不同硫酸蒽酮比色定糖法的比較

摘 要：為選定適合的實(shí)驗(yàn)室測糖方法，分別采用濃硫酸外加熱法、稀硫酸外加熱法及水合熱法等設(shè)置的不同加熱時間對蔗糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測試，并對其易操作性、數(shù)據(jù)穩(wěn)定性等方面進(jìn)行綜合比較。結(jié)果表明，稀硫酸外加熱法由于具有測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好、易于操作、藥品用量少、吸光度值范圍適宜、顯色反應(yīng)完全等優(yōu)點(diǎn)，被確定為最合適的實(shí)驗(yàn)方法。

關(guān)鍵詞：硫酸蒽酮法；比色定糖；實(shí)驗(yàn)方法

中圖分類號：TG115.3+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.002

硫酸蒽酮比色法是植物營養(yǎng)和生理代謝中最常用的測糖方法[1-6]，其原理是糖類（包括多糖）在硫酸的作用下，脫水生成糠醛或羥甲基糠醛，然后蒽酮與糠醛或羥甲基糠醛經(jīng)脫水縮合產(chǎn)生藍(lán)綠色的糠醛衍生物，在620 nm處有最大吸收。顏色深淺可作為定量的標(biāo)準(zhǔn)。該法由于所需試劑簡單，操作方便，并具有較高的靈敏度，適于微量測定，已得到普遍應(yīng)用。

在很多文獻(xiàn)資料中，都有關(guān)于蒽酮比色法的介紹。但是不同作者所介紹的方法中，蒽酮試劑的用量、硫酸的濃度以及不同試劑與糖顯色所需的時間等差異很大。總的來講，可以概括為兩大類，即外加熱法和水合熱法[7]，外加熱法又分為稀硫酸外加熱法[8]和濃硫酸外加熱法[9]。

本試驗(yàn)通過對3種常見的蒽酮比色定糖法進(jìn)行比較，旨在找到最適合本化驗(yàn)室應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

標(biāo)準(zhǔn)樣品：濃度分別為0，10，20，30，40，50，60 g·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)驗(yàn)儀器：萬分之一天平，日本島津紫外分光光度計(jì)，離心機(jī)（4 000 r·min-1），三用恒溫水浴鍋。

實(shí)驗(yàn)試劑：分析純硫酸，分析純蒽酮。

1.2 方 法

方法1 濃硫酸外加熱法：蒽酮試劑以濃硫酸加蒽酮配制，在冰水浴中加入濃硫酸，反應(yīng)體系中水和硫酸的比例為1∶2.1，沸水浴中加熱進(jìn)行顯色反應(yīng)。

方法2 稀硫酸外加熱法：蒽酮試劑以稀硫酸加蒽酮配制，在冰水浴中加入濃硫酸，本體系中水和硫酸的比例為1∶1.73。沸水浴中加熱進(jìn)行顯色反應(yīng)。

方法3 水合熱法：蒽酮試劑用濃硫酸加蒽酮配制，在正常室溫下加入濃硫酸，本反應(yīng)體系中水和硫酸的比例為1∶2.6。顯色反應(yīng)利用蒽酮試劑中濃硫酸遇水放出的熱。

以上3種方法均以0 μg的糖與蒽酮試劑的室溫顯色液作為零基準(zhǔn)。每個試驗(yàn)方法重復(fù)3次，取3次重復(fù)的平均值進(jìn)行分析。具體試劑配比見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃硫酸外加熱法

在濃硫酸蒽酮試劑的反應(yīng)體系中，水和濃硫酸的比值是1∶2.11，濃硫酸比例較大，因而水反應(yīng)較易進(jìn)行。雖然冰水浴溫度低，但試劑仍可進(jìn)行顯色反應(yīng)。在冰水浴中搖勻試管時，試劑溶液明顯變綠，表明反應(yīng)已經(jīng)開始。每個樣品加入硫酸蒽酮試劑的操作耗時約0.5 min。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中幾個樣品作為同一個批次加熱時，操作必須嚴(yán)格按規(guī)程進(jìn)行，在所有樣品都加入試劑后再同時搖勻，以減少加樣時間差異給顯色反應(yīng)帶來的誤差。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理后可以看出（圖1），加熱時間在3～5 min時，脫水顯色反應(yīng)尚未進(jìn)行完全，消光值較小。當(dāng)加熱時間持續(xù)到8～10 min時，顯色已完成，此時消光值最大。當(dāng)加熱時間延長到13 min時，消光值又變小了。實(shí)驗(yàn)中也觀察到隨著加熱時間的延長，反應(yīng)試液的顏色由8 min時的藍(lán)綠色變?yōu)?5 min時的灰綠色。這可能是由于過長的加熱時間引起了糠醛衍生物的破壞，所以顏色逐漸消退[7]。

對不同加熱時間下不同濃度的糖溶液的吸光度值進(jìn)行相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，5～8 min的加熱時間具有較高的相關(guān)系數(shù)（表2），這說明在5～8 min時反應(yīng)物比較穩(wěn)定，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性好，但5 min時吸光度值較低，說明反應(yīng)不完全，因此認(rèn)為，對于濃硫酸加熱法而言，以8 min的加熱時間為最好，而林炎坤[7]、雷剛[10]等則認(rèn)為3 min的加熱時間吸光度值較高。

