鼻咽癌高癌家系外周單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蘭炎根，陳舒華，陳凱，田道法，何迎春，黃冬云

(1.梅州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉一科，廣東 梅州 514000；2.佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 佛山 528000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410008)

鼻咽癌高癌家系外周單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蘭炎根1，陳舒華2，陳凱1，田道法3，何迎春3，黃冬云1

(1.梅州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉一科，廣東 梅州 514000；2.佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 佛山 528000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410008)

目的 尋找鼻咽癌高癌家系鼻咽癌的癌變機(jī)制、早期診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測的外周血特異性分子標(biāo)志物。方法 利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)分別分離鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)藍(lán)銀染色后進(jìn)行圖像分析，并對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜得到肽質(zhì)量指紋圖譜，搜索數(shù)據(jù)庫鑒定部分差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果 建立了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞的2-DE圖譜；發(fā)現(xiàn)并鑒定了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對(duì)照組之間的差異表達(dá)大于2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)19個(gè)，這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)主要為蛋白質(zhì)合成與分解、抗氧化應(yīng)激、分子伴侶、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)、三大代謝相關(guān)酶類以及信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)等。結(jié)論 通過對(duì)鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及健康對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)學(xué)研究，篩選并鑒定到19個(gè)與鼻咽癌高癌家系鼻咽癌發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)，其中HSP27、Protein S100-A9、Prohibitin可能成為鼻咽癌高癌家系鼻咽癌癌變機(jī)制、早期診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測的外周血特異性分子標(biāo)志物。

鼻咽癌；高癌家系；外周血單個(gè)核細(xì)胞；蛋白質(zhì)組學(xué)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種主要來源自鼻咽黏膜上皮細(xì)胞癌變的惡性腫瘤，據(jù)研究統(tǒng)計(jì)其致死率約占全部惡性腫瘤致死率的2.81%，在我國的癌癥致死疾病中排名第八，在頭頸惡性腫瘤中一直是首要致死腫瘤。研究表明，鼻咽癌病例的80%以上發(fā)生在我國，是國內(nèi)重點(diǎn)防治的十大惡性腫瘤之一。鼻咽癌發(fā)病率多發(fā)生于我國南方地區(qū)，以廣東省最高，其次依次是廣西、湖南、福建、江西等省區(qū)。鼻咽癌的男性發(fā)病率超過0.03%，在女性達(dá)到0.015%以上。通常情況下鼻咽癌可發(fā)生于各年齡階段，年齡跨度3～90歲，但30～50歲為鼻咽癌發(fā)病高峰年齡段，另外有研究表明鼻咽癌發(fā)病還表現(xiàn)出明顯的家族聚集現(xiàn)象[1-2]，且這種聚集性在不同人種中均有發(fā)生。分析已發(fā)表的文獻(xiàn)可知鼻咽癌高癌家系中的鼻咽癌大概占總鼻咽癌發(fā)病數(shù)的7.7%。鼻咽癌患者的一級(jí)親屬是患鼻咽癌的高危人群，源于鼻咽癌患者的高家族聚集性[3]。調(diào)查研究顯示：約10%的鼻咽癌患者具有癌家族史，其中約有50%具有鼻咽癌家族史，而大部分患者集中在一級(jí)親屬。因此，鼻咽癌高癌家系中鼻咽癌患者的早發(fā)現(xiàn)和診斷對(duì)其治療和預(yù)后具有極其重要的意義。

在本研究中，我們應(yīng)用分離純化的方法提取鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和鼻咽癌高癌家系成員外周血淋巴細(xì)胞的蛋白，并以健康人作為對(duì)照，經(jīng)雙向凝膠電泳(2-DE)雙得到分辨率和重復(fù)性較高的圖譜，利用PDQuest軟件比較分析圖譜中差異表達(dá)量兩倍以上的蛋白點(diǎn)，并用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白分析，鑒定相關(guān)的蛋白質(zhì)，為研究鼻咽癌高癌家系腫瘤發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床對(duì)鼻咽癌高癌家系高危人群鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷以及尋找藥物治療耙標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 鼻咽癌高癌家系選定標(biāo)準(zhǔn)在先證鼻咽癌患者的一級(jí)親屬中(包括父母，同胞兄弟姊妹，子女)，有2人以上(含2人)經(jīng)病理活檢確診為鼻咽癌的家系。以26例2008-2009年在佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻喉科門診確診為鼻咽癌的病例為研究對(duì)象。研究分為三組，第一組為鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者，共計(jì)11個(gè)家系，11人，其中男性9人，女性2人，平均年齡(46.47±12.85)歲；第二組為鼻咽癌高癌家系核心成員(包括父母、子女及同胞)，共計(jì)15人，其中女性7人，男性8人，平均年齡(44.45±13.49)歲；第三組為正常人組，共計(jì)15人，其中男性9人，女性6人，平均年齡(50.74±11.03)歲。

