線粒體DNA與早期胚胎發(fā)育的研究進展

曹亞男，郝建秀，張雯珂，王莉，姚元慶

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線粒體DNA與早期胚胎發(fā)育的研究進展

曹亞男，郝建秀，張雯珂，王莉，姚元慶△

線粒體是胞質(zhì)中獨特的細胞器，為細胞各種代謝提供能量。線粒體具有自己獨立的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA（mtDNA），是細胞核基因組外的遺傳物質(zhì)。在早期胚胎發(fā)育過程中，線粒體會呈現(xiàn)不同的形態(tài)及分布，mtDNA的突變及拷貝數(shù)變化會對胚胎發(fā)育結(jié)局產(chǎn)生重要影響。最新研究表明，線粒體DNA突變增多則mtDNA拷貝數(shù)增加；囊胚期mtDNA拷貝數(shù)多，則胚胎移植成功率高；反之亦然。盡管進行了染色體形態(tài)學和遺傳學檢查，仍有卵母細胞不能成功受精并發(fā)育成完好的胚胎；即使胚胎完好，仍有部分胚胎移植失敗。因此，從mtDNA角度探討提高卵母細胞質(zhì)量的方法對改善輔助生殖技術(shù)中移植成功率具有重要意義。

線粒體；DNA，線粒體；胚胎發(fā)育；卵母細胞；生殖技術(shù)，輔助

【Abstract】Mitochondria， as one of the most important organelles， provides energy for cellualar events.Mitochondria DNAs （mtDNAs） are a set of the genetic materials except for the nuclear genome. The shape anddistribution of mitochondria vary with the oocyte maturation and early embryo development. The mutations ofmtDNAs and the change of copy number were related to the outcomes of embryonic development. It was found thatthe growing mtDNA mutations caused the increased copy number of mtDNAs， and that the increased copy numberof mtDNAs in blastocyst brought the higher success rate of embryo transfer. It is known that a high proportion ofoocytes can not be successfully fertilized or developed to the high-quality embryos despite being chromosomallyand morphologically normal. Some embryos with morphological high-quality are fail to be implanted successfully.It is important to increase the efficiency of embryo transfer by improving the oocyte quality from the perspective ofmitochondria for the assisted reproductive technology （ART）.

【Keywords】Mitochondria；DNA，Mitochondrial；Embryonic development；Oocytes；Reproductive techniques，assisted

（JInt Reprod Health/FamPlan，2016，35：313-316）

作者單位：100853北京，中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科

通信作者：姚元慶，E-mail：yqyao@126.com

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審校者

線粒體是細胞質(zhì)中含量最豐富的細胞器，為細胞各種代謝提供能量。線粒體有自己獨立的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA（mtDNA），其是除核基因外唯一的遺傳物質(zhì)?，F(xiàn)綜述mtDNA對早期胚胎發(fā)育的影響，并從線粒體角度介紹改善卵母細胞質(zhì)量的方法。

1　線粒體與mtDNA

線粒體是細胞質(zhì)中雙層膜細胞器，內(nèi)膜向內(nèi)皺褶形成線粒體嵴，產(chǎn)生能量多的細胞，線粒體嵴的數(shù)目一般也較多。線粒體有許多功能，其中最主要的是以三磷酸腺苷（ATP）的形式提供能量。區(qū)別于體細胞的ATP主要由糖酵解和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生，線粒體ATP的產(chǎn)生是通過氧化磷酸化（OXPHOS）的過程［1-2］。此外，線粒體與卵母細胞激活、鈣振蕩、凋亡等生命過程密切相關(guān)。

線粒體內(nèi)含有mtDNA，因此可以獨立進行復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯［3］。人的mtDNA分子是1個高度扭曲的雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長度約為16.6kb，編碼OXPHOS酶復合體的13個蛋白質(zhì)亞基，以及自身轉(zhuǎn)錄翻譯所需的22種轉(zhuǎn)運RNA（tRNA）和2種核糖體RNA（rRNA），無內(nèi)含子［4］，但突變率約是核DNA的20倍［5］。mtDNA的突變及拷貝數(shù)變化會對早期胚胎的發(fā)育產(chǎn)生重要影響。

2　線粒體及mtDNA與早期胚胎發(fā)育

2.1線粒體與早期胚胎發(fā)育由于哺乳動物中的線粒體是母系遺傳，并且精子所含的線粒體會在受精時消失殆盡［6］，因此MⅡ期的卵母細胞與受精卵含有同一套mtDNA，所以卵母細胞中線粒體的質(zhì)量和數(shù)目會對早期胚胎質(zhì)量產(chǎn)生重要影響。而在卵母細胞成熟的過程中，線粒體扮演著重要角色。有文獻表明線粒體通過在卵母細胞中的分布變化調(diào)節(jié)ATP的生成，并在限制最低水平活性氧簇（ROS）的條件下，迅速、有效地為細胞“定點”提供能量［7］。葛紅山等［8］利用小鼠建立OXPHOS抑制模型，發(fā)現(xiàn)線粒體能量缺乏顯著降低卵子的核成熟率、ROS生成、紡錘體/染色體結(jié)構(gòu)完整率和囊胚形成率。同時，有研究表明線粒體的功能成熟影響早期胚胎的發(fā)育潛能［9］。

