2,4-二氯苯氧乙酸與鹽脅迫聯(lián)合提高小球藻的產(chǎn)脂量

王依霖,莫?jiǎng)?chuàng)榮*,許雪棠,黃麗珍,譚順,陸祖逸,王露潔,龐瑞林

1(廣西大學(xué) 資源環(huán)境與材料學(xué)院，廣西 南寧，530004)2(廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧，530004)

能源一直是人類社會(huì)高速發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力，隨著化石能源的逐漸枯竭，尋求獲取新能源的途徑是當(dāng)下迫切需要解決的問(wèn)題。微藻作為第三代新生物質(zhì)能源，基于其環(huán)保、可再生等特性，受到了廣泛的關(guān)注。然而，要想實(shí)現(xiàn)微藻中生物柴油的大規(guī)模生產(chǎn)，首先要解決的是其養(yǎng)殖、收獲和提取步驟中的低產(chǎn)量和高成本限制的問(wèn)題[1]?；谶@個(gè)出發(fā)點(diǎn)考慮，微藻的生物量和油脂生產(chǎn)率的優(yōu)化將是藻類生物燃料生產(chǎn)中的研究重點(diǎn)[2]。微藻的生物質(zhì)積累常發(fā)生在脅迫環(huán)境下，常見(jiàn)的例如高光照、營(yíng)養(yǎng)限制、pH脅迫、高溫、高鹽度、重金屬等[3]。在這些脅迫環(huán)境中，鹽脅迫已被證明是刺激各種微藻油脂積累的較為有效的途徑[4]。然而，逆境脅迫又可能會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)代謝，并且代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生會(huì)降低微藻的整體生長(zhǎng)力，增加生物燃料生產(chǎn)的成本[5]。

有研究表明，在非生物脅迫的條件下，植物激素能夠在一定程度上促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，并且能夠在脅迫環(huán)境中進(jìn)一步促進(jìn)藻體內(nèi)油脂的積累，提高微藻對(duì)逆境的耐受能力[6]。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)于促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，提高微藻的油脂、葉綠素及蛋白質(zhì)含量等方面作用顯著，在郝宗娣等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)2,4-D為調(diào)控小球藻生長(zhǎng)及油脂貯存的最理想添加物。同時(shí)，2,4-D還可通過(guò)提高微藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，保護(hù)微藻細(xì)胞免受過(guò)氧化的損害[8]。由此說(shuō)明，植物激素可能會(huì)提高微藻在非生物脅迫下氧化應(yīng)激能力，調(diào)節(jié)它的生物量和其他高價(jià)值代謝物的生產(chǎn)[9]。但是，目前利用植物激素與非生物脅迫的組合來(lái)共同促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)與油脂合成的研究很少[10]。本研究以原始小球藻為研究對(duì)象，首先優(yōu)化了在一系列NaCl濃度下小球藻的油脂含量，并在優(yōu)化后的NaCl處理下應(yīng)用了一定濃度范圍的2,4-D以獲得更高的油脂生產(chǎn)力。隨后研究了2,4-D聯(lián)合NaCl處理對(duì)小球藻其他生化成分以及脂肪酸成分的影響。通過(guò)利用植物激素聯(lián)合鹽脅迫的方法來(lái)提高小球藻的生物量及油脂含量，為工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)微藻提出了一個(gè)有效的新策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 微藻及培養(yǎng)

本試驗(yàn)所用藻種(普通小球藻FACHB-8)由中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)提供，所用的培養(yǎng)基為培養(yǎng)微藻常用到的BG11，在120 ℃高溫滅菌后使用。在溫度為(25±1) ℃、光照強(qiáng)度為5 000 lx、光暗比為16∶8的培養(yǎng)條件下連續(xù)培養(yǎng)6 d，通過(guò)曝氣使小球藻均勻分布在培養(yǎng)基中。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.1.2 藥品與試劑

