電針“百會”“涌泉”對4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠海馬LC3和Aβ影響的研究＊

裴亞妮，楊 光，張 磊，高譽珊，張淑靜，馮思凝，周英奕，張學婷，薛衛(wèi)國＊＊

(1.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 北京 100029)

1 前言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種以認知功能障礙為特征的漸進性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征被認為是神經(jīng)元外β淀粉樣蛋白（β-Amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑（senile plaques，SP）和神經(jīng)細胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）。目前研究顯示，自噬功能障礙與AD的病理進程息息相關[1]。自噬（autophagy）是真核細胞內(nèi)異常蛋白和受損細胞器被降解的重要生物學過程，一般經(jīng)歷自噬啟動、自噬體形成、自噬體與溶酶體融合、蛋白降解4個階段，對維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。而神經(jīng)元這類有絲分裂細胞不能通過細胞分裂有效地稀釋原本細胞中累積的有毒碎片和受損細胞器，因此這一作用在神經(jīng)元中顯得更為重要[2]。

AD腦內(nèi)自噬功能紊亂涉及自噬體形成、微管運輸、自噬體與溶酶體融合及降解等不同階段，與AD的兩大病理假說（Aβ級聯(lián)學說和tau蛋白過磷酸化學說）、Aβ產(chǎn)生、清除及微管相關蛋白密切相關[1]。目前關于AD的治療原則是早發(fā)現(xiàn)早治療，因為一旦AD發(fā)展到產(chǎn)生認知功能損害的中后病理階段，這種病理進程便很難再逆轉(zhuǎn)?，F(xiàn)有研究顯示，自噬紊亂不僅是除了老年斑、神經(jīng)原纖維纏結之外的AD的重要病理特征，更有可能發(fā)生于這些病理特征之前[3,4]。AD轉(zhuǎn)基因鼠4-5月齡時，紋狀體軸突腫脹成成簇葡萄樣結構、皮質(zhì)和海馬開始出現(xiàn)散在的Aβ沉積[5,6]，而此時行為學仍尚未體現(xiàn)出認知功能損害，直到6月齡時才能檢測出AD模型與正常小鼠之間的認知水平差異[7]，因此，4月齡時此模型小鼠仍處于AD發(fā)病早期病理階段，即AD的病理前期階段，在這個階段進行干預，符合其早發(fā)現(xiàn)早治療的原則，同時也符合中醫(yī)所提倡的“治未病”。

在自噬體形成的過程中，自噬相關蛋白LC3從游離態(tài)的LC3Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば偷腖C3Ⅱ。當哺乳動物細胞自噬增強時，細胞內(nèi)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化會明顯增加，即LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增大，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值通常用來判斷自噬是否被激活[8]。近年來，以APP轉(zhuǎn)基因鼠為AD模型，多個針刺治療AD的機制研究結果顯示，針刺可以改善APP轉(zhuǎn)基因鼠空間學習記憶能力，降低其腦內(nèi)Aβ水平，并改善相關神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)元再生、炎性反應等[9,10]，也存在針刺對自噬狀態(tài)產(chǎn)生影響的可能性[11,12]。本課題組選取4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物模型，通過免疫組化、免疫熒光、WB的實驗方法，對在此階段的AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)可能存在的自噬狀態(tài)進行初步判斷，并評估電針在AD的病理前期階段的干預對其海馬內(nèi)LC3和Aβ可能產(chǎn)生的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

動物 4月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為動物模型，4月齡、雄性C57BL/6小鼠（野生型）作為正常對照。動物從南京大學模式動物研究所購入（SCXK(蘇)2015-0001)，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物中心，采用自然晝夜節(jié)律光照，自由進食及飲水。本實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

試劑與儀器 無菌針灸針（中研太和，0.25 mm×13 mm）；韓式穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司，HANs LH202H型）；LC3抗體（美國，Abcam，ab48394）；免疫組化超敏試劑盒（邁新生物科技，KIT-9706）；DAB顯色試劑盒（邁新生物科技，DAB-0031）；Aβ抗體（美國，CST，15126）；山羊抗小鼠熒光二抗（美國，Abcam，ab150115）；山羊抗兔熒光二抗（美國，Abcam，ab150077）；激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus，F(xiàn)V1000-IX81）；山羊抗兔IgG抗體（中山金橋，ZB-5301）；ECL超敏發(fā)光液（Solarbio，PE0010）。