在早期胚胎中，線粒體的數(shù)目并不增加［10］，但由于胚胎發(fā)育所需要的能量增多，所以線粒體不得不通過形態(tài)和分布的變化來提高工作效率。例如線粒體形態(tài)變得更加復雜、嵴的數(shù)目更多、形狀更加拉長等，而當細胞分化為滋養(yǎng)外胚層（TE）和內(nèi)細胞核團（ICM）時這種變化尤為明顯［11-12］。

2.2m tDNA與早期胚胎發(fā)育

2.2.1mtDNA突變由于mtDNA缺乏類似核基因的修復機制及組蛋白的保護，因此mtDNA突變率更高。目前發(fā)現(xiàn)大約有150種線粒體突變，其中約15%

來源于母源性線粒體基因，mtDNA突變會導致線粒體OXPHOS能力降低，從而降低卵母細胞受精率和胚胎發(fā)育潛能［13］。有研究檢測到人卵母細胞mtDNA 5 286 bp的缺失，并證實這種缺失會降低臨床體外受精（IVF）的成功率［14］。尤其是對于高齡婦女，Keefe

等［15］首次發(fā)現(xiàn)高齡婦女的卵巢組織、卵子及顆粒細胞出現(xiàn)高的mtDNA 4 977 bp缺失。Seifer等［16］研究顯示高齡婦女卵子mtDNA突變率及缺失顯著高于年輕婦女。有研究用基因改造工程方法使mtDNA突變累積到9個月時，小鼠出現(xiàn)卵巢功能早衰［17］。這些結(jié)果與臨床高齡婦女IVF成功率低的事實是相符的。線粒體能量產(chǎn)生過程中釋放大量氧自由基，高齡婦女的抗氧化能力下降，自由基減少，ROS堆積，可能是高齡婦女mtDNA突變率高的原因。同時伴隨的供能ATP減少，導致卵母細胞減數(shù)分裂過程中染色體分離障礙，形成非整倍體胚胎，而非整倍體胚胎是反復種植失敗和反復流產(chǎn)的主要原因［18］。由此可知，mtDNA突變對卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育具有重要影響。

2.2.2mtDNA拷貝數(shù)卵母細胞線粒體的含量即

mtDNA的拷貝數(shù)，已有研究表明在原則上卵母細胞線粒體只含有1個或2個基因組［19］，聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)檢測人成熟卵子中mtDNA含量約為

20 000～800 000個拷貝數(shù)不等［20］，而且從受精后到移植早期時線粒體總數(shù)也不再增加［10，19］。在每次卵裂前，微管都會牽動線粒體均勻分布在原核核周，以保證細胞分裂時線粒體會平均分配［21］。那些沒有被均等分配的細胞會發(fā)生卵裂球的細胞消融，而這會影響后續(xù)胚胎的發(fā)育［22］。而且，伴隨胚胎發(fā)育中細胞的分裂，mtDNA不斷地被分到每個細胞中去，直到胚胎發(fā)育第5～6天時，每個細胞中含有的mtDNA拷貝數(shù)顯著少于最初卵母細胞或者受精卵的mtDNA拷貝數(shù)。累積在卵母細胞中mtDNA直到囊胚形成時復制才重新啟動，因此卵母細胞中mtDNA的含量與受精結(jié)局和胚胎發(fā)育能力密切相關(guān)［23-24］。由于mtDNA拷貝數(shù)可以表示卵母細胞中mtDNA的含量［25］，所以，保證受精后胚胎能完成發(fā)育的mtDNA拷貝數(shù)就是卵母細胞MⅡ期中線粒體的含量［19］。許多研究表明，卵母細胞mtDNA的含量與受精相關(guān)［23，26］。Santos等［23］的研究表明，一方面，退化的卵母細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)也相對較少；另一方面與受精成功組相比，受精失敗組的卵母細胞內(nèi)mtDNA拷貝數(shù)顯著減少，但并未證明未受精卵母細胞中低含量的mtDNA導致了受精失敗。也有研究認為兩者不相關(guān)［27］。

盡管有研究表明胚胎從卵裂期到囊胚形成期的發(fā)育要靠線粒體維持［28］，但這在一些動物模型實驗中卻并不成立。在1個線粒體轉(zhuǎn)錄因子A敲除的小鼠模型中，卵母細胞中線粒體數(shù)目的減少并不影響受精和早期胚胎發(fā)育［13］。從生物進化的角度看，如果卵母細胞和胚胎依靠外部的代謝為來源，那么進化就應該賦予胚胎絕對的能增加其營養(yǎng)和氧氣交換能力的優(yōu)勢。相反，卵母細胞和早期胚胎形狀的特異使其具有很小的表面積并且能量交換能力差，所以，進化賦予其卵母細胞時期累積的線粒體以便提供給胚胎發(fā)育所必需的能量。但是，在代謝原料減少等特殊情況下，細胞會反應性地增加mtDNA的拷貝數(shù)，試圖產(chǎn)生更多的線粒體。

