乳粉中阪崎克羅諾桿菌快速檢測方法應(yīng)用比較

王淞，張霞，王偉，李莉，朱振元（1.天津科技大學(xué)，天津00457；.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津00456；.青海出入境檢驗(yàn)檢疫局，青海西寧810099）

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乳粉中阪崎克羅諾桿菌快速檢測方法應(yīng)用比較

王淞1，2，張霞1，2，王偉2，李莉3，朱振元1，*
（1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300456；3.青海出入境檢驗(yàn)檢疫局，青海西寧810099）

摘要：對幾種應(yīng)用較為廣泛的阪崎克羅諾桿菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)行比較分析，探求適用于食品實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)要求的快速準(zhǔn)確的阪崎克羅諾桿菌檢測方法。通過DNA靈敏度檢測及樣品添菌實(shí)驗(yàn)比較交叉引物等溫擴(kuò)增法、實(shí)時熒光PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法的檢測靈敏度；通過實(shí)際樣品檢測，以常規(guī)培養(yǎng)生化鑒定為基準(zhǔn)方法，進(jìn)行靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率及相對準(zhǔn)確度等5方面比較分析。DNA靈敏度檢測顯示實(shí)時熒光PCR法最靈敏，檢測低限在0.9 fg/test；樣品添菌實(shí)驗(yàn)，3種方法檢測低限均可達(dá)100 cfu/100 g；與基準(zhǔn)方法比較，3種方法靈敏度均達(dá)到100 %，假陰性率0%，特異性在98.8%~99.0%之間，假陽性率1.0%~1.2%之間，相對準(zhǔn)確度98.8 %~99.0 %之間，均能滿足食品實(shí)驗(yàn)室檢測要求。3種分子生物學(xué)方法檢測時間短，同基準(zhǔn)方法比較，檢測結(jié)果大致相符，無漏檢情況，有假陽性結(jié)果，可用于日常阪崎克羅諾桿菌初篩檢測。

關(guān)鍵詞：乳粉；阪崎克羅諾桿菌；交叉引物等溫擴(kuò)增；比較

阪崎克羅諾桿菌是一種新出現(xiàn)食源性條件致病菌。1961年，Urmenyi等首次報道了兩例由該菌引起的腦膜炎病例[1]，根據(jù)Urmenyi等[2-3]對新生兒死亡病例研究，明確這種病原菌為“非典型的產(chǎn)黃色色素的陰溝腸桿菌”（yellow-pigmented Enterobacter cloacae）。1980年，該菌被正式定義和分類為腸桿菌科、腸桿菌屬的1個種，即阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），由16個生物型組成[4-5]。2008年，Iversen等提議將阪崎腸桿菌生物型劃分為1個新的屬，即克羅諾桿菌（Cronobacter spp.），包括5個新種（其中Cronobacter sakazakii稱為新組合）和1個克羅諾桿菌基因種[6-7]，2012年，Strydom 等[7]又將該屬下原來的種進(jìn)行重新歸類，并命名了兩個新種。該屬典型種為阪崎克羅諾桿菌。

克羅諾桿菌分布廣泛，在嬰幼兒乳粉、奶酪、腌肉、水、大米、面包、茶葉、調(diào)味料及豆腐等多種食品中均被檢測到，而嬰幼兒乳粉是嬰幼兒患病的主要感染渠道，該菌是新生兒腦膜炎、膿毒血癥、小腸壞死性結(jié)腸炎的主要病原菌之一，致死率高達(dá)40 %~80 %[8]。近些年，隨著國內(nèi)外一系列與該菌相關(guān)重大污染事件和奶粉召回事件的爆發(fā)，嬰幼兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染問題受到全世界的普遍關(guān)注，建立準(zhǔn)確快速的檢測方法已成為國際上對克羅諾桿菌研究的主要內(nèi)容之一。