2.2 方法

2.2.1 分組與干預方法

16只4月齡、雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為2組：電針組（A）、模型組（M）；8只4月齡、雄性C57BL/6小鼠作為正常組（N）。

電針組：將小鼠以自制鼠袋固定于操作臺上，按照小鼠針灸穴位圖譜及比較解剖學方法，在頂骨正中取“百會”，在兩足底前、中1/3交界處取“涌泉”。選用北京中研太和醫(yī)藥公司生產(chǎn)的一次性針灸針，規(guī)格0.25 mm×13 mm，穴位局部進行常規(guī)消毒，刺入2-3 mm，“百會穴”直接針刺，雙“涌泉穴”接HANs電針儀，采用疏密波，頻率為1/50 Hz，強度1 mA，以針柄震顫，動物保持安靜不掙扎嘶叫為度，每次電針15 min，隔日1次。模型組和正常組：以與針刺組相同的方法束縛，每次15 min，隔日1次，共持續(xù)6周。

2.2.2 檢測指標與方法

（1）腦組織取材

以10%水合氯醛腹腔注射深麻醉小鼠，斷頭，在冰盒上取腦，左半腦放入4%多聚甲醛固定，每組取4塊用于免疫組化檢測、4塊用于免疫熒光檢測；右半腦剝離小鼠的海馬及腦皮質(zhì)，放入EP管后，迅速保存于液氮中，用于WB檢測。

（2）免疫組化法

每組取4塊4%多聚甲醛固定后的腦組織，石蠟包埋，從視交叉處沿冠狀軸切片，厚度為6 μm。染色步驟：脫蠟（二甲苯15 min/次，共3次；100%無水乙醇5 min/次，共2次；梯度乙醇依次浸泡5 min）；枸櫞酸鹽緩沖液熱修復10 min；待恢復至室溫后，PBS洗3次，每次5 min；過氧化物酶阻斷劑（邁新生物科技，KIT-9706，A液）室溫孵育10 min；PBS洗3次；山羊血清封閉液（邁新生物科技，KIT-9706，B液）室溫封閉10 min；甩掉封閉液，加LC3抗體，4℃過夜；次日，PBS洗3次，加二抗（邁新生物科技，KIT-9706，C液），室溫孵育10 min，PBS洗三次，加D液（邁新生物科技，KIT-9706，D液）；PBS洗3次，加DAB顯色2 min；自來水沖洗，蘇木素復染30 s；自來水沖洗，脫水（70%到100%梯度乙醇浸泡各5 min；100%二甲苯2次各10 min）；中性樹膠封片。使用DXM1200相機，用Leica系統(tǒng)連接并采集圖像。每只小鼠取1張免疫組化染色后的切片，在400倍放大下，分別取小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)的相同視野進行拍照。

圖1 小鼠海馬CA1區(qū)和皮質(zhì)LC3表達情況（免疫組化×400）

（3）免疫熒光雙標法

每組取4塊固定后的腦組織，梯度蔗糖脫水，OCT包埋，從視交叉沿冠狀軸切片，厚度為6 μm，切片置于-20℃保存。染色步驟：從-20℃取出切片，復溫15 min，PBS洗3次，每次5 min；枸櫞酸鹽緩沖液熱修復10 min；待恢復至室溫后，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封閉液室溫封閉10 min；甩掉封閉液，加一抗（滴加同體積的LC3抗體和Aβ抗體，混勻），4℃過夜；次日，PBS洗三次，加二抗（滴加同體積的抗兔二抗和抗鼠二抗，混勻），室溫孵育1.5 h；PBS洗三次，DAPI封片。每只小鼠取1張免疫熒光染色后的切片，在激光共聚焦顯微鏡下放大600倍，取小鼠海馬內(nèi)的相同視野拍照。