1.2 試劑 Amersham Biosciences公司產(chǎn)品：Sample Grinding Kit組織研磨試劑盒、2D Quant Kit蛋白定量試劑盒、Triton X-100、NP-40、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、硫脲、IPG緩沖液(pH3-10NL)、兩性電解質(zhì)(pharmalyte，pH3-10)、覆蓋液、碘乙酰胺、固相pH梯度干膠條(IPG strip pH3-10NL，24 cm)、雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)均；Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品：丙烯酰胺、硫代硫酸鈉、碳酸氫銨、CHAPS、SDS、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲-酮-胰蛋白酶(TPCK-Trypsin)、基質(zhì)а-氰基-4-羥基肉桂酸、甘氨酸、Tris、三氟乙酸、鐵氰化鉀、甲叉雙丙烯酰胺；碳酸鈉、硝酸銀、甘油、甲醛、EDTA二鈉、戊二醛、乙醇和乙酸均為國產(chǎn)分析純級(jí)別。

1.3 儀器 Applied Biosystem公司的 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀(Voyager-DE STR 4307)；PDQuest 7.0凝膠圖像分析軟件(Bio-Rad公司)；Imagescanner掃描儀、IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT垂直電泳槽均為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 在無菌條件下采集靜脈血10 mL，加入含有肝素的無菌抗凝管中，立即輕輕搖勻樣品。加入等體積無菌D-Hank's液(NaCl 8.0 g，NaH2PO4·12H2O 0.134 g，KH2PO40.06 g，KCl 0.4 g，NaHCO30.35 g，溶于1 000 mL超純水)。抽取淋巴細(xì)胞分層液8 ml加入離心管(50 mL)中，沿管壁慢速加人稀釋血液，保持分離界面穩(wěn)定，使兩種樣品不相混，在20℃2 000 r/min條件下離心30 min，吸取淋巴細(xì)胞層加人50 mL離心管中，用5倍體積的D-Hank's液洗滌兩次，室溫條件下依次在2 000 r/min和1 500 r/min離心10 min，將混雜的血小板去除，將10 mL超純水混合細(xì)胞團(tuán)塊1 min后迅速加入等體積的1.8%NaCl溶液，2 000 r/min離心后棄上清，-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 抽提細(xì)胞總蛋白 使用組織裂解液提取鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系親屬及正常人外周血淋巴細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)，組織裂解液含：7 mol/L尿素、二硫蘇糖醇、5 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，2 mol/L硫脲、2%NP-40、100 mmol/L DTT、4%CHAPS、1%Triton X-100、40 mmol/L Tris、2% Pharmalyte、0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。渦旋充分混勻后置于冰上孵育1 h后12 000 r/min，4℃條件下離心1 h，吸取上清移入新EP管中。吸取5 μL上清，使用2D Quant Kit定量試劑盒測定蛋白的濃度。

1.4.3 雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析 主要參照文獻(xiàn)[4]的方法。

1.4.4 圖像分析 使用Imagescanner掃描儀進(jìn)行掃描；通過點(diǎn)檢測、匹配、量化比較獲取斑點(diǎn)的相關(guān)信息，分析使用PDQuest圖像分析軟件進(jìn)行。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的分析均由Excel 2000軟件完成。

1.4.5 數(shù)據(jù)庫查詢 使用軟件Mascot Distiller對(duì)肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)進(jìn)行單同位素峰識(shí)別，將所獲得的肽端的質(zhì)荷比(m/z)數(shù)值輸入Mascot質(zhì)譜搜索軟件(Matrixscience)進(jìn)行分析，從數(shù)據(jù)庫為物種來源為人類的SWISS-PROT的Uniprot和NCBI非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，條件：最大允許肽段質(zhì)量誤差100 ppm，選擇[M+H]+離子種類和單同位素峰，選擇半胱氨酸碘乙酰胺化為固定修飾，最大允許的漏切的胰酶酶切位點(diǎn)數(shù)為1。

