紅棗葉中三萜皂苷的提取工藝和含量測定研究

劉子禎，姜蕊，劉偉銳，沈蒙，謝夢，徐冠玲，顏承，宋燕，張霞，楊悅，折改梅，*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京000；.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏銀川750004）

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紅棗葉中三萜皂苷的提取工藝和含量測定研究

劉子禎1，姜蕊1，劉偉銳1，沈蒙1，謝夢1，徐冠玲1，顏承1，宋燕2，張霞1，楊悅1，折改梅1，*
（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏銀川750004）

摘要：研究紅棗葉三萜皂苷的提取工藝和含量測定方法。最佳提取工藝為50 %乙醇水溶液，液料比10∶1（mL/g），回流提取1.5h；棗葉三萜皂苷含量為9.208%，RSD=2.26%。

關(guān)鍵詞：紅棗葉；三萜皂苷；提取工藝；含量測定

紅棗葉為鼠李科棗屬（Ziziphus）植物棗（Ziziphus jujube Mill.）的干燥樹葉，性溫、味甘，清熱解毒，主治小兒壯熱，瘡癤等[1-2]。棗葉極具營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，富含皂苷類活性成分[3-4]，在減肥[5-6]、降血糖[7]和寧心安神方面具有獨(dú)特功效[8]。另外，目前市售的甜味抑制劑都是通過化學(xué)合成的，然而棗葉中三萜皂苷如酸棗仁皂苷B、jujubasaponins、ziziphin皂草苷等具有突出的甜味抑制作用[9-10]，其通過競爭味覺受體來阻斷人的甜味反應(yīng)[11]，有望開發(fā)成月餅、糖果等甜食中的天然甜味抑制。然而，每年收獲紅棗時，大量棗葉被視作廢物丟棄或燒毀，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[6]。本研究對棗葉三萜皂苷進(jìn)行了提取工藝考察，建立了三萜皂苷含量測定方法，對今后棗葉的開發(fā)利用具有重要意義。

本研究首次采用正交設(shè)計(jì)考察棗葉皂苷提取工藝并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定了最佳提取工藝；優(yōu)化了香草醛-冰乙酸比色法的顯色條件；建立了紅棗葉中三萜皂苷含量測定的方法，為合理利用棗葉資源奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

紅棗葉采自陜西省榆林市，經(jīng)筆者鑒定為棗（Ziziphus jujube Mill.）的干燥樹葉。人參皂苷Re對照品（含量以98 %計(jì)）：購自北京鑫科奧商貿(mào)有限公司；乙醇、冰乙酸、香草醛和高氯酸均為分析純。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用有限責(zé)任公司；AL204和XS205精密電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；移液器：德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1供試品溶液制備

精密稱取干燥棗葉10.001 4 g，用50 %乙醇按液料比10∶1（mL/g）回流提取1.5 h，過濾，稀釋1倍，即得供試品溶液。

1.2.2對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re對照品2.32 mg于10 mL的量瓶溶解，定容至刻度，搖勻，即對照品溶液。

1.2.3測定波長的選擇

精密吸取供試品溶液30 μL，對照品溶液1.0 mL，揮干溶劑，分別加入的50 g/L香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻，60℃水浴加熱30 min，冷卻至室溫；分別加入冰乙酸5.0 mL，搖勻，靜置40 min。在450 nm~600 nm范圍進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果供試品和對照品均在532.0 nm處有最大吸收。因此，最大吸收波長為532.0 nm。結(jié)果見圖1。

圖1供試品溶液和對照品溶液顯色后的紫外吸收圖Fig.1 The UV graphs of test solution and reference solution after adding color-developing agent

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL對照品溶液，揮干溶劑，分別加入50 g/L香草醛-冰乙酸0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻；于60℃恒溫水浴加熱30 min，取出冷卻，分別加入5 mL冰乙酸，搖勻，靜置40 min，以空白為對照，在532.0 nm下測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)y，對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)x做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y = 20.393x + 0.0047，r = 0.999 3（n = 6），線性范圍為9.6 μg/mL~34.1 μg/mL。