目前，國內(nèi)外對于阪崎克羅諾桿菌的檢測方法主要有常規(guī)生化檢測方法和實(shí)時熒光PCR法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法、交叉引物等溫擴(kuò)增等分子生物學(xué)方法。其中常規(guī)生化培養(yǎng)法為食品中阪崎克羅諾桿菌的檢測金標(biāo)準(zhǔn)，也是目前基層實(shí)驗(yàn)室檢測的主要方式，主要有美國FDA《嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測（2002年修訂方法）》及由此修改采用的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.40-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1632.1-2013《出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗(yàn)方法第1部分：分離與計數(shù)》，但是工作量大、耗時長，不適應(yīng)于快速增長的檢測需求；隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及對阪崎克羅諾桿菌全基因序列的研究，實(shí)時熒光PCR法[9-10]、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（LAMP）[11-12]、交叉引物等溫擴(kuò)增（CPA）等[13-14]方法逐步建立，并形成相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用在食品、乳品質(zhì)量監(jiān)控領(lǐng)域。

本文旨在通過比較已成熟的實(shí)時熒光PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法及交叉引物等溫擴(kuò)增法檢測靈敏度，及在實(shí)際檢測工作中的應(yīng)用，探求適應(yīng)于各層次食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)要求的阪崎克羅諾桿菌快速準(zhǔn)確的檢測方法，為進(jìn)一步完善優(yōu)化阪崎克羅諾桿菌等致病菌的檢測體系提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST）肉湯：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；阪崎克羅諾桿菌檢測顯色培養(yǎng)基：OXIOD公司；腦心浸液（BHI）：生物梅里埃bioMérieux；營養(yǎng)肉湯：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；Wizard Genomic DNA Purification Kit：Promega；TaKaRa Premix Ex Taq：Perfect Real Time，大連寶生物；dNTPs：Fermentas；10×Bst buffer；Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；MgSO4、betaine：Sigma；核酸快速檢測試紙條：杭州優(yōu)思達(dá)公司。

1.1.2試驗(yàn)用菌株

阪崎克羅諾桿菌：ATCC29544。

1.1.3檢測引物

實(shí)時熒光PCR方法、LAMP法及CPA方法所需引物及探針詳見表1。

表1引物及探針序列Table 1 The sequence of primes and probes

1.1.4檢測用樣品

采集進(jìn)口乳粉410份，來源于美國、澳大利亞、新西蘭、加拿大等8個國家，其中嬰幼兒配方乳粉280份、全脂乳粉50份、脫脂乳粉50份、乳清粉30份。

1.2主要儀器設(shè)備

ABI7500熒光PCR儀：美國ABI公司；電泳儀：北京市六一儀器廠；T2A凝膠成像儀、PTC-200PCR儀：美國Bio-Rad公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；5417R臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1反應(yīng)體系及條件

1.3.1.1 CPA法

反應(yīng)體系：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.8 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8 U/μL BstDNA pol 1 μL，20 μmol/L DF/DR 0.1 μL/ 0.1 μL，10 μmol/L CF/CR 0.8 μL/0.8 μL，20 μmol/L DR/ DF 0.8 μL/0.8 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。

反應(yīng)條件：63℃反應(yīng)60 min。

1.3.1.2實(shí)時熒光PCR方法

反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq12.5 μL，10 μmol/L SakaF/R0.5 μL/0.5 μL，3 μmol/L Probe1 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

反應(yīng)條件：95℃10s；95℃5s，62℃20s，40個循環(huán)。

1.3.1.3 LAMP法

反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，10 μmol/L外引物0.5 μL/0.5 μL，10 μmol/L檢測引物4 μL/4 μL，8 U/μL BstDNA pol 1 μL，10 mmol/L Dntp 4 μL，模板1 μL，dd H2O補(bǔ)足至25 μL。

