高效液相色譜法同時測定南葶藶子中6種成分含量*

姜 艷，尹學(xué)艷，李 晉，王 暉，竇志英，常艷旭

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

·中藥研究·

高效液相色譜法同時測定南葶藶子中6種成分含量*

姜 艷1，尹學(xué)艷2，李 晉1，王 暉2，竇志英2，常艷旭1

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

[目的]建立高效液相色譜法（HPLC-UV）同時測定南葶藶子中6種成分（槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚，異鼠李素）的含量測定方法，為南葶藶子質(zhì)量評價提供技術(shù)支撐。[方法]采用反相高效液相色譜法，Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4．6 mm×100 mm，1．8 μm），流動相為乙腈-0．1%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速0．3 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為265 nm。[結(jié)果]6種成分線性關(guān)系良好，加樣回收率范圍是99．1%～103．0%。[結(jié)論]本研究建立的南葶藶子中6種成分含量測定方法準(zhǔn)確、可靠，可用于南葶藶子的質(zhì)量控制。

南葶藶子；HPLC-UV；含量測定

葶藶子為十字花科植物播娘蒿 Descurainia sophia（L．）Webb．ex Prantl．或獨行菜 Lepidium apetalum Willd．的干燥成熟種子。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，前者習(xí)稱為“南葶藶子”，后者習(xí)稱為“北葶藶子”。葶藶子性味辛，苦，大寒，功擅瀉肺平喘，行水消腫[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，葶藶子具有止咳平喘、強心、利尿、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等藥理作用[2-10]?；瘜W(xué)成分主要包括黃酮類、硫苷和異硫氰酸類、強心苷類、脂肪油類、苯丙素類、有機酸類、生物堿類、揮發(fā)油類、香豆素類等，其中黃酮類化合物，因具有廣譜的藥理作用而備受矚目[11-19]。因此，建立葶藶子多種黃酮類成分同時定量分析方法對葶藶子的質(zhì)量控制具有重要意義。本研究選擇了槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚及異鼠李素為質(zhì)量控制指標(biāo)，擬建立6種成分同時定量的高效液相色譜分析方法（HPLC-UV），并對不同產(chǎn)地的南葶藶子藥材中這6種指標(biāo)性成分的含量進行了測定，為葶藶子質(zhì)量控制及資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），SB-1000YDTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技有限公司）；3K15高速離心機（美國Sigma公司）；Mill-QⅡ型超純水器（Millipore公司）；AX205十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；萬分之一電子天平（Sartorius）；BP121S渦旋混合器（XW-80A上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試藥

1.2.1 試劑 乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲醇（分析純，天津康科德科技有限公司）；超純水（Millipore公司）；磷酸（分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）。

1.2.2 藥品 槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（純度為98%，均購于天津市士蘭科技發(fā)展有限公司）；槲皮素，山奈酚，異鼠李素（純度為98%，均購于成都曼思特生物科技有限公司）。南葶藶子藥材共計26批次（均粉碎，過60目篩，其中S1-S18為生品，S19-S26為炒制品），來源見表1。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4．6 mm×100 mm，1．8 μm)；流動相：0．1%磷酸水（A）-乙腈（B）；柱溫：30℃；流速：0．3 mL/min；檢測波長：265 nm；進樣量：5 μL；分析時間：66 min；梯度洗脫程序為0～5 min，5～12（B%）；5～30 min，12～18（B%）；30～33 min，18～24（B%）；33～43 min，24～26（B%）；43～48 min，26～35（B%）；48～65 min，35～35（B%）；65～66 min，35～5（B%）。