1.2.5顯色條件的選擇

1.2.5.1顯色劑50 g/L香草醛-冰乙酸用量的考察

精密移取供試品溶液5份，每份30 μL，按1.2.4項(xiàng)的方法操作，香草醛-冰乙酸的加入量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL。在532.0 nm處測定吸光度，結(jié)果依次為0.451、0.472、0.458、0.462、0.447。故50 g/L香草醛-冰乙酸的最佳用量為0.2 mL。

1.2.5.2顯色劑高氯酸用量的考察

精密移取供試品溶液5份，每份30 μL，按1.2.4項(xiàng)的方法操作，高氯酸的加入量分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL。在532.0 nm處測定吸光度。結(jié)果依次為0.416、0.470、0.461、0.453、0.406。故高氯酸的最佳用量為0.8 mL。

1.2.5.3顯色溫度的考察

精密移取供試品溶液4份，每份30 μL，按1.2.4項(xiàng)的方法操作，水浴溫度分別為50、60、70、80℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被測樣品吸光度值與水浴加熱溫度呈正相關(guān)，并且當(dāng)溫度超過60℃后，空白溶液逐漸變黃，且在532.0 nm附近無最大吸收，故選60℃為最佳水浴溫度。

1.3方法學(xué)考察

1.3.1精密度

精密移取供試品溶液5份，每份30 μL，按1.2.4項(xiàng)的方法操作，在532.0 nm處測定吸光度，其值依次為0.470、0.471、0.472、0.472、0.473?？傻肦SD = 0.24 % （n = 5），說明精密度良好。

1.3.2顯色穩(wěn)定性

精密移取供試品溶液30 μL，按1.2.4項(xiàng)的方法操作，在顯色后0~120 min內(nèi)每隔10 min測定吸光度值。結(jié)果表明供試品在顯色后的40 min~120 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD = 1.13 %。

1.3.3重復(fù)性

精密稱取干棗葉5份，每份約10.0 g，按2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別取30 μL，按1.2.4項(xiàng)方法操作，在532.0 nm波長處測定吸光度，其值依次為0.475、0.489、0.482、0.483、0.461、0.467，RSD = 2.22 %（n = 6），說明重復(fù)性良好。

1.3.4加樣回收率

精密移取5份已知含量的供試品溶液，每份30 μL（皂苷含量138.12 μg），再分別加入0.232 mg/mL人參皂苷Re對照品溶液250 μL，按1.2.4項(xiàng)方法操作，在532.0 nm處測定吸光度。結(jié)果顯示平均加樣回收率為100.36 %，RSD = 2.55 %（n = 5），說明該方法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。結(jié)果見表1。

表1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery test

2結(jié)果與分析

2.1提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

棗葉皂苷提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2提取條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The orthogonal design for extraction conditions

由表2可知，三因素的極差大小順序?yàn)锳 > B > C，即三個因素對三萜皂苷提取率影響的大小順序?yàn)锳（液料比）> B（乙醇濃度）> C（提取時間）。

表3方差分析Table 3 The analysis of variance

由表3方差分析的F值可知，3個因素中，A（液料比）對棗葉三萜皂苷提取結(jié)果有顯著影響（P = 0.04 < 0.05），其他二因素則影響較小。該結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致，因此，最佳工藝參數(shù)為A3B1C2，即液料比為10∶1（mL/g），乙醇水溶液濃度為50 %，回流提取時間為1.5 h。

2.2樣品含量測定

精密稱取5份供試品，每份10.0 g，按2.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別從每份中吸取30 μL，按1.2.4下方法操作，在532.0 nm處測定吸光度，測得紅棗葉中三萜皂苷含量為9.208 %，RSD = 2.26 %。結(jié)果見表4。