試驗(yàn)所用試劑均為分析純級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UV-1800PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器、YXQ-LS-50S立式蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TG-16臺(tái)式高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；LGJ-10N真空冷凍干燥機(jī)，北京亞星儀科科技有限公司；Trace1310 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜分析儀，ThermoFisher Scientific。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 影響因素試驗(yàn)

1.2.1.1 鹽濃度對(duì)微藻生物量及油脂含量的影響

將不同含量的NaCl(0、5、10、20 g/L)分別加入到BG11培養(yǎng)基中，每1個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃、光照強(qiáng)度為5 000 lx、光暗比為16∶8，連續(xù)培養(yǎng)6 d。

1.2.1.2 2,4-D對(duì)微藻生物量以及油脂含量的影響

將不同含量的2,4-D(0、0.1、0.5、1、2 mg/L)分別加入到含有一定NaCl的BG-11培養(yǎng)基中，與1.2.1.1相同的培養(yǎng)條件，定期測(cè)小球藻的生物量及油脂含量。

1.2.2 生物量及油脂含量的測(cè)定

生物量的測(cè)定：小球藻的生物量測(cè)定采用干重法，首先用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在680 nm處測(cè)定不同稀釋倍數(shù)下小球藻的吸光度(OD680)值，再測(cè)定藻液的干重并繪制藻生物量-OD680值標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]，R2=0.998 7，如公式(1)所示：

生物量/(g·L-1)=0.391 5×OD680-0.004 6

(1)

微藻油脂的測(cè)定：采用氯仿-甲醇法測(cè)定小球藻中的油脂含量[12]。將小球藻冷凍干燥后精確稱取50 mg藻體粉末與5 mLV(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1混合，在室溫的條件下超聲破碎30 min，然后在150 r/min下振蕩3 h，萃取充分后溶劑相通過(guò)離心機(jī)7 000 r/min離心10 min獲得，同樣的過(guò)程重復(fù)1遍后將收集到的溶劑相于干燥稱量好的稱量杯中(m1)，將裝有溶劑相的稱量杯(m2)放入80 ℃的烘箱中烘干至恒重并計(jì)算其油脂含量，油脂含量的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.2.3 葉綠素a、類胡蘿卜素含量的測(cè)定

取1.5 mL小球藻藻液于2 mL離心管中，13 400 r/min離心5 min，去上清液后加入1.5 mL甲醇，振蕩使藻渣分離完全，于45 ℃水浴避光熱提30 min，13 400 r/min離心5 min得上清液，稀釋后用分光光度計(jì)在480、652、665、750 nm下測(cè)其吸光度。其中A480、A652、A665需用A750校正，即減去A750的值，相關(guān)計(jì)算公式(3)、公式(4)所示：

葉綠素a/(mg·L-1)=

(3)

(4)

式中：n，稀釋倍數(shù)；V，所取小球藻藻液體積。

1.2.4 碳水化合物含量的測(cè)定

在20 mL試管中加入稀釋后的小球藻藻液2 mL、蒽酮乙酸乙酯溶液0.5 mL和濃硫酸(相對(duì)密度1.84)5 mL，充分振蕩，搖勻，立即置沸水浴中準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1 min，取出冷卻至室溫后，在625 nm處檢測(cè)其吸光度，根據(jù)國(guó)標(biāo)蒽酮-乙酸乙酯法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得小球藻碳水化合物含量[11]。

1.2.5 可溶性蛋白含量的測(cè)定

精密稱取3個(gè)20 mg藻粉于10 mL離心管中，分別加入3 mL PBS溶液，經(jīng)超聲波破碎(功率為240 W，40%)，破碎時(shí)間為2 min，破碎后，將其倒入50 mL離心管，并用17 mL PBS沖洗多次至無(wú)殘留，10 000 r/min離心10 min后，取離心后的藻液備用，并按照考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定小球藻細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白含量[13]。