表1 南葶藶子樣品來源Tab.1 Sample source of Semen Descurainiae

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取南葶藶子藥材粉末（60目）0．750 g，置于錐形瓶中，加10 mL 60%甲醇溶液，稱質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷至室溫，60%甲醇溶液補足失質(zhì)量，搖勻，取上清溶液，14 000 r/min離心10 min，取上清液，進樣分析。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取5．00 mg槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚，異鼠李素對照品分別置于5 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得1．00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 分別精密稱取對照品溶液適量，加入甲醇，配制成含槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚，異鼠李素的混合對照品溶液，將混合對照品溶液稀釋系列濃度，分別進樣分析，計算峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)（Y），峰面積（X）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2 精密度 取同一混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，分別計算槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚，異鼠李素色譜峰的保留時間和峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.4.3 重現(xiàn)性 精密稱取同一批次南葶藶子樣品粉末6份，按制備方法制備供試品溶液，進樣分析，分別測定槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚、異鼠李素色譜峰的保留時間和峰面積，計算其RSD值。

2.4.4 穩(wěn)定性 取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，分別測定槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚，異鼠李素色譜峰的保留時間和峰面積，計算RSD值。

2.4.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的南葶藶子藥材粉末（60目）0．375 g至錐形瓶中，平行取樣3份，分別加入各對照品溶液適量，加10 mL 60%甲醇，稱質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷至室溫，60%甲醇補足失質(zhì)量，搖勻，取上清至離心管中，14 000 r/min離心10 min，取上清液，進樣測定，計算6種成分的加樣回收率。

2.5 樣品含量的測定 精密稱取26批南葶藶子藥材粉末（60目），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，采用峰面積外標(biāo)法計算各化合物的含量。

3 結(jié)果

3.1 正交實驗設(shè)計優(yōu)選南葶藶子提取條件 為優(yōu)化最佳提取條件，本研究選用L9(34)正交實驗設(shè)計，采用3因素3水平對不同提取甲醇溶劑濃度（60%、70%、80%）、提取時間（30、40、50 min）、料液比（1∶4、1∶20、3∶40）等進行優(yōu)化，以槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚和異鼠李素百分含量之和為指標(biāo)，對實驗結(jié)果進行直觀分析和方差分析，結(jié)果分別見表2和表3。

表2 直觀分析Tab.2 Intuitive analysis

由正交優(yōu)化統(tǒng)計學(xué)直觀分析表可知，影響葶藶子提取率的因素的主次順序為B（料液比）＞A（提取時間）＞C（甲醇濃度）。由方差分析數(shù)據(jù)可知，提取時間、甲醇濃度和物料比差異均無顯著性，因此由直觀分析的數(shù)據(jù)分析得到最佳提取條件為料液比3∶40，提取時間30 min，甲醇濃度60%。

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

3.2 方法學(xué)驗證 6個化學(xué)成分的線性回歸方程見表4，結(jié)果表明6個化合物線性關(guān)系良好。

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚，異鼠李素色譜峰保留時間和峰面積的RSD均小于5%（表5），表明該方法精密度、重復(fù)性良好，樣品在24 h穩(wěn)定。

從表6可知，6個成分的平均回收率在99．1%～103．0%范圍內(nèi)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。上述研究結(jié)果證明所建立分析方法可用于南葶藶子中6種成分含量測定。

表4 6個化學(xué)成分色譜峰面積及濃度的線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships for peak area and concentration of six components

表5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性Tab.5 Results of precision,repeatability and stability%

表6 加樣回收率Tab.6 Results of recovery %

3.3 樣品含量測定 利用所建立的高效液相色譜法，對不同產(chǎn)地的18批南葶藶子藥材和8批炒南葶藶子進行了含量測定（表7）。典型色譜圖見圖1。研究結(jié)果表明槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素和總黃酮含量平均值分別為0.094 6%、0.016 9%、0.0161%、0.00198%、0.00019%、0.00803%和0.1315%。從所測定樣品可知槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷是南葶藶子及其飲片的主要黃酮類成分，可作為其藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。槲皮素、山奈酚、異鼠李素3種黃酮苷元含量較低，不適宜作為指標(biāo)性成分。因此，本研究為南葶藶子質(zhì)量評價指標(biāo)選擇提供了依據(jù)。

