔻在霉變過程中產毒霉菌及控制菌的變化規(guī)律，及霉變產生的菌株對肉豆蔻飲片藥效成分含量的影響，為建立更完善的肉豆蔻飲片質量標準提供依據。