反應(yīng)條件：60℃反應(yīng)90 min，4℃保存。

1.3.2靈敏度檢測

1.3.2.1 DNA靈敏度檢測

阪崎克羅諾桿菌ATCC29544為實(shí)驗(yàn)菌株，接種于10 mL營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)16 h。取1 mL用于細(xì)菌基因組提取，利用紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量及純度。用TE對DNA原液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-8，按照1.3.1反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2樣品添菌實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)證實(shí)不含阪崎克羅諾桿菌的乳粉樣品A、B 各100 g溶于900 mL MLST中，在增菌前分別添加101 CFU及100數(shù)量級阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544，混勻，44℃培養(yǎng)24 h，取0.2 mL MLST增菌液加到5 mL BHI中37℃水浴4 h，待測。每份添加做2個平行，取添加樣品未添加菌的樣品A、B作為空白對照，同時做細(xì)菌計數(shù)。

1.3.3實(shí)際樣品檢測

用1.3.1中檢測方法體系及現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.40-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》（作為基準(zhǔn)方法）[15]對來源于不同國家的410份乳粉樣品進(jìn)行檢測，對陰、陽性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1靈敏度實(shí)驗(yàn)

DNA靈敏度檢測，結(jié)果顯示ATCC29544純度為1.736，質(zhì)量89.73 μg/mL。3種分子生物學(xué)方法，DNA靈敏度檢測，熒光PCR法檢測低限每檢測體系有0.9 fg DNA，優(yōu)于LAMP法、CPA法，高出1~2個數(shù)量級，結(jié)果見表2。

表2阪崎克羅諾桿菌DNA檢測靈敏度比較Table 2 Comparison of the DNA detection sensitivity in Cronobacter sakazakii

添菌增菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示樣品空白對照其細(xì)菌計數(shù)為2.3×102CFU/25 g，且未檢出阪崎克羅諾桿菌。當(dāng)樣品中添菌量為3.6 CFU/100 g及36 CFU/100 g時，增菌后，3種方法均可檢出，所以經(jīng)過增菌步驟后，上述3種方法在有干擾菌存在的情況下檢測低限均為100 cfu/100 g，滿足食品實(shí)驗(yàn)室致病菌檢測要求，結(jié)果見表3。

表3添菌增菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 3 Comparison of the add & enrichment bacteria experimental results

2.2實(shí)際樣品檢測

由于快檢方法采用與國標(biāo)基準(zhǔn)方法一致的增菌方法，增菌后，基準(zhǔn)方法將培養(yǎng)液劃線接種于阪崎克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，3種快檢方法取增菌液進(jìn)行DNA提取，擴(kuò)增鑒定。按照ISO定義，快檢方法與基準(zhǔn)方法屬于成對方法，將每種快檢方法和基準(zhǔn)方法針對每種食品類型得到的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，并進(jìn)行靈敏度、特異性、假陽性、假陰性及相對準(zhǔn)確度5個參數(shù)的計算，檢測結(jié)果及性能指標(biāo)見表4。

表4性能指標(biāo)結(jié)果Table 4 Reslut of the performance

通過實(shí)驗(yàn)室對每種快檢方法與基準(zhǔn)方法比較，實(shí)時熒光PCR方法、CPA方法、LAMP方法χ2值均小于3.84，表示3種快檢方法與基準(zhǔn)方法的陽性確證比率在5 %的置信區(qū)間內(nèi)，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

3種方法的靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率及相對準(zhǔn)確度等性能指標(biāo)均符合ISO提出的標(biāo)準(zhǔn)：靈敏度≥98 %、特異性≥90.4 %、假陰性率<2 %、假陽性率<9.6 %、相對準(zhǔn)確度≥94 %，能夠滿足定性微生物方法的確認(rèn)要求。

3　討論

阪崎克羅諾桿菌3種快速檢測方法已經(jīng)成熟，并應(yīng)用在食品微生物檢測領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)旨在著重對該3種方法靈敏度及在實(shí)際檢測應(yīng)用中進(jìn)行比較，總體評價見表5。

表5 3種方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 5 Comparison of the advantages & disadvantages of the three methods