（4）WB法

每組取8塊小鼠右側海馬，按比例1∶100加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，勻漿后離心（4℃，10 min，10000 rpm）；離心后取上清液，BCA法蛋白定量試劑盒對上清液進行總蛋白定量，按照濃度80 μg·20 μL-1進行配平；采用10%分離膠和4%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗（LC3，1∶1000，β-acting，1∶1000），4℃孵育過夜；加入二抗（1∶2000），室溫孵育1 h；加入HRP-ECL發(fā)光液，全自動曝光機曝光，并采集圖像；使用Gel-Pro_analyzer軟件分析灰度值，然后對各組進行相對表達量比較。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。WB結果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(Xˉ±S)表示。各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，方差齊，采用單因素方差ANOVA分析法；兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，以P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 LC3在小鼠腦中的表達情況

LC3的陽性表達呈深黃色或棕色，從被標記的細胞形態(tài)來看，被標記的細胞主要是神經(jīng)元，LC3主要存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)和軸突中，細胞核復染呈現(xiàn)藍色（圖1）。由于本次實驗使用的LC3抗體既能標記出LC3Ⅰ，也能標記出LC3Ⅱ，本次免疫組化實驗無法區(qū)分LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，因此，本次免疫組化法著重于觀察LC3的表達位置。在各組小鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)，LC3主要表達于神經(jīng)元胞質(zhì)和軸突中，各組之間沒有呈現(xiàn)出明顯差異。但正常組與模型組、電針組比較，其海馬內(nèi)LC3標記的神經(jīng)元軸突更連續(xù)、規(guī)整。在小鼠皮質(zhì)中，從LC3所標記出的細胞形態(tài)來看，仍然主要是神經(jīng)元，LC3仍主要存在于核周（胞質(zhì)）以及軸突中（圖1）。

3.2 LC3和Aβ在小鼠海馬內(nèi)的共表達情況

圖2為LC3和Aβ在小鼠海馬CA1區(qū)的共表達情況。LC3標記為綠色熒光，主要表達在核周（胞質(zhì)）與軸突中，這與免疫組化結果相一致（圖1）。Aβ標記為紅色熒光，正常組與模型組所標記出的紅色熒光存在肉眼可見的區(qū)別。Aβ在模型組中有明顯更多的表達，主要聚集在核周（胞質(zhì)），并且與LC3存在共表達關系。細胞核標記為藍色熒光。

圖2 小鼠海馬CA1區(qū)LC3和Aβ的共表達情況（免疫熒光×600）

圖3 各組小鼠海馬LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達情況

圖4 各組小鼠海馬LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值情況

表1 各組小鼠海馬區(qū)LC3Ⅰ/LC3Ⅱ的比較（Xˉ±S）

3.3 小鼠海馬內(nèi)LC3的WB結果

正常組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大于模型組，P＜0.01，差異有顯著統(tǒng)計學意義；電針組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值大于模型組，P ＞ 0.05（P=0.19），差異無統(tǒng)計學意義；電針組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值小于正常組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。

4 討論

中醫(yī)學注重“治未病”，提倡“未病先防，已病防變”。《素問·四氣調(diào)神大論》如是說：“大病已成而后治之，猶譬渴而穿井，斗而鑄錐，不亦晚乎”，這也是現(xiàn)代AD的治療原則——“早發(fā)現(xiàn)早治療”。因此，本研究選取老年斑出現(xiàn)之前的處于AD病理前期的4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象。

“腎氣虧虛，痰濁蒙竅”是AD的主要病機[13,14]。中醫(yī)認為AD病位在腦，與腎密切相關；其病性屬本虛標實，虛實夾雜。腎主髓，腎氣虧虛則髓海氣化不足，氣虛則生濁，漸成痰瘀濁毒，蒙蔽腦竅?！鞍贂本宇^之巔頂，“督脈者…上額交巔上，入絡腦”，針刺“百會”有醒腦升陽益髓之功；“涌泉”為腎之井穴，為腎經(jīng)之根，針刺“涌泉”可疏通腎經(jīng)，充養(yǎng)髓海，正如《甲乙經(jīng)》云：“忽忽善忘，涌泉主之”。兩穴合用，一上一下，一近一遠，既可補腎益髓，又可行氣活血、化痰祛濁、開竅醒神[13]。

