宿主防御肽調(diào)節(jié)動物腸道屏障功能的研究進(jìn)展

王 鑫 張萌萌 姜 寧 張愛忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319)

宿主防御肽(HDPs)也稱為抗菌肽，是動物先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其具有廣譜的抗革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌、真菌、病毒、原生動物甚至癌細(xì)胞的抗微生物活性，大多數(shù)HDPs在黏膜表面(包括胃腸道)均有表達(dá)。HDPs的主要種類有防御素、cathelicidins、S100家族、RNase A超家族、再生胰島衍生Ⅲ(REGⅢ)C型凝集素和肽聚糖識別蛋白[1]。由于大多數(shù)HDPs帶正電荷或具有兩親性，它們主要通過破壞細(xì)胞膜或與細(xì)胞內(nèi)大分子相互作用來殺死細(xì)菌。通過靜電相互作用，帶正電荷的HDPs與細(xì)菌膜上帶負(fù)電的磷脂基團(tuán)結(jié)合。HDPs的兩親性使其易于插入靶細(xì)胞膜中，從而破壞細(xì)胞膜的完整性。在細(xì)胞內(nèi)，某些HDPs也能夠抑制蛋白質(zhì)、DNA和RNA合成，或者與特異性靶標(biāo)結(jié)合。除抗菌活性外，HDPs還參與調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。譬如，3種雞源cathelicidins(fowlicidin1、fowlicidin2和fowlicidin3)直接與細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(LPS)結(jié)合，具有中和LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力[2]。3種牛源β牛防御素[牛中性粒細(xì)胞β-防御素3(BNBD3)、牛中性粒細(xì)胞β-防御素9(BNBD9)和牛腸源性防御素(EBD)]對未成熟的單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞具有趨化性[3]。豬源cathelicidin PR-39還能抑制吞噬細(xì)胞還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，并通過阻斷結(jié)合p47phox(一種NADPH氧化酶的胞質(zhì)成分)而抑制酶復(fù)合物的合成來減弱心肌缺血再灌注損傷[4]。因此，具有有效抗菌活性和調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答的HDPs被積極開發(fā)成新型抗生素。最近研究表明，HDPs能直接調(diào)節(jié)黏蛋白、緊密連接(TJ)蛋白的表達(dá)和微生物群落的組成，以增強(qiáng)黏膜屏障的通透性。HDPs在腸道屏障功能和腸道黏膜穩(wěn)態(tài)中的新作用將作為本文的論述重點。

1 動物腸道屏障功能概述

胃腸道內(nèi)的單層上皮細(xì)胞除可促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收外，還可作為微生物和毒素入侵的屏障，其是通過用黏液層涂覆上皮細(xì)胞并在上皮細(xì)胞之間形成選擇滲透性屏障的手段來實現(xiàn)腸道屏障功能。黏液層主要由杯狀細(xì)胞分泌的黏蛋白組成，其可作為腸腔內(nèi)容物和宿主之間的物理屏障，并且還有助于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。改變黏蛋白的表達(dá)或糖基化通常與腸屏障功能障礙有關(guān)。例如，小鼠的黏蛋白2(MUC2)基因缺陷導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞滲透性增加、大出血、胃腸道炎癥以及嚴(yán)重的生長遲緩[5]。黏蛋白1(MUC1)或MUC2基因缺陷型小鼠變得更容易感染空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及鼠檸檬酸桿菌。此外，缺乏β-1,3-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的小鼠表現(xiàn)出較薄的黏液層，增加了腸道細(xì)菌感染和葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的易感性[6]。