對于早期胚胎中mtDNA與早期胚胎發(fā)育的關(guān)系，有學者提出早期胚胎中的線粒體含量存在一個閾值，高于閾值時胚胎能正常發(fā)育，低于閾值時則導致胚胎發(fā)育停滯，如前文所述，過少的線粒體可影響微管的功能，出現(xiàn)紡錘體異常，胚胎染色體倍性發(fā)生改變［29］。然而近期研究表明，胚胎中mtDNA拷貝數(shù)的增加與代謝性應激有關(guān)，而胚胎能通過增加mtDNA的含量來彌補能量的不足。在卵母細胞成熟的過程中，能量應激與先天因素有關(guān)，并且對mtDNA突變引起的呼吸鏈受損做出反應。與此結(jié)論一致的一項研究表明，在從胚泡到囊胚發(fā)育的過程中，線粒體肌病、腦病等疾病中mtDNA的突變會導致mtDNA拷貝數(shù)增加［30］。

目前，已有2項實驗室研究證明，整倍體胚胎中含有mtDNA拷貝數(shù)多則胚胎移植發(fā)育潛力低［31-32］。Diez-Juan等［31］的研究證實了基于mtDNA拷貝數(shù)的線粒體評分（Ms）對臨床工作是有幫助的。研究者分析了270例單胚胎移植患者的290個整倍體胚胎，第3天胚胎Ms＜34（MsA）的胚胎移植率（IR）是59%（n= 51）；Ms 34～52（MsB）的IR是44%（n=52）；Ms 52～97 （MsC）的IR是42%（n=50）；Ms＞97（MsD）的IR是25% （n=52）；Ms＞160（n=22）不能進行移植。在胚胎發(fā)育到第5天時，Ms＜18.19（MsA）的IR是81%，Ms18.19～24.15（MsB）的IR是50%（n=16）；Ms 24.15～50.58 （MsC）的IR是62%（n=16）；Ms＞50.58（MsD）的IR是18%（n=17）；Ms＞60（n=7）不能進行移植。這一結(jié)果掀起了mtDNA拷貝數(shù)與胚胎發(fā)育潛力的新一輪研究，確定能夠保證順利受精和胚胎發(fā)育的卵母細胞中mtDNA拷貝數(shù)成為至關(guān)重要的問題。

綜上，mtDNA的突變和拷貝數(shù)異常會影響線粒體功能，從而對卵母細胞質(zhì)量和早期胚胎的發(fā)育產(chǎn)生不良影響，而關(guān)于卵母細胞發(fā)育不同時期的最佳mtDNA拷貝數(shù)的問題則尚待進一步研究。

3改善線粒體質(zhì)量的方法

關(guān)于改善線粒體質(zhì)量的方法，總結(jié)起來，可分為線粒體替代治療和線粒體藥物治療兩大類。線粒體替代治療又包括卵子細胞質(zhì)移植、原核移植（PNT）、線粒體移植和極體移植。對于異體移植，德克薩斯大學法學院的Robertson［33］認為，即使建立了安全有效的卵子構(gòu)建方法，還要面對由此引發(fā)的倫理問題：①孕母的基因分離；②對捐卵者的影響；③基因組的干擾。線粒體移植和極體移植都屬于自體移植，它們避免了異體移植的缺點，并逐漸成為近來研究的熱點。線粒體藥物治療有生長激素（GH）輔助治療、輔酶Q10等。

4展望

眾所周知，隨著糖尿病、肥胖癥、高齡不孕女性的日益增多，越來越多的患者借助輔助生殖技術(shù)生育，但胚胎移植成功率一直不很理想，盡管進行了染色體形態(tài)學和遺傳學檢查，仍有卵母細胞不能成功地發(fā)育成完好的胚胎，即使胚胎完好，多數(shù)也會以移植失敗而告終。究其原因，是沒有充分考慮人類胚胎發(fā)育能力的能量供應問題［34］。目前對線粒體基因組測序的主要方法有第一代基因測序技術(shù)、PCR技術(shù)、第二代基因測序技術(shù)，以及滾環(huán)擴增技術(shù)和線粒體間接測序，每種方法各有利弊［35］。由于mtDNA對早期胚胎發(fā)育的重要影響，實現(xiàn)利用已建立的各種方法對更大樣本以及多中心的mtDNA拷貝數(shù)閾值確定的研究已成當務(wù)之急！

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［本文編輯王昕］

Research Progress of Mitochondrial DNA in Early Embryo Development

CAO Ya-nan，HAO Jian -xiu，ZHANG Wen-ke，WANG Li，YAO Yuan-qing. Department of Obstetrics and Gynecology，Chinese PLA GeneralHospital，Beijing 100853，China

YAO Yuan-qing，E-mail：yqyao@126.com

（2016-03-23）