AD早期，腎氣虧虛氣化不利而生濁，自噬活性隨之降低，即自噬不足而導致異常蛋白Aβ在細胞內(nèi)聚集，但機體此時仍能保持相對平衡狀態(tài)；但隨著病情發(fā)展，聚集的Aβ作為病理產(chǎn)物，進一步引發(fā)自噬流紊亂，自噬體及自噬溶酶體聚集反而促成神經(jīng)元內(nèi)Aβ水平暴漲，誘發(fā)級聯(lián)反應，而處于低閾值的機體平衡狀態(tài)被破壞，反過來使其本身存在的氣滯、血瘀、痰阻等一系列病理狀態(tài)進一步加重，自噬紊亂與之形成惡性循環(huán)，誘發(fā)AD的一系列臨床表現(xiàn)[15]。而針刺治療AD可能具有雙向調(diào)節(jié)作用，對AD不同病理階段的不同自噬狀態(tài)均可能產(chǎn)生一定的良性調(diào)節(jié)作用。

1992年，Hardy和Higgins提出淀粉樣蛋白級聯(lián)假說（Amyloid cascade hypothesis）[16]，Aβ在腦實質(zhì)中的沉積也一直被認為是最終導致阿爾茨海默病發(fā)病的關鍵。而APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠一直是國際公認的影響Aβ水平的有效評價模型[17]。近些年，關于阿爾茨海默病治療的研究，不斷有“壞”消息傳來，尤其是兩項重要的臨床試驗結果更加重了悲觀情緒［18,19］，甚至懷疑阿爾茨海默病淀粉樣蛋白級聯(lián)假說的準確性，但以往這些治療方案的關鍵均集中在考慮Aβ的數(shù)量，生成速度和可逆的Aβ沉積，這中間存在著極大的不確定性，這種不確定性源于患有AD的人類腦中的Aβ沉積量的評估的復雜性，這種復雜性又源于人類大腦的自然異質(zhì)性。而以Aβ級聯(lián)連學說作為研究基礎，仍然是值得肯定的，Aβ在AD的病程進展中仍處于關鍵位置。針對Aβ的治療目前研究顯示，Aβ的治療作用主要取決于Aβ的沉積與tau病理進程之間的關系，由于當Aβ在腦內(nèi)沉積達到一定程度時，會產(chǎn)生足夠的“綜合壓力”來啟動、加速tau的病理進程，在此之后，Aβ的變化與AD的進展之間被認為不再存在任何直接相關性[20]。因此，任何減少Aβ水平的治療干預只有在這之前才能產(chǎn)生治療效用，而在這之后則會收效甚微，但這中間的具體時機卻很難把握確定。

本次實驗探索性的選用4月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠進行電針干預，本次實驗的WB結果顯示，模型組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值小于正常組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義,說明在AD的病理前期階段，AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬可能處于抑制狀態(tài)。通過電針干預，對AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬功能是否存在促進作用，電針組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義，而電針組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的均值是略高于模型組的，也許電針能夠促進AD模型小鼠海馬內(nèi)的自噬水平；但電針組與正常組的比較，其均值低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義，說明電針組小鼠海馬內(nèi)自噬可能還是處于較低的水平，電針干預對AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬水平的影響可能較弱。但是本次實驗樣本量較小，并綜合各種實驗因素，電針干預對AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的自噬功能是否存在促進作用還需要進一步實驗去證實。

眾多AD的相關研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營養(yǎng)不良性突起及神經(jīng)元胞體內(nèi)存在的大量自噬體和自噬溶酶體是Aβ生成的主要場所[21-23]。本課題組的前期研究顯示[24]，對4月齡AD轉(zhuǎn)基因小鼠進行電針干預后，能夠有效地降低AD小鼠海馬內(nèi)的Aβ水平，改善AD小鼠的空間學習記憶能力。本次實驗的免疫熒光結果顯示，在AD轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)，LC3與Aβ存在共表達，因此推測電針降低AD小鼠腦內(nèi)的Aβ水平可能通過激活此時AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的自噬功能來實現(xiàn)；LC3的變化只是對自噬體形成過程的評估，本次實驗的WB結果顯示出的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，電針組略高于模型組，電針對AD小鼠海馬內(nèi)的自噬體的形成略有促進，雖然結果顯示電針組與模型組之間的差異無統(tǒng)計學意義，但并不能因此否定電針干預對4月齡AD小鼠海馬內(nèi)的自噬水平存在促進作用。而Aβ與自噬、自噬與AD的發(fā)病機制以及電針干預的具體作用機制仍有待于進一步研究。