胃腸道的主要屏障功能表現(xiàn)在上皮細(xì)胞中，上皮細(xì)胞通過2種途徑(即跨細(xì)胞和旁細(xì)胞途徑)轉(zhuǎn)運水、離子和大分子?？缂?xì)胞通路是指小分子主動或被動轉(zhuǎn)運通過上皮細(xì)胞的運動，而旁細(xì)胞通路是指上皮細(xì)胞之間的水、大分子和免疫細(xì)胞的擴(kuò)散。在完整的上皮細(xì)胞中，旁細(xì)胞通路決定了腸道的通透性并由上皮之間連接調(diào)節(jié)，被稱為TJ。腸上皮是由幾種不同類型的細(xì)胞組成的隱窩和絨毛。這些細(xì)胞包括腸上皮干細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞，如潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞[7]。腸上皮干細(xì)胞能分化出所有類型的上皮細(xì)胞，而腸上皮細(xì)胞主要在營養(yǎng)物質(zhì)吸收中起作用，并具有合成和釋放HDPs及黏蛋白的能力。潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分別是HDPs和黏蛋白的主要生產(chǎn)者，而腸內(nèi)分泌細(xì)胞主要分泌許多激素，作為消化功能的調(diào)節(jié)劑[7]。通過形成3種主要類型的連接復(fù)合物，即TJ、黏附連接和橋粒，所有腸上皮細(xì)胞與側(cè)膜連接[8]?？傮w而言，這些連接復(fù)合物形成了對細(xì)胞間隙幾乎不可滲透的密封。除了屏障功能外，這些連接復(fù)合物通過將頂端與基底外側(cè)膜分離來維持細(xì)胞極性[9]。TJ是位于側(cè)膜最頂端的多蛋白復(fù)合物，由跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白組成，這些蛋白直接與細(xì)胞骨架相互作用。在這3種主要的連接復(fù)合物中，只有TJ具有控制離子、水和小分子的選擇性旁細(xì)胞通透性的能力[9]。因此，TJ是黏膜上皮滲透性的主要決定因素。

維持黏蛋白和TJ裝配能確保營養(yǎng)物質(zhì)、水、電解質(zhì)的吸收和運輸，同時使宿主免受病原體、毒素和腸道菌群的影響。同時，黏液層和TJ復(fù)合物的破壞會導(dǎo)致腸滲透性增加，隨后細(xì)菌移位加劇，炎癥加劇，并可能引起各種腸道和系統(tǒng)性疾病。在畜牧生產(chǎn)中，腸道屏障功能受損將影響動物健康，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降[10]。因此，了解HDPs如何維持和調(diào)節(jié)腸道屏障功能以實現(xiàn)最佳動物健康狀態(tài)和生產(chǎn)性能將顯得至關(guān)重要。

2 HDPs對腸道屏障功能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制

2.1 HDPs誘導(dǎo)黏蛋白和TJ蛋白表達(dá)的細(xì)胞受體

許多細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)受體影響著人和小鼠中cathelicidin和防御素的一系列生理功能。人源抗菌肽LL-37和鼠源陽離子相關(guān)抗菌肽(CRAMP)是P2X嘌呤能受體7(P2X7)、甲酰肽受體樣1/2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及sequestosome-1/p62的配體，而幾種人類和小鼠β-防御素與CC趨化因子受體2(CCR2)、CC趨化因子受體6(CCR6)、CXC趨化因子受體2(CXCR2)以及Toll樣受體(TLR)1/2/4結(jié)合[11]。盡管表皮生長因子受體(EGFR)不是LL-37的直接受體，但LL-37誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞中的氣道黏液黏蛋白(MUC5AC)基因的表達(dá)似乎主要通過EGFR的反式激活介導(dǎo)[12]。最初，LL-37觸發(fā)腫瘤壞死因子(TNF-α)轉(zhuǎn)換酶的活化，依次切割TNF-α結(jié)合形式，但不切斷肝素結(jié)合表皮生長因子(EGF)；釋放的TNF-α隨后與EGFR相互作用并使其磷酸化，其通過激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)MUC5AC基因的表達(dá)[12]。對于LL-37在人腸上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)MUC2和黏蛋白3(MUC3)基因的表達(dá)，涉及EGFR和P2X7，但不涉及G蛋白偶聯(lián)受體[13]。在人腸上皮細(xì)胞中HBD-2誘導(dǎo)的黏蛋白表達(dá)是通過CCR6部分介導(dǎo)的[14]。