表4樣品含量測定結(jié)果Table 4 Results of content determination

3　結(jié)論

本研究采用L9（34）正交設(shè)計(jì)對棗葉皂苷提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化，并對結(jié)果進(jìn)行了直觀分析與方差分析，得出紅棗葉皂苷提取最佳工藝為：液料比10∶1（mL/g），50 %乙醇水溶液回流提取1.5 h。首次采用香草醛-冰乙酸、高氯酸法測定紅棗葉中三萜皂苷的含量，確定出最佳顯色條件：50 g/L香草醛-冰乙酸用量為0.2 mL、高氯酸用量為0.8 mL、加熱溫度為60℃。該方法重復(fù)性好，對儀器要求低，穩(wěn)定可靠，為棗葉皂苷的工業(yè)化提取和進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]李時珍.本草綱目[M].天津:天津古籍出版社, 2006: 295

[2]熊輔信,寸樹芬.中藥現(xiàn)代研究薈萃[M].云南:云南科技出版社, 2002: 520

[3] Du H, Zhao X, Zhang A. Identifying potential therapeutic targets of a natural product jujuboside B for insomnia through network pharmacology[J]. Plant Science Today, 2014, 1(2): 69-79

[4] Guo S, Duan JA, Tang Y, et al. Simultaneous qualitative and quantitative analysis of triterpenic acids, saponins and flavonoids in the leaves of two Ziziphus species by HPLC-PDA-MS/ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 56(2): 264-270

[5] Ganachari M S, Kumar S. Effect of Ziziphus jujuba leaf extract on body weight, food intake and serum lipid levels in sucrose-induced obese rats[J]. Indian Journal of Pharmaceutical sciences, 2004, 66 (3): 363-365

[6] Erenmemisoglu A, Kelestimur F, Koker A H, et al. Hypoglycaemic effect of Zizyphus jujuba leaves[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1995, 47(1): 72-74

[7] Shirdel Z, Madani H, Mirbadalzadeh R. Investigation into the hypoglycemic effect of hydroalcoholic extract of Zizyphus jujuba leaves on blood glucose and lipids in alloxan-induced diabetes in rats[J]. Iranian Journal of Diabetes and Lipid Disorders, 2009, 8(2): 13-19

[8]李全國,楚杰,王君高,等.樂陵棗葉中總黃酮提取工藝研究[J].中國食物與營養(yǎng), 2013, 19(7): 51-54

[9] Yamada H, Imoto T. Inhibitory effect of the extract from Zizyphus jujuba leaves on sweet taste responses of the chorda tympani in the rat and hamster[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology, 1987, 88(2): 355-360

[10] Kurihara Y, Ookubo K, Tasaki H, et al. Studies on the taste modifiers. I. Purification and structure determination of sweetness inhibitingsubstancein leavesof Ziziphusjujube[J]. Tetrahedron, 1988, 44(1): 61-66

[11]李艷紅,林勤保,趙國燕.來自植物的天然甜味抑制劑[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(2): 93-96

Study on the Extraction Approach and Determination of Triterpene Saponins in the Leaf of Ziziphus jujuba Mill.

LIU Zi-zhen1，JIANG Rui1，LIU Wei-rui1，SHEN Meng1，XIE Meng1，XU Guan-ling1，YAN Cheng1，SONG Yan2，ZHANG Xia1，YANG Yue1，SHE Gai-mei1，*
（1. School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2. College of Pharmacology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Abstract：A extraction process and a determination method of triterpene saponins in Ziziphus jujuba leaves was researched. The optimum extraction process of saponins was as follow：50 % aqueous ethanol，solvent to medicine was the ratio of 10∶1（mL/g），reflux extraction time was 1.5 h. The triterpene saponins content in the leaf of Ziziphus jujuba was 9.208 %，RSD = 2.26 %.

Key words：Ziziphus jujuba Mill.；triterpene saponins；extraction procedure；determination

收稿日期：2014-08-31

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.015

作者簡介：劉子禎（1990—），男（漢），在讀碩士，研究方向：中藥化學(xué)。*通信作者：折改梅，副教授，博導(dǎo)。

基金項(xiàng)目：陜西紅棗樹葉中黃酮制備技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)服務(wù)（535/03578）