總體而言，3種快檢方法中，實(shí)時熒光PCR方法靈敏度最高，CPA次之，LAMP較低，但是在食源性致病菌的分子生物學(xué)實(shí)際檢測工作中，由于食品中含有食源性致病菌的幾率較低，含量較少，食品基質(zhì)復(fù)雜等原因，需要經(jīng)過增菌后再對增菌液進(jìn)行DNA提取和檢測工作，所以3種快檢方法在實(shí)際檢測工作中靈敏度視為等效。

通過對大量實(shí)際樣品與國標(biāo)方法同時進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示3種方法沒有漏檢的可能性，但會有假陽性結(jié)果，分析假陽性發(fā)生原因，可能是由于（1）致病菌在食品中已經(jīng)死亡，但由于是對核酸檢測，所以檢測陽性，但是用常規(guī)培養(yǎng)方法不能培養(yǎng)出致病菌；（2）CPA 和LAMP方法原理可能由于多對引物相互反應(yīng)，出現(xiàn)引物二聚體導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

綜上所述，實(shí)時熒光PCR檢測方法，由于其高通量、靈敏度高、檢測時間短、避免PCR產(chǎn)物污染等優(yōu)點(diǎn)，適用于儀器設(shè)備、人員素質(zhì)較高的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用；而CPA和LAMP方法，不需昂貴儀器，檢測靈敏度也可達(dá)到實(shí)際檢測需求，可以用于基層及偏遠(yuǎn)經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)對食源性致病菌進(jìn)行快速初篩工作。同時由于交叉引物等溫擴(kuò)增免疫金標(biāo)法，是以環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)的新型擴(kuò)增法，引物設(shè)計原理不盡相同，靈敏度高于LAMP檢測方法；結(jié)果觀察利用核酸快速檢測試紙條檢測擴(kuò)增結(jié)果，避免了LAMP使用肉眼觀察沉淀或顏色變化的主觀性，整體操作較LAMP更簡單快捷，便于實(shí)驗(yàn)室人員操作，保護(hù)環(huán)境不受PCR產(chǎn)物氣溶膠污染，避免二次污染。

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Comparative Study on Rapid Detection Methods of Cronobacter Sakazakii in Milk Powder

WANG Song1，2，ZHANG Xia1，2，WANG Wei2，LI Li3，ZHU Zhen-yuan1，*
（1. Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2. Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300456，China；3. Qinghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xining 810099，Qinghai，China）

Abstract：Analyze several widely-applied molecular biological detection techniques of Cronobacter sakazakii，to find the rapid and exact detection method of Cronobacter sakazakii that will meet the food laboratory testing requirements. Compare the detection sensitivity of the methods like cross priming amplification method（CPA），real-time fluorescent PCR method，loop-mediated isothermal amplification method（LAMP）by the DNA detection sensitivity and sample added bacteria experiment；through the sample testing，compare the sensitivity，specificity，false positive rate，false negative rate and the relative accuracy based on conventional cultivation and biochemical identification method. DNA detection sensitivity showed real-time fluorescent PCR method was the most sensitive，low detection limit was 0.9 fg/test；in the sample add bacteria experiment，three methods to detect the low limit of up to 100 cfu/100 g；sensitivity compared with reference methods，three methods were 100 %，false negative rate of 0 %，the specificity was 98.8 %-99.0 %，false positive rate was 1.0 %-1.2 %，relative accuracy of 98.8 %-99.0 %，all of which can meet the demand of food laboratory testing. Compared to the benchmark method，the testing time of three kinds of molecular biology method testing was shorter，the test results were nearly accordance with the traditional standard detection method，no false negative happened，false positive hardly happened. It presented that the three methods can be used for daily Cronobacter sakazakii early screening test.

Key words：milk powder；Cronobacter sakazakii；cross priming isothermal amplification；compare

收稿日期：2015-09-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.037

*通信作者：朱振元（1969—），男（漢），教授，博士，主要從事糖化學(xué)及糖生化學(xué)、生物資源與功能食品研究。

作者簡介：王淞（1985—），男（漢），工程師，本科，主要從事食品、化妝品檢測及實(shí)驗(yàn)室管理工作。