2.2 HDPs調(diào)節(jié)腸道屏障的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑是由細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38組成的3個典型信號級聯(lián)[15]。S100A7能夠激活這3個典型的信號級聯(lián)。ERK在暴露于S100A7后2 min內(nèi)迅速在人皮膚角質(zhì)細(xì)胞中磷酸化，JNK和p38 MAPK也在30 min內(nèi)被磷酸化。p38 MAPK參與調(diào)節(jié)人Caco-2細(xì)胞中MUC2產(chǎn)生的P2X7和EGFR活化[12]。抑制單個MAPK信號級聯(lián)將顯著降低跨表皮電阻(TEER)，這意味著3個主要的MAPK途徑都是必需的。抑制ERK途徑增強(qiáng)了丁酸-腺苷酸環(huán)化酶激活劑(FSK)協(xié)同作用，而阻斷JNK或p38途徑顯著降低了雞巨噬細(xì)胞和空腸外植體對禽β-防御素9(AvBD9)的誘導(dǎo)[16]。丁酸鈉激活了牛乳腺上皮細(xì)胞中TLR2/p38細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)了氣管抗菌肽(TAP)、牛中性粒細(xì)胞β-防御素5(BNBD5)、牛中性粒細(xì)胞β-防御素10(BNBD10)的表達(dá)，提高了抗金黃色葡萄球菌感染內(nèi)化的能力并發(fā)揮抗炎作用[17]。丁酸鈉誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞中的豬β-防御素3(pBD3)、豬防御素EP2C(pEP2C)、豬β-防御素128(pBD128)、豬β-防御素123(pBD123)和豬β-防御素115(pBD115)表達(dá)上調(diào)，但沒有發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時，TLR2可被丁酸鈉和肽聚糖激活，阻斷TLR2表達(dá)，抑制了HDPs的誘導(dǎo)[18]。TJ蛋白的翻譯后修飾和相關(guān)的肌動球蛋白環(huán)的狀態(tài)對屏障滲透性會有很大的影響。許多因子通過某些TJ蛋白的磷酸化或通過肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的激活來改變屏障功能，MLCK又使肌球蛋白輕鏈磷酸化并引起功能性肌動球蛋白環(huán)的收縮和細(xì)胞旁孔的開放。確定HDPs是否以及如何影響TJ蛋白的翻譯后修飾以及MLCK的轉(zhuǎn)錄和活性將是后續(xù)研究熱點之一。

2.3 HDPs調(diào)節(jié)腸道黏蛋白和TJ蛋白的合成

人β-防御素-2(HBD-2)上調(diào)人結(jié)腸上皮細(xì)胞HT-29中MUC2、MUC3 mRNA的表達(dá)，但不上調(diào)MUC1或MUC5ACmRNA的表達(dá)[13]。相對于HBD-2，人結(jié)腸上皮細(xì)胞Caco-2中MUC2 mRNA的表達(dá)也上調(diào)，而表達(dá)上調(diào)的MUC2又促進(jìn)HBD-2 mRNA的表達(dá)，暗示MUC2與HBD-2之間存在正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[19]。LL-37在HT-29細(xì)胞中對MUC1、MUC2和MUC3 mRNA的表達(dá)均有增強(qiáng)作用，在Caco-2細(xì)胞中僅對MUC3 mRNA的表達(dá)有增強(qiáng)作用[13]。buforin Ⅱ是一種從亞洲蟾蜍的胃中分離出來的含21個氨基酸的HDPs，可改善受3種產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)菌株攻擊的斷奶仔豬的腸道屏障功能[20]。口服給藥buforin Ⅱ誘導(dǎo)受大腸桿菌攻擊仔豬的空腸節(jié)段中claudin-1、occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)增加。重要的是，buforin Ⅱ還可改善腸道形態(tài)和生長性能，并減少糞便拭子中的細(xì)菌脫落。此外，使用稱為cathelicidin-BF的帶狀krait HDPs能誘導(dǎo)健康小鼠空腸中ZO-1蛋白的表達(dá)，并恢復(fù)LPS介導(dǎo)的ZO-1損傷和腸道屏障功能[21]。此外，pBD-2能恢復(fù)MUC1、MUC2 mRNA的表達(dá)，claudin-1、ZO-1和ZO-2蛋白的表達(dá)以及DSS處理小鼠結(jié)腸屏障的完整性[22]。

