寵物犬體表真菌病原體初步分離與鑒定

楊曉偉，任宏彬，賈曉婷，郭素萍

（大同海關(guān)，山西 大同 037000）

真菌是自然界廣泛存在的一類微生物，可引起人類和動(dòng)物過敏性疾病和真菌毒素中毒癥，其中寄生在人和動(dòng)物體表，引起真菌性皮膚病[1]。真菌分有性生殖和無性生殖[2]。

皮膚性真菌主要寄生于人和動(dòng)物表皮角質(zhì)、毛發(fā)、指甲、爪、角質(zhì)蛋白組織中，使局部皮膚產(chǎn)生組織病變[3]，甚至感染組織深部，即致病真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟，從而引起器官真菌感染[4]。

犬皮膚真菌病是犬類常見的臨床疾病，其致病菌主要由犬小孢子菌、石膏狀小孢子菌、須毛癬菌組成，其中犬小孢子菌占70%，石膏樣小孢子菌為20%，須毛癬菌為10%[5]。但健康犬在皮膚防御屏障作用下病原菌無法正常生長，只是簡單地粘附于皮膚或被毛之上。若外界環(huán)境發(fā)生改變，如機(jī)體抵抗力、免疫機(jī)能降低、原發(fā)性疾病或犬廝打的傷口使局部皮膚喪失保護(hù)，導(dǎo)致病菌侵入表皮造成感染[6]。部分學(xué)者們認(rèn)為淺部真菌的發(fā)病機(jī)制多與菌絲相關(guān)。因?yàn)檎婢茉诿铱谛纬纱罅烤z伸人毛囊，菌絲變態(tài)形成吸器，吸取營養(yǎng)從而大量繁殖，破壞毛囊、毛根及毛球上部的角質(zhì)，并在毛內(nèi)或毛周分支分裂形成緊密的孢子或分節(jié)菌絲，引起毛發(fā)病變及皮膚炎癥而產(chǎn)生癥狀[7]。

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，人民生活水平日益提高，寵物（犬、貓）飼養(yǎng)量急劇上升，又因犬皮膚真菌病作為一種常見的人畜共患疾病，關(guān)系到人與動(dòng)物的健康，故而倍受人們關(guān)注和重視。此病主要通過接觸感染，臨床特征主要有脫毛、瘙癢、紅腫及炎癥，易與其他寄生蟲或細(xì)菌混合感染。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料及器材

瓊脂粉（成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)）、葡萄糖（汕頭市西隴化工廠有限公司生產(chǎn)）、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）、95%酒精、蒸餾水等。

平皿、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）、封閉式調(diào)溫電爐（成都川西行科工貿(mào)有限公司生產(chǎn)[PYX-DHS-40x50-S]）、JPT-1型架盤天平（天津市天馬儀器廠生產(chǎn)(00000297號(hào))、Olympus雙目醫(yī)用顯微鏡（Olympus 公司）、烘箱、高壓鍋、玻棒、錐形瓶、棉塞、無菌操作臺(tái)、打孔器、小勺和酒精燈。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物的選取

在大同愛佳寵物醫(yī)院選取患真菌病的寵物犬，經(jīng)伍德氏燈檢查確診患有皮膚性真菌感染。用75%酒精對(duì)寵物犬患部進(jìn)行消毒，再用無菌鑷子取少量患部毛發(fā)裝于無菌采樣袋中。

2 方法

2.1 臨床癥狀診斷

患犬常表現(xiàn)為劇癢、脫屑、脫毛和結(jié)痂。毛發(fā)變脆、毛干易斷、毛根易脫，皮膚上可見到紅疹脫毛區(qū)覆蓋著油性結(jié)痂，刮去痂皮裸露潮紅或潰爛的表皮[12]。

圖1 寵物犬真菌感染臨床癥狀

2.2 毛發(fā)直接鏡檢

患處剪毛消毒，用手術(shù)刀在病健結(jié)合部，呈30°角單向反復(fù)刮皮膚，直至微微滲血。將病料置于載玻片上，加1滴10% KOH制片,蓋上蓋玻片，并在酒精燈上稍微加熱后置于顯微鏡下鏡檢，觀察孢子和菌絲。

2.3 伍德氏燈檢查（wood’s lamp）

該技術(shù)是以特制紫外光線燈光（波長253.7 nm），通過鈷或鎳過濾，在感染部位檢測熒光被毛來診斷皮膚癬菌病。

2.4 真菌培養(yǎng)與鑒定

2.4.1 制作培養(yǎng)基 配制沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（Glucose Peptone Agar）又稱沙堡瓊脂(SDA)，按蛋白胨1 g，瓊脂1.5 g，葡萄糖4 g，蒸餾水100 ml的比例配制培養(yǎng)基，煮沸溶解，高壓115℃，滅菌20 min。趁熱在無菌操作臺(tái)中倒平板，待其凝固。