2 結(jié)果

2.1 雙向凝膠電泳圖譜及差異蛋白質(zhì)點(diǎn) 雙向凝膠電泳將外周血單個(gè)核細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離，考馬斯亮藍(lán)染色后得到分辨率高、重復(fù)性好、背景清晰的鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及正常人組2-D凝膠圖譜各3塊。PDQuest圖像分析顯示：9塊膠的平均點(diǎn)數(shù)為(1 224±45)，各組之間擁有(92±1.6)%的平均匹配率。計(jì)算統(tǒng)計(jì)三塊膠后得到組內(nèi)的雙向電泳凝膠的平均膠(即組內(nèi)凝膠上的同一蛋白質(zhì)點(diǎn)的平均表達(dá)量)，某個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量按照公式：膠上的灰度體積=面積×灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終得到鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者、鼻咽癌高癌家系成員及正常人組外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)變化差異大于兩倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)共22個(gè)(圖1)。各組人外周血單個(gè)核細(xì)胞雙向凝膠電泳圖譜及差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，400 μg總蛋白質(zhì)經(jīng)第一相pH3-10NL等電聚焦和二相10% SDS-PAGE分離后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和后續(xù)掃描后，PDQuest軟件分析顯示每塊膠平均點(diǎn)數(shù)為1 245個(gè)。

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢 經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀分析后差異蛋白質(zhì)點(diǎn)得到PMF圖譜后，使用Mascot質(zhì)譜搜索引擎搜索SWISSPROT的Uniprot數(shù)據(jù)庫，鑒定得到19個(gè)蛋白質(zhì)。5號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的PMF圖譜和SWISSPROT數(shù)據(jù)庫中的搜索結(jié)果分別見圖2和圖3，19個(gè)得到鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的名稱和表達(dá)量變化的倍數(shù)見表1和表2。

圖1 三組研究對(duì)象2-DE圖注：a，高癌家系癌患者組2-DE圖；b，高癌家系癌患者成員組2-DE圖；c，健康家系對(duì)照組2-DE圖。

圖2 質(zhì)譜分析所得第5號(hào)蛋白質(zhì)點(diǎn)的PMF圖譜注：峰旁標(biāo)示數(shù)字表明了肽段的單同位素峰[M+H]+的質(zhì)量數(shù)。

圖3 第5號(hào)差異點(diǎn)在SWISSPROT的Uniprot數(shù)據(jù)庫中的搜索結(jié)果注：質(zhì)譜分析得到蛋白質(zhì)點(diǎn)5的PMF經(jīng)Mascot質(zhì)譜搜索引擎搜索蛋白數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)的得分情況(98分)，鑒定為Protein S100-A9。

表1 鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者組對(duì)正常人組差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定

表2 鼻咽癌高癌家系成員組對(duì)正常人組差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定

3 討論

本研究中使用患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)作為研究樣本，這就使得不同患者間出現(xiàn)個(gè)別差異性蛋白，患者的雙向電泳凝膠圖像重復(fù)性不太好。同時(shí)受限于臨床標(biāo)本采血量的限制，單例患者分離得到的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量大約為10×106個(gè)，總蛋白為200～400μg。本研究實(shí)驗(yàn)成本較高，為充分分析研究樣本，又使得研究結(jié)果具有良好的代表性，采取了將一部分3～5人提取總蛋白混合后再上樣進(jìn)行雙向電泳凝膠的方法，這樣在有效保證了在高分辨率的情況下使得雙向凝膠電泳的又具有良好的可重復(fù)性高，也使具有意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)能更明顯地呈現(xiàn)出來。混合外周血單個(gè)核細(xì)胞研究的優(yōu)點(diǎn)在于，不僅在同樣研究條件情況下盡可能多增加樣本分析數(shù)量，這就能消除一些非特異性干擾，使有意義的蛋白質(zhì)在多樣本的情況下表達(dá)情況得到更好的保證，使研究結(jié)果更加能夠代表總體真實(shí)情況。另外對(duì)于利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)疾病蛋白標(biāo)志物或耐藥蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選，這種多樣品混合的方式也是一個(gè)比較經(jīng)濟(jì)可行的方案，但是個(gè)體情況不能很好地反映出來。本研究獲得了鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和成員，以及正常家系成員的PBMC蛋白質(zhì)表達(dá)譜情況，重復(fù)性較好。外周血單個(gè)核細(xì)胞凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)分別為(1 224±45)、(1 249±43)和(1 180±4)，分別對(duì)應(yīng)92.8%、91.9%和91.6%的組內(nèi)平均匹配率。雙向電泳凝膠進(jìn)行顯色采用改進(jìn)的考染方法，其靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)的考染方法，源于膠本身著色較淺，背景去除較干凈。改進(jìn)的考馬斯亮藍(lán)法染色與傳統(tǒng)的染色方法相比，優(yōu)勢明顯，其靈敏度達(dá)到Ing/蛋白點(diǎn)。使用PDQuest軟件對(duì)差異表達(dá)點(diǎn)進(jìn)行分析后，隨機(jī)選取22個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜的質(zhì)量指紋圖測定，19個(gè)蛋白得到鑒定，表達(dá)明顯增強(qiáng)有10個(gè)，明顯下降的有9個(gè)，這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)主要為蛋白質(zhì)合成與分解、代謝相關(guān)酶類、信號(hào)傳導(dǎo)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)和分子伴侶相關(guān)蛋白質(zhì)六類，經(jīng)進(jìn)一步分析19個(gè)蛋白中的HSP27、Protein S100-A9、Prohibitin可能成為鼻咽癌高血特異性標(biāo)志物。

分子伴侶(molecular chaperones)是進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，能夠結(jié)合和穩(wěn)定其他蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，參與細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一大類分子伴侶，共分為五類，分別為HSP110，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子熱休克蛋白(small heat shock proteins，sHSPs)。熱休克蛋白主要是細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞的存活必不可少。本研究中發(fā)現(xiàn)的HSP27屬于sHSPs亞家族，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此可能與多種腫瘤的產(chǎn)生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)HSP在鼻咽癌中上調(diào)表達(dá)并與鼻咽癌發(fā)生危險(xiǎn)度有一定程度的相關(guān)性[5]。HSP27蛋白在鼻咽癌中的作用機(jī)理有多種可能性：一種可能是作為應(yīng)激蛋白對(duì)腫瘤病理性刺激的一種自我保護(hù)性反應(yīng)，在腫瘤發(fā)生的個(gè)體中反應(yīng)性地發(fā)生作用。另外一種可能性是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。本研究中鑒定出HSP27和HSC70兩個(gè)熱休克蛋白，在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者的PBMC中HSP27及HSC70的表達(dá)量上調(diào)明顯，相對(duì)健康人組的表達(dá)水平，HSP27在鼻咽癌高癌家系成員組中也上調(diào)明顯，與Hela細(xì)胞中發(fā)生的情況相同[6]。從相關(guān)研究可見，HSP27不僅可以參與蛋白質(zhì)的折疊組裝和運(yùn)輸，也可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其功能十分多樣化[7-9]。HSP27能使谷胱甘肽水平增加，對(duì)細(xì)胞的自我解毒也有作用[10]，對(duì)腎臟上皮細(xì)胞粘附和增殖具有促進(jìn)作用，從而抑制其凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌高癌家系中鼻咽癌高癌家系成員及鼻咽癌患者HSP27表達(dá)逐漸明顯增強(qiáng)，推測HSP27可能對(duì)癌細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，與細(xì)胞的解毒、修復(fù)及抑制凋亡可能也有關(guān)聯(lián)，還需要后續(xù)的研究證明其具體的功能。

抗增殖蛋白基因(prohibitin，Phb)是一種潛在的抑癌基因，能在細(xì)胞增殖、分化與凋亡過程中發(fā)揮重要作用[12]。抗增殖蛋白基因定位于17q21，與卵巢癌和乳腺癌易感基因(BRAC1)轉(zhuǎn)座子相鄰[13]，主要通過阻斷DNA合成而對(duì)細(xì)胞增生起負(fù)性調(diào)節(jié)作用[14]。抗增殖蛋白在細(xì)菌、植物、酵母、原蟲及哺乳類等生物細(xì)胞中都有存在?？乖鲋车鞍椎陌被峤Y(jié)構(gòu)十分保守，屬于新型的分子伴侶蛋白，還具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本研究在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者組和成員組中均檢測出抗增殖蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。巧合的是在已有的研究報(bào)道中也發(fā)現(xiàn)抗增殖蛋白在肝細(xì)胞癌[15]、乳腺癌[16]和胃癌[17]的細(xì)胞系中亦同樣有高表達(dá)，這就表明抗增殖蛋白屬于抑癌蛋白，在于腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中廣泛存在。推測在鼻咽癌高癌家系中抗增殖蛋白基因可能發(fā)生了基因突變或者蛋白質(zhì)合成，使之不能行使正常的功能。它在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)早，這就證明抗增殖蛋白很有可能作為鼻咽癌高癌家系鼻咽癌早期診斷的標(biāo)記物,但是需要更進(jìn)一步的更大樣本的試驗(yàn)檢驗(yàn)和驗(yàn)證。

鈣結(jié)合蛋白S100A9是一個(gè)含有114個(gè)氨基酸殘基分子量約為13 000的蛋白，其鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)由兩個(gè)EF手型基序結(jié)構(gòu)組成。鈣結(jié)合蛋白S100A9是將細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變作為中介信號(hào)，從而轉(zhuǎn)換其激動(dòng)或抑制作用。已有的研究報(bào)道表明S100A8和S100A9在肌細(xì)胞粘附、收縮、增殖分化及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用，有關(guān)鈣結(jié)合蛋白與癌癥的研究也主要集中于食道癌、膀胱癌、前列腺癌和胃癌的研究中[18-20]。本研究鑒定出的差異蛋白S100A9在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者和鼻咽癌高癌家系成員組中表達(dá)量逐漸增強(qiáng)，且鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者組的表達(dá)量明顯高于鼻咽癌家系成員組，提示S100A9蛋白可能在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌發(fā)生過程中起重要作用。

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Study on proteome of human peripheral blood mononuclear cells in familial nasopharyngeal carcinoma.

LAN Yan-gen1,CHEN Shu-hua2,CHEN Kai1,TIAN Dao-fa3,HE Ying-chun3,HUANG Dong-yun1.1.Department of Otolaryngology,Meizhou People's Hospital,Meizhou 514000,Guangdong,CHINA;2.Department of Otolaryngology,the Second People's Hospital of Foshan,Foshan 528000,Guangdong,CHINA;3.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410008,Hunan,CHINA

Objective To look for reliable peripheral blood biomarkers for early diagnosis,treatment,mechanism of cancerization and evaluation of nasopharyngeal carcinoma(NPC)from familial nasopharyngeal carcinoma. Methods The proteins of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in nasopharyngeal carcinoma(NPC)from familial nasopharyngeal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults groups were separated by two-dimensional gel electrophoresis(2DGE),respectively.Then gels were stained by blue silver,scanned by ImageScanner and analyzed with PDQuest software.Relative abundance of the protein spots between familial nasopharyngeal carcinoma and health members of familial nasopharyngeal carcinoma groups,and between health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults groups were calculated by comparing spots density volume on the gel. The differentially expressed protein spots were identified by peptide mass fingerprint(PMF)based on matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and database searching.Results Well-resolved and reproducible 2DGE maps of PBMC from patients with NPC from familial nasopharyngal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults were acquired.Nineteen more than 2 folds differentially expressed protein spots were identified.Some of these proteins participated protein synthesis and degradation,or chaperone,or protection and detoxification,or cytoskeleton,while some of those were involved in metabolism or signal transduction.Conclusion Through comparative proteomic analysis of PBMC in patients with NPC from familial nasopharyngal carcinoma,health members of familial nasopharyngeal carcinoma or healthy adults,19 aging related colonic epithelial proteins were identified.HSP27,Protein S100-A9,Prohibitin may become reliable peripheral blood biomarkers for early diagnosis,treatment,mechanism of cancerization and evaluation of NPC from familial nasopharyngeal carcinoma prognosis.

Nasopharyngeal carcinoma(NPC);Familial;Peripheral blood mononuclear cells;Proteomics

R739.63

A

1003—6350（2016）15—2419—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.004

2016-03-17)

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30572408）

蘭炎根。E-mail：775333764@qq.com