3 HDPs對腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的影響

腸上皮細(xì)胞的主要功能之一是作為抵抗微生物入侵的屏障。腸黏膜上有1 000多種微生物定植，其中大多數(shù)是共生細(xì)菌，通過這些細(xì)菌來改善消化、吸收和維生素合成的能力，從而有益于宿主，同時還能限制病原體繁殖。存在于人和小鼠腸道中的2種最主要的細(xì)菌是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，它們合計存在的細(xì)菌數(shù)占總細(xì)菌數(shù)的70%～80%。共生細(xì)菌對正常腸道形態(tài)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。盡管共生細(xì)菌在穩(wěn)態(tài)條件下對宿主是有益的，但是在穩(wěn)態(tài)失調(diào)或微生物群落失衡的狀態(tài)下會導(dǎo)致炎癥和上皮細(xì)胞動態(tài)平衡紊亂。

腸上皮通過模式識別受體(PRR)和微生物相關(guān)分子模式(MAMP)之間的相互作用持續(xù)監(jiān)測定植微生物。激活PRR能刺激腸細(xì)胞中HDPs和黏蛋白的合成和釋放。Paneth細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞分泌的大量HDPs被保留在黏液層中，以形成強(qiáng)大的屏障抵抗細(xì)菌入侵。HDPs敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究已經(jīng)闡明了HDPs在腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和免疫防御中的作用。敲除小鼠cathelicidinCRAMP基因會引發(fā)小鼠結(jié)腸炎，并且在DSS誘導(dǎo)后疾病癥狀進(jìn)一步惡化[23]。從野生型小鼠向CRAMP基因敲除小鼠轉(zhuǎn)移骨髓細(xì)胞減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。攜帶人類防御素5(HD5)轉(zhuǎn)基因的小鼠表現(xiàn)出增強(qiáng)抵御口服鼠傷寒沙門氏菌感染的能力。相反，產(chǎn)生生物活性腸道防御素的基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP7)基因敲除小鼠表現(xiàn)出清除腸道病原體的能力下降。與野生型小鼠相比，HD5轉(zhuǎn)基因小鼠的硬壁菌菌數(shù)減少，類小桿菌菌數(shù)增加，而MMP7缺陷小鼠則相反[24]。此外，HD5在小鼠中的過度表達(dá)導(dǎo)致遠(yuǎn)端小腸中分節(jié)狀細(xì)菌顯著減少，固有層中T17細(xì)胞數(shù)也減少，這清楚地表明腸道HDPs代表了形成微生物群落的關(guān)鍵因素和消化道的炎癥狀態(tài)。

4 HDPs對動物生長性能和腸道形態(tài)的影響

多項研究強(qiáng)調(diào)了直接飼喂HDPs對豬生長、腸道形態(tài)和免疫狀態(tài)的有益作用。飼喂重組家蠶HDPs天蠶素A/D明顯提高了受ETEC侵襲的斷奶仔豬的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率，并減少了腹瀉發(fā)生率，同時在6 d內(nèi)對腸道形態(tài)和氮/能量利用沒有產(chǎn)生顯著的影響[25]。飼糧中添加來源于牛乳鐵蛋白的重組融合HDPs也提高了仔豬的生長性能，并在21 d內(nèi)降低了受ETEC侵襲的仔豬的腹瀉發(fā)生率[26]。在5個不同的農(nóng)場中，飼喂4種重組HDPs的混合物，包括乳鐵蛋白、天蠶素、防御素和菌絲霉素，可增強(qiáng)斷奶仔豬的生長性能和飼料轉(zhuǎn)化率，并減少了腹瀉發(fā)生率[27]。與上述研究相似，在4周的試驗中補(bǔ)充人工合成HDPs(AMP-A3或P5)改善了斷奶仔豬的營養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道形態(tài)和生長性能，但沒有顯著影響血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量[28]。此外，AMP-A3和P5似乎降低了潛在有害梭菌的滴度以及回腸、盲腸和糞便中大腸菌群數(shù)量[29]。在受真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的侵襲下，飼喂2種HDPs和1種益生菌酵母的組合物使仔豬的腸道形態(tài)和飼料轉(zhuǎn)化率得到提升[30]。在上述大多數(shù)試驗中，HDPs在促進(jìn)豬群生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率和改善腸道形態(tài)方面與抗生素?zé)o差別。飼糧中補(bǔ)充AMP-A3增加了肉仔雞的體重，提高了飼料轉(zhuǎn)化率，這與飼糧中補(bǔ)充抗生素阿維菌素的肉仔雞的生產(chǎn)性能相近[31]。通過增加小腸絨毛高度和絨毛高度隱窩深度比例，肉雞的腸道形態(tài)也可得到改善。添加含重組天蠶素A/D的酵母肉湯提高了肉雞的腸道形態(tài)和飼料轉(zhuǎn)化率，在4周的試驗中有提高肉雞生長性能的趨勢[32]。天蠶素A/D也降低了42日齡雞的空腸和盲腸內(nèi)容物的總需氧菌數(shù)量?？偟膩碚f，這些動物試驗結(jié)果表明了HDPs飼喂動物的益處，證明了飼糧中補(bǔ)充HDPs作為促進(jìn)動物生長和疾病控制的抗生素替代策略是合理的。