2.4.2 分離培養(yǎng) 在無菌操作臺(tái)中用小鑷子將采取的毛發(fā)和皮屑接種到培養(yǎng)基上，并編號(hào)，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～7 d，觀察菌落的生長狀況，在無菌操作臺(tái)中對(duì)顏色不同、質(zhì)地不一、形狀不同的菌落進(jìn)行分離純化：打孔器打孔，小勺挑起菌落轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，編號(hào)，放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再培養(yǎng)3～7 d，觀察整個(gè)菌落是否已經(jīng)純化，若沒有純化還需繼續(xù)分離，直到純化菌落。

2.4.3 光鏡鑒定 分離純化的真菌培養(yǎng)3 d后，挑取菌落，直接制作涂片，鏡檢或染色后鏡檢，觀察其顯微結(jié)構(gòu)，主要觀察孢子和菌絲。檢查是否有大、小分生孢子；大分生孢子的形狀、分隔多少、孢子壁及其它特點(diǎn)；小分生孢子的形狀、特點(diǎn)、排列方式等；菌絲的粗細(xì)、分枝特點(diǎn)、菌絲是否分隔；各種特殊菌絲(如鹿角狀菌絲、球拍狀菌絲、螺旋菌絲、結(jié)節(jié)菌絲、梳狀菌絲等)；若宏觀形態(tài)和微結(jié)構(gòu)相矛盾，以微觀結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)。

2.4.4 結(jié)果判定 分離純化后，每天定時(shí)記錄菌落的生長情況：菌落的大小、菌落的直徑、菌落的顏色、菌落的表面、菌落的質(zhì)地、菌落的邊緣、菌落的高度、培養(yǎng)基顏色變化、滲出物、氣味等。根據(jù)菌落特征來判定皮膚真菌種類[13]。若根據(jù)以上結(jié)果還不能鑒定真菌的種類，則需借助鑒別培養(yǎng)基。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 在沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，結(jié)合鏡鑒

結(jié)果顯示：犬小孢子菌、須毛癬菌、阿耶羅毛癬菌、尖端賽多孢子菌、念珠菌、共頭霉、馬內(nèi)菲青霉、黑葡萄橞 霉、犁頭霉、雜色曲霉、黃曲霉、以及鑒定到屬的曲霉和暗色真菌。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。檢； H:近平滑念珠菌培養(yǎng)和鏡檢；I:共頭霉培養(yǎng)和鏡檢；J:暗色真菌培養(yǎng)；K:煙曲霉培養(yǎng)）

圖2 真菌的分離與鑒定

3.2 形態(tài)特征

須毛癬菌 菌落特征：菌絲生長快，五天后長滿平皿，質(zhì)地疏松，邊緣絨毛狀，有同心圓狀，表面初期呈乳白色，后期顏色加深，背面由米黃色變?yōu)橥咙S色再變?yōu)榘导t色；顯微鏡特征：小分生孢子，圓形到梨形，呈簇狀或未成熟的葡萄狀，常存在螺旋菌絲。

阿耶羅毛癬菌 菌落特征：生長較快，一周后長滿平皿，絲絨毛樣生長，質(zhì)地疏松，邊緣呈放射狀生長，表面呈米黃色，背面呈淡土黃色；顯微鏡特征：大分生孢子，多有分隔，長梭形，壁厚，光滑。

尖端賽多孢子菌 菌落特征：生長較快，六天后長滿平皿，絨毛狀生長，質(zhì)地較密，邊緣微絨毛，表面白色，背面由淡黃色變?yōu)辄S色；顯微鏡特征：菌絲較粗，有分隔，分生孢子呈卵圓形。

雜色曲霉 菌落特征：生長較慢，呈粉狀生長，質(zhì)地疏松，邊緣平整，表面顏色逐漸變色，由咖啡色→淡藍(lán)綠色→灰色，背面為黃白色→灰白色，有散在菌落；顯微鏡特征：分生孢子頭疏松呈放射狀，分生孢子球形且有刺。

犁頭霉 菌落特征：生長速度中等，纖毛狀豎直生長，質(zhì)地較疏松，邊緣不整，短纖毛狀生長，表面灰白色，背面灰白色，時(shí)間久后纖毛尖端有黑色小點(diǎn)；顯微鏡特征：大分生孢子囊，梨形，有囊托，有匍匐菌絲。

