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    UPLC-Q-TOF-MS法分析連花清瘟膠囊的入血成分*

    2016-03-13 09:03:06賈偉娜劉金平王春華
    天津中醫(yī)藥 2016年12期
    關(guān)鍵詞:連花清黃素綠原

    于 華,賈偉娜,劉金平,朱 彥,王春華

    (1.天津中醫(yī)藥大學天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室,天津 300193;2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心,天津 300457)

    UPLC-Q-TOF-MS法分析連花清瘟膠囊的入血成分*

    于 華1,2,賈偉娜1,2,劉金平1,2,朱 彥1,2,王春華1,2

    (1.天津中醫(yī)藥大學天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室,天津 300193;2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心,天津 300457)

    [目的]采用UPLC-Q-TOF-MS方法,首次對中成藥連花清瘟膠囊經(jīng)SD大鼠灌胃給藥后吸收入血的成分進行分析。[方法]采用大鼠眼眶后靜脈叢取血,甲醇沉淀蛋白,采用C18色譜柱,以甲醇-0.1%甲酸水為流動相進行梯度洗脫,負離子模式采集,分別對空白血漿、混合對照品溶液及連花清瘟膠囊給藥后血漿同時進行ULC-Q-TOF-MS分析。[結(jié)果]根據(jù)色譜峰保留時間及質(zhì)譜碎裂規(guī)律,結(jié)合文獻和對照品的相關(guān)信息,確認了連花清瘟膠囊22個吸收入血原型成分,主要為黃酮、蒽醌、苯丙素和環(huán)烯醚萜類。[結(jié)論]該研究初步明確了連花清瘟膠囊的入血原型成分,為后期體內(nèi)代謝研究提供了前期的科學研究數(shù)據(jù)。

    連花清瘟膠囊;入血成分;超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

    連花清瘟膠囊由經(jīng)典名方“麻杏石甘湯”和“銀翹散”兩種方劑化裁而來,由金銀花、連翹、魚腥草、大黃、甘草等13味中藥制成,具有清瘟解毒、宣肺泄熱之功效,常用于治療流行性感冒屬熱毒襲肺癥。本課題組前期對連花清瘟膠囊的化學組成、質(zhì)控方法、抗病毒、抗炎的網(wǎng)絡藥理學[1-4]進行了系統(tǒng)的研究。但是連花清瘟膠囊在體內(nèi)以何種成分、何種形式發(fā)揮作用,至今未有研究報道。因此,有必要對連花清瘟膠囊的入血成分進行詳細的分析,初步闡明其藥效的物質(zhì)基礎。

    本研究建立在前期對連花清瘟膠囊主要成分的定性及定量分析研究的基礎上,采用UPLC-Q-TOFMS技術(shù),通過對連花清瘟膠囊灌胃給藥大鼠后的血漿、空白血漿以及混合對照品溶液進行對比分析,根據(jù)色譜峰保留時間、質(zhì)譜裂解規(guī)律,結(jié)合文獻和對照品的有關(guān)信息,對連花清瘟膠囊主要入血成分進行分析,為揭示該中藥復方給藥后發(fā)揮抗病毒、抗炎的體內(nèi)藥效物質(zhì)提供了一定的實驗依據(jù)。

    1 儀器與藥材

    1.1 儀器與試劑 Waters ACQUITY UPLCTM system超高效液相色譜儀(美國Waters公司);Waters Synapt HDMS G1 Q-TOF質(zhì)譜儀(美國Waters公司);METTLER TOLEDO XP6十萬分之一天平(瑞士METTLER公司);氮吹儀(美國Organomation Associates Inc);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);低溫高速離心機(美國Thermo Forma公司);XW-80A渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);Milli-Q純水儀(Millipore,Milford,MA, USA)。甲醇(色譜純),購自美國Fisher Scientific公司;甲酸(色譜純),購自美國Fisher Scientific公司。

    1.2 材料 連花清瘟膠囊由石家莊以嶺藥業(yè)有限公司提供(批號121003)。沒食子酸(110831-201204)購自中國食品藥品檢定研究院;馬錢苷酸、大黃酚葡萄糖苷、斷氧馬錢子苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素購自美國Sigma公司,其批號分別為:060513、02S14、01Y14、092413、07X12;綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、甘草素、甘草酸購自天津中新藥業(yè)有限公司,其批號分別為:W00-5-3、W15-7-5、W14-2-9、W13-7-2、W13-0-3;新綠原酸、紅景天苷、連翹酯苷E、獐牙菜苷、芹糖甘草苷、金絲桃苷、苦杏仁苷、芹糖異甘草苷、大黃酸購自四川維克奇生物科技有限公司,其批號分別為:130317、130228、130511、130311、130502、130222、130127、130201、130315;異甘草苷(13071823)購自上海同田生物技術(shù)有限公司;芒柄花黃素(13050801)購自成都曼斯特生物科技有限公司。以上標準品的純度均≥98%。

    1.3 實驗動物 健康雄性大鼠,許可證號:SCXK-(軍)2012-0004,品系SD,級別SPF,體質(zhì)量(200±20)g,購自中國軍事科學院。

    2 實驗方法

    2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱;流動相:甲醇B-0.1%甲酸水溶液A,梯度洗脫:0~11 min,5%~35%B;11~18min,35%~55%B;18~22min,55%~75%B;22~24min,75%~90%B;24~25 min,90%~100%B;25~30 min,100%B;柱溫50℃,流速0.3 mL/min,進樣體積5 μL。

    2.2 質(zhì)譜條件 離子源:ESI;電離模式:負離子;毛細管電壓:2.6KV;錐孔電壓:45V;離子源溫度:100℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氮氣流速:600 L/h;一級掃描范圍:m/z 150~1 000 Da。

    2.3 對照品溶液和供試品溶液的制備

    2.3.1 對照品溶液的制備 取沒食子酸、馬錢苷酸、大黃酚葡萄糖苷、斷氧馬錢子苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素、綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、甘草素、甘草酸、新綠原酸、紅景天苷、連翹酯苷E、獐牙菜苷、芹糖甘草苷、金絲桃苷、苦杏仁苷、芹糖異甘草苷、大黃酸、異甘草苷和芒柄花黃素對照品適量,精密稱定,用甲醇溶解并定容得到濃度分別為1.0 g/L的對照品儲備液。吸取各對照品溶液適量,用30%的甲醇水溶液稀釋成各對照品濃度約為16.7 mg/L的混合對照品溶液,進樣5 μL分析。

    2.3.2 供試品溶液的制備 稱取連花清瘟膠囊適量,配制成濃度為0.2g/mL的混懸水溶液,供灌胃用。

    2.4 血漿樣品的采集 受試大鼠預適應一周,給藥前12 h禁食不禁水,按照給藥體積10 mL/kg(0.2 g/mL),臨床4倍用藥量)平行灌胃6只大鼠,于給藥前及給藥后 0、5、10、15、20、30、60、90、120、180、240和360 min從大鼠眼眶后靜脈叢取血約0.3~0.4 mL,置肝素抗凝管中,8 000 r/min離心10 min,分離血漿,于-80℃保存。

    2.5 血漿樣品的處理 精密吸取各時間點血漿100 μL,按1∶3(v/v)加入甲醇,渦旋3 min,沉淀蛋白,14 000 r/min離心10 min,吸取上清液,30℃氮氣流揮干液體,加入5%甲醇50 μL復溶,渦旋混勻后,14 000 r/min離心10 min,取各上清液40 μL渦旋混勻,即得混合血漿樣品,進樣5 μL分析。

    3 實驗結(jié)果與討論

    3.1 負離子檢測模式下樣品的總離子流圖 同時采集空白血漿、混合對照品溶液、各采血時間點混合血漿負離子模式下的總離子流色譜圖,見圖1。

    3.2 入血成分鑒定 由圖1可知大鼠血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾22種成分的測定,基線平穩(wěn),說明本實驗選用的甲醇沉淀蛋白,然后用流動相初始濃度復溶血漿樣品的樣品前處理方法科學合理。將空白血漿與各采血時間點混合血漿的數(shù)據(jù)進行對比處理,扣除空白血漿中的內(nèi)源性成分的干擾,結(jié)合色譜峰保留時間及質(zhì)譜碎裂規(guī)律,發(fā)現(xiàn)22個化學成分都能被吸收進入血液,其中16個成分峰型較好,碎片信息準確,包括紅景天苷(3)、連翹酯苷E(4)、馬錢苷酸(5)、苦杏仁苷(8)、獐牙菜苷(9)、斷氧馬錢子苷(10)、芹糖甘草苷(13)、芹糖異甘草苷(14)、異甘草苷(15)、甘草素(16)、大黃素-8-O-葡萄糖苷(17)、大黃酚葡萄糖苷(18)、芒柄花黃素(19)、大黃酸(20)、甘草酸(21)、大黃素(22),主要為黃酮、蒽醌、苯丙素和環(huán)烯醚萜類化學成分,此外亦有五環(huán)三萜和其他類成分,具體的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。

    圖1 空白血漿(a)、混合對照品溶液(b)、口服給藥蓮花清瘟膠囊后各采血時間點混合血漿(c)的UPLC-Q-TOF-MS負離子模式下的色譜圖Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS chromatograms of blank plasma(a),the mixed references solution(b),and the mixed plasma after oral administration of Lianhua-Qingwen(c)in negative ion mode

    4 討論

    4.1 血液樣品的選擇 在血液采集的過程中,凝血時激活或釋放的酶可能會降解以及吸附中藥的有效成分,研究指出血漿比血清更接近體內(nèi)的實際情況,多個入血成分鑒定的實驗結(jié)果也證實了這一結(jié)論[24],所以本實驗鑒定入血成分時采用血漿。

    本實驗采用各采血時間點混合后測樣,而非單一采血時間點分別測樣。本實驗的目的是研究連花清瘟膠囊入血的總成分,由于不同物質(zhì)在體內(nèi)代謝過程不同,各種化合物的達峰時間和半衰期不同,單時間點采血測樣,連花清瘟膠囊中化合物濃度小,數(shù)量少,時間點不易選取,將各采血時間點的樣品混合后測樣,有利于測到盡可能多的入血成分。

    4.2 入血成分鑒定結(jié)果 血漿成分分析存在著含量低、組分多、分離難,生物個體差異大的特點,質(zhì)譜法測定入血成分快速、微量、精確。本實驗結(jié)果顯示連花清瘟22個主要化學成分均能被吸收進入血液,16個成分質(zhì)譜峰峰型較好,其中沒食子酸(1)、新綠原酸(2)、綠原酸(6)、隱綠原酸(7)、蘆丁(11)、金絲桃苷(12)等6個化合物峰較小,分子離子峰相對較低。原因可能是連花清瘟膠囊中6種成分含量較低,并且該保留時間范圍內(nèi)干擾峰較多。本實驗血漿樣品中,均檢測到22種原型入血成分,但由于血漿中化合物濃度較低,混合時間點取樣以及對代謝產(chǎn)物的研究有限,未確定是否有新的代謝產(chǎn)物出現(xiàn)。

    表1 連花清瘟膠囊入血成分的鑒定Tab.1 Identification of absorbed components in rat plasma after oral administration of Lianhua Qingwen capsules

    5 小結(jié)

    連花清瘟膠囊為治療病毒性感冒常用中成藥,本研究采用UPLC-Q-TOF-MS方法鑒定了連花清瘟膠囊的22種入血的原型成分,推測其可能為連花清瘟發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎。為進一步探究其作用機制,擬進一步對22種入血成分進行抗炎、抗病毒的體外活性測試,期望篩選出具有抗炎、抗病毒的活性單體。

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    Analysis of absorbed components in rat plasma after oral administration of Lianhua Qingwen capsules by UPLC-Q-TOF-MS

    YU Hua1,2,JIA Wei-na1,2,LIU Jin-ping1,2,ZHU Yan1,2,WANG Chun-hua1,2
    (1.Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine,Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine,Tianjin 300457,China)

    [Objective]A UPLC-Q-TOF-MS method was developed for the analysis of absorbed components in SD rat plasma after oral administration of Lianhua Qingwen capsules(LQC)for the first time.[Methods]The blood samples were taken from the posterior orbital venous plexus of rats and methanol was used for the protein precipitation.The separation of components was achieved on a C18column by gradient elution with methanol-0.1%formic acid water solution as mobile phase.Comparative analysis of blank plasma,mixed reference standards and plasma with LQC was performed by UPLC-Q-TOF-MS in negative ion mode.[Results]The results suggested that 22 prototype compounds were identified,including flavonoid,anthraquinone,phenylpropanoid and iridoid.These compounds were identified and confirmed by comparing their retention times,mass spectrometry fragmentation characteristics with that of references as well as literatures.[Conclusion]The study of the absorbed components of LQC in plasma provides an experimental basis for revealing the effective components and its pharmacokinetics study.

    Lianhua Qingwen capsule;absorbed components in plasma;UPLC-Q-TOF-MS

    R965

    A

    1672-1519(2016)12-0756-04

    2016-07-01)

    (本文編輯:高 杉,馬 英)

    10.11656/j.issn.1672-1519.2016.12.13

    國家自然科學基金青年項目(81403059,81573826)。作者簡介:于 華(1990-),女,碩士研究生,主要從事中藥化學物質(zhì)基礎研究。

    王春華,E-mail:pharmwch@126.com。

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