4 討論

本研究結(jié)果表明槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、山奈酚、異鼠李素和總黃酮含量平均值分別為0.094 6%、0.016 9%、0．0161%、0．00198%、0．00019%、0．00803%和0．1315%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為19%、22%、30%、175%、294%、345%和17%，表明不同產(chǎn)地南葶藶子質(zhì)量存在較大的差異，尤其槲皮素、山奈酚和異鼠李素3種微量成分含量差異較大。2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，葶藶子藥材中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（C33H40O22）含量不得少于0．075%，其飲片不得少于0．080%[1]。從表7可知，26批南葶藶子樣品中，除S13、S21以及S22批樣品的槲皮素3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷的含量低于國家藥典規(guī)定外，其余各批次均符合國家藥典規(guī)定，不能較好體現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品之間質(zhì)量的異質(zhì)性。因此，本研究所建立6個成分同時定量分析方法，能夠更加全面評價南葶藶子的藥材質(zhì)量。

表7 不同產(chǎn)地葶藶子中6種成分含量Tab.7 Contents of six components from different producing place %

圖1 典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC chromatogram

通過對19批次不同產(chǎn)地的生南葶藶子6種成分含量結(jié)果的分析，可發(fā)現(xiàn)槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷含量相對較穩(wěn)定，不同產(chǎn)地樣品含量差異在2～3倍以內(nèi)，可能與藥材產(chǎn)地土壤、氣候條件，采收時期因素有關(guān)，提示有必要加強南葶藶子栽培管理，從源頭保證其質(zhì)量。從9批不同產(chǎn)地的炒葶藶子6種成分含量結(jié)果可知，炮制后南葶藶子槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量與生葶藶子相比，含量顯著性差異，提示3種微量成分不是炒葶藶子與生葶藶子藥效差異主要原因。同時發(fā)現(xiàn)三槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷不同采收地之間也存在較大差異，可能與葶藶子炮制不規(guī)范有關(guān)，提示需要細(xì)化其炮制工藝參數(shù)，建立統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的中藥葶藶子炮制工藝規(guī)范，確保南葶藶子及其飲片的質(zhì)量。

5 結(jié)論

本研究建立了同時測定南葶藶子中槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，槲皮素，山奈酚和異鼠李素6種黃酮類成分含量的高效液相色譜法，并成功用于不同產(chǎn)地的南葶藶子和炒南葶藶子樣品中6種成分含量測定，闡明了不同產(chǎn)地藥材及炮制品的質(zhì)量差異，為南葶藶子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了簡單、快速的分析方法，為南葶藶子藥材的質(zhì)量評價提供了技術(shù)支撐。

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Simultaneous determination of six chemical components for quality control of Semen Descurainiae by HPLC-UV

JIANG Yan1,YIN Xue-yan2,LI Jin1,WANG Hui2,DOU Zhi-ying2,CHANG Yan-xu1
（1．Tianjin State Kay Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China；2.Traditional Chinese Medicine College，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]An HPLC-UV method was established for simultaneous determination of the content of six components(quercetin-3-O-β-D-glucise-7-O-β-D-gentiobiosiden,quercetin-3-O-β-D-glucoside,isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside,quercetin,kaempferol and isorhamnetin)in Semen Descurainiae in order to provide a theoretical basis for its quality assessment．[Methods]The analysis was performed on Agilent eclipse plus C18column (4．6 mm×100 mm and 1．8 μm)．Acetonitrile-0．1%phosphoric acid water solution was used as mobile phase at flow rate of 0．3 mL/min．The column temperature was 30℃and the detection wavelength was set at 265 nm．[Results]Six components were well separated with good linear relationship．The recoveries were 99．1%～103．0%．[Conclusion]The accurate and reliable HPLC-UV method was established and could be used for quality evaluation of Semen Descurainiae.

Semen Descurainiae;HPLC-UV;content determination

R284．2

A

1672-1519（2016）12-0750-06

2016-04-26）

（本文編輯：高 杉，馬 英）

10．11656/j．issn．1672-1519．2016．12．12

中藥標(biāo)準(zhǔn)飲片制備技術(shù)規(guī)范制定（2014FY111100）；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃資助（TD12-5033）。

姜 艷（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

常艷旭，E-mail:tcmcyx@126．com。