馬內(nèi)菲青霉 菌落特征：生長速度較慢，中間呈粉狀生長，四周為纖毛狀生長，質(zhì)地較密，邊緣平整，表面顏色為淺咖啡色→脂粉色→墨綠色→灰白色，背面中間為黃色，四周為乳黃色，有散在菌落生長；顯微鏡特征：無色透明分隔菌絲，分生孢子梗光滑，帚狀枝雙輪生，散在，少不對(duì)稱，頂端狹窄。

犬小孢子菌 菌落特征：生長快速，絨毛狀生長，質(zhì)地較密，邊緣平整，表面白色到米色，背面乳黃色到米黃色；顯微鏡特征：大部分為大分生孢子，梭形，紡錘形，在頂點(diǎn)稍有彎曲，壁厚和棘狀突起。

近平滑念珠菌 菌落特征：生長很慢，形成酵母樣菌落，奶油樣，邊緣不整，有皺褶，表面米黃色，背面乳黃色；顯微鏡特征：酵母細(xì)胞多呈卵圓形或長倒卵形。

共頭霉 菌落特征：生長較快，絨毛狀豎直向上生長，微絨毛向四周發(fā)散，邊緣不整，表面灰白色，背面灰白色；顯微鏡特征:菌絲透明，多分枝，無分隔，孢子梗呈球形至倒卵狀。

3.3 真菌生長規(guī)律

根據(jù)表1和圖3，須毛癬菌、尖端賽多孢子菌、阿耶羅毛癬菌、犁頭霉菌絲在5天內(nèi)菌絲的長度逐漸生長延伸，其菌絲在后期不在生長。犬小孢子菌、馬內(nèi)菲青霉、暗色真菌、念珠菌其菌絲在10天內(nèi)菌絲逐漸延伸。須毛癬菌生長速度最快，犬小孢子菌適中，念珠菌最慢。

圖3 不同菌菌絲長度變化曲線

4 分析與討論

沙氏葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（SDA）由于具備真菌生長所必需的碳源、氮源等，適合絕大多數(shù)真菌的生長，由于SDA 培養(yǎng)基PH值偏酸，較低，可以抑制細(xì)菌的生長，減少培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌污染的情況[14]。皮膚真菌在25℃生長培養(yǎng)，皮膚真菌菌落特征明顯，便于觀察和研究。由于患犬多數(shù)為真菌混合感染，需要多次分離與純化。在試驗(yàn)過程中菌種容易變異，特別是長時(shí)間培養(yǎng)，多次移種等均可造成菌落顏色、質(zhì)地、形態(tài)、菌體的改變，如有些菌落因培養(yǎng)時(shí)間過久由原來的白色變?yōu)榘导t色，菌體由粉狀變?yōu)榻q毛狀。同時(shí)要注意病原真菌對(duì)營養(yǎng)的要求高于一般的真菌,有些菌種更需要供給特殊的營養(yǎng)[15]。

毛癬菌、犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌等引起淺部皮膚感染。資料表明，非皮膚癬菌類如念珠菌、曲霉菌等感染引起的真菌病的比例在逐漸增多[16]。淺部皮膚真菌主要侵犯含有角質(zhì)的組織，如皮膚、毛發(fā)和指甲等，引起各種癬病。深部真菌，如須毛癬菌、阿耶羅毛癬菌、尖端賽多孢子菌、雜色曲霉侵犯皮膚深層和內(nèi)臟，如肺、腎、腦、消化道等器官，危害非常嚴(yán)重[17]。寵物犬臨床表現(xiàn)為食欲下降，呼吸困難，體表被毛易脫落，有膿性結(jié)痂和出血癥狀。

真菌的鑒定方法主要有直接鏡檢、電鏡觀察法、分子生物學(xué)方法，如：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、分子雜交、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析DNA、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、DNA序列分析(DNA sequencing)、基因芯片技術(shù)[18]。本試驗(yàn)采用菌落形態(tài)結(jié)合顯微鏡進(jìn)行真菌的鏡鑒，用小培養(yǎng)的方法來進(jìn)行真菌的鑒定。該方法簡單，易操作，成本不高，既可以觀察菌絲的生長情況，又可以觀察真菌的產(chǎn)孢方式，為真菌的鑒定起了一定的指導(dǎo)作用。但這種方法容易被污染，因此，培養(yǎng)的時(shí)候要注意一個(gè)菌落一個(gè)袋子的方法單獨(dú)培養(yǎng)。

表1 真菌在一定時(shí)間內(nèi)菌絲長度