5 誘導(dǎo)HDPs合成的化合物

由于HDPs容易發(fā)生酶促降解并且合成或重組形式的生產(chǎn)成本高，因此在動物飼糧中直接補(bǔ)充HDPs可能不具有生物學(xué)有效性和經(jīng)濟(jì)效益。最近，已發(fā)現(xiàn)幾類小分子化合物如丁酸鹽可誘導(dǎo)HDPs合成，并增強(qiáng)動物體內(nèi)的細(xì)菌清除率，而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。飼糧補(bǔ)充這些簡單的HDPs誘導(dǎo)化合物或其組合被證明是一種替代低成本動物常用抗生素的新方法。飼料補(bǔ)充0.1%丁酸顯著增加雞腸道HDPs的表達(dá)，同時減少盲腸中近10倍試驗感染劑量的腸炎沙門氏菌的滴度[33]。在雞HD11巨噬細(xì)胞和初級單核細(xì)胞中，誘導(dǎo)合成的HDPs與游離的脂肪烴鏈長度呈負(fù)相關(guān)，短鏈脂肪酸是最有效的，中鏈脂肪酸和長鏈脂肪酸效果較差[34]。3種短鏈脂肪酸，即乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，在雞細(xì)胞中在增強(qiáng)HDPs基因表達(dá)方面發(fā)揮了強(qiáng)大的協(xié)同作用。與單獨添加短鏈脂肪酸相比，將3種短鏈脂肪酸組合混合添加到飲水中能進(jìn)一步減少雞盲腸中的腸炎沙門氏菌感染。更重要的是，短鏈脂肪酸增強(qiáng)了HDPs基因的表達(dá)而不刺激促炎白細(xì)胞介素-1β的產(chǎn)生。丁酸鹽緩解了大腸桿菌O157∶H7誘導(dǎo)的豬溶血性尿毒癥的臨床癥狀綜合征(HUS)和部分炎癥，并且通過乙酰化修飾作用來上調(diào)HDPs的表達(dá)[35]。乙酸、丙酸、丁酸和己酸均能減少金黃色葡萄球菌感染牛乳腺上皮細(xì)胞并上調(diào)TAP、BNBD5基因表達(dá)[36]，但這些HDPs誘導(dǎo)化合物在促進(jìn)動物生長、腸道健康和微生物群落平衡方面的功效尚需在反芻動物試驗中進(jìn)一步得到證實。

6 小 結(jié)

破壞腸道屏障會導(dǎo)致動物疾病并降低生產(chǎn)效率，因此了解腸道屏障功能及其調(diào)控機(jī)制對于確保畜牧業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展至關(guān)重要。憑借強(qiáng)大的抗菌性和免疫調(diào)節(jié)能力，HDPs進(jìn)一步表現(xiàn)出直接調(diào)節(jié)腸道屏障功能的新能力。HDPs異常合成通常導(dǎo)致腸道屏障功能障礙，屏障完整性受損的疾病通常與HDPs合成減少有關(guān)，這均顯示出HDPs在增強(qiáng)腸道健康和動物表現(xiàn)方面的潛力。雖然已實現(xiàn)應(yīng)用合成肽治療人類疾病，但在畜牧業(yè)中應(yīng)用成本還是非常高昂的。HDPs的誘導(dǎo)化合物或外源性重組HDPs已經(jīng)成為動物疾病預(yù)防與治療的有效策略，并且在未來可能替代畜牧生產(chǎn)中抗生素的使用。