1.2.6 脂肪酸成分及含量的測(cè)定

向所提取的油脂中加入2 mL 3%(體積分?jǐn)?shù))的硫酸/甲醇溶液，在70 ℃的水浴中回流3 h進(jìn)行脂肪酸甲酯化，加入2 mL正己烷，振蕩提取4 h，吸取正己烷相進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GS-MS)分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用Origin繪圖，SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)小球藻生物量及油脂含量的影響

由圖1-a可知，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在前4 d的生物量沒(méi)有明顯差異，從第4天開(kāi)始出現(xiàn)較顯著的差異。對(duì)照組的小球藻在接種第4天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而實(shí)驗(yàn)組隨著NaCl的加入抑制了小球藻的生長(zhǎng)，并隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度升高，微藻的生長(zhǎng)越趨緩慢。與對(duì)照組相比，在添加5、10、20 g/L NaCl的實(shí)驗(yàn)組中，小球藻生物量分別下降了17.72%、30.70%、40.74%。然而，油脂含量的積累情況與生物量的趨勢(shì)相反。如圖1-b所示，在一定濃度NaCl的脅迫下，隨著NaCl濃度的升高，油脂含量也逐漸增加，添加10 g/L NaCl的實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)至第6天時(shí)油脂含量達(dá)到峰值，約為(24.35±2.50)%，比對(duì)照組顯著高了35%，而此時(shí)小球藻的生物量?jī)H為對(duì)照組的59.55%。這種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可能歸因于NaCl處理過(guò)程中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)積累，ROS通過(guò)上調(diào)與油脂生物合成的相關(guān)基因來(lái)促進(jìn)油脂的積累[14]。但過(guò)量的ROS會(huì)破壞細(xì)胞中的大分子物質(zhì)，同時(shí)鹽脅迫帶來(lái)的高滲透失水效應(yīng)也會(huì)對(duì)小球藻細(xì)胞造成損傷，降低小球藻對(duì)光能的吸收與轉(zhuǎn)化，從而抑制微藻的生長(zhǎng)[15]。當(dāng)鹽濃度過(guò)高時(shí)，油脂含量的增長(zhǎng)出現(xiàn)抑制(如圖1-b，第6天)可能是由于在長(zhǎng)時(shí)間的高鹽脅迫環(huán)境下，微藻細(xì)胞的呼吸作用加強(qiáng)從而導(dǎo)致儲(chǔ)存能量的化合物(如淀粉和脂質(zhì)等)降解[16]。

綜上，NaCl的添加可以增加小球藻的油脂含量，但由于其對(duì)生物量的抑制，導(dǎo)致小球藻的油脂生產(chǎn)力隨著NaCl濃度升高由(147.74±0.57) mg/(L·d)下降至(87.56±0.38) mg/(L·d)(表1)。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，小球藻的油脂生產(chǎn)力僅約為對(duì)照組的70%。綜合考慮下，本實(shí)驗(yàn)選擇10 g/LNaCl的實(shí)驗(yàn)組后續(xù)添加2,4-D，以期降低NaCl對(duì)小球藻生長(zhǎng)的抑制作用，能夠在提高油脂含量的同時(shí)增加小球藻的生物量。

a-生物量；b-油脂含量圖1 不同濃度NaCl對(duì)小球藻的生物量與油脂含量的影響Fig.1 The biomass and oil content of Chlorella vulgaris under the condition of adding different concentrations of NaCl注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

表1 NaCl處理下小球藻的生物量、生物生產(chǎn)力、油脂產(chǎn)量與油脂生產(chǎn)力Table 1 The biomass, biomass productivity, oil production and oil production of Chlorella vulgaris under NaCl treatment

2.2 2,4-D與NaCl聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)小球藻生物量及油脂含量的影響

如圖2-a所示，2,4-D的添加顯著增加了小球藻的生物量，在第6天時(shí)，添加了0.1、0.5、1、2 mg/L的2,4-D