2.2 稀硫酸外加熱法

在試驗(yàn)中我們看到，當(dāng)稀硫酸蒽酮試劑加入到試管中時，試管中與試劑接觸的糖溶液的顏色沒有發(fā)生顯色反應(yīng)，搖勻后溶液的顏色仍為硫酸蒽酮試劑的顏色。這是因?yàn)橄×蛩彷焱噭┑姆磻?yīng)體系中，濃硫酸比例小，水和濃硫酸的比例是1∶1.73，在不加熱的情況下，不會發(fā)生脫水反應(yīng)。因此在加樣過程中的時間差異，不會對顯色反應(yīng)產(chǎn)生影響，使試驗(yàn)操作易于控制，減少了誤差的產(chǎn)生。

從圖2可以看出，顯色時間在8 min時，吸光度值仍較低，等到10 min時，消光值最高，11 min以后，消光值又開始下降。以上數(shù)據(jù)表明，稀硫酸外加熱法加熱10 min時，顯色反應(yīng)完全。

從表3可以看出，8～10 min的加熱時間具有較高的相關(guān)系數(shù)，這說明在8～10 min時反應(yīng)物比較穩(wěn)定，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性好。但8 min時吸光度值稍低，顯色反應(yīng)不完全，因此認(rèn)為對于稀硫酸加熱法而言，以10 min的加熱時間為最好。

2.3 硫酸水合熱法

在水合熱法中我們看到，當(dāng)硫酸蒽酮試劑加入到試管中時，室溫下即使不搖勻，試管內(nèi)溶液也會立即發(fā)生顯色反應(yīng)。這是由于在水合熱的反應(yīng)體系中，濃硫酸比例大，水和濃硫酸的比例是1∶2.5，因此在不加熱的情況下，硫酸就會與水發(fā)生水合作用放出熱能，使反應(yīng)系統(tǒng)自行升溫達(dá)到充分顯色。與前面兩種實(shí)驗(yàn)方法比較起來，水合熱法雖然操作相對方便些（不需加熱），但對操作技術(shù)要求高，稍有疏忽，極易造成誤差，測定結(jié)果準(zhǔn)確性差、不穩(wěn)定，易受室溫變化的影響[10]。

從圖3可以看出，水合熱法不同濃度糖溶液的吸光度值與反應(yīng)時間之間的規(guī)律性不明顯，含糖量100 μg的糖溶液，反應(yīng)在進(jìn)行到15 min時吸光度值最大，而75 μg的糖溶液則13 min時吸光度值最低，但從整體上看以15 min時吸光度值最大。

從表4可以看出，在水合熱法中，不同反應(yīng)時間下標(biāo)準(zhǔn)樣品中糖含量與吸光度值之間的相關(guān)系數(shù)比較低，這可能與加樣時間的控制及水合放熱反應(yīng)不完全有關(guān)。

3 討 論

根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以從以下幾個方面來比較3種實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)劣。

3.1 操作條件易于控制

稀硫酸與糖溶液樣品混合后，在冰水浴中沒有水合現(xiàn)象，混合后不放熱，試劑不反應(yīng)，直到放入沸水浴后，才開始顯色，這樣在反應(yīng)時間上每個試樣就比較統(tǒng)一，實(shí)驗(yàn)條件易于控制，加樣時間的先后，不會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。而另兩種實(shí)驗(yàn)方法由于濃硫酸比例大，試劑與糖溶液混合后水合反應(yīng)劇烈，立即發(fā)生顯色反應(yīng)，試劑加入的先后順序影響到計(jì)時，使蒽酮試劑與糖樣的顯色時間難于掌握，因而直接影響到測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好

從測定的數(shù)據(jù)中可以看出，稀硫酸加熱法的最大吸光度值穩(wěn)定在10 min的加熱時間上，重現(xiàn)性好。從對數(shù)據(jù)進(jìn)行的相關(guān)分析上也可以看出，不同加熱時間下，不同濃度糖溶液與吸光度值之間的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999以上。而其他兩種試劑的最大吸光度值不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，相關(guān)系數(shù)偏低。這也說明了稀硫酸加熱法10 min時測定的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性最好。

3.3 藥品用量經(jīng)濟(jì)

3種試驗(yàn)方法中，水與濃硫酸的比例分別為1∶2.11、1∶1.73和1∶2.6。每配制100 mL硫酸蒽酮試劑，硫酸用量分別為95，76，100 mL。因此，配制同樣體積的試劑，稀硫酸外加熱法硫酸消耗量最少，從試驗(yàn)成本上來講最經(jīng)濟(jì)。

3.4 樣品體積方便比色

3種試驗(yàn)方法中，顯色后溶液的體積都不大，分別為7，6，9 mL。因此，每次潤洗比色杯時都要小心進(jìn)行，既要充分潤洗，又要保證有充足的樣品體積進(jìn)行比色。相對而言，稀硫酸法體積量最小，比色時對操作技術(shù)要求最高。

3.5 顯色反應(yīng)進(jìn)行完全

從測定的數(shù)據(jù)可以看出，外加熱法顯色反應(yīng)的吸光度值要普遍高于水合熱法。這說明水合熱法水合放熱的能量有限，顯色反應(yīng)不夠完全。

按上述條件綜合比較后認(rèn)為，稀硫酸外加熱法雖然樣品體積量小，比色時要控制樣品用量，但由于具有測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好、易于操作、藥品用量少、吸光度值范圍適宜、顯色反應(yīng)完全的優(yōu)點(diǎn)，仍然是最適合本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的測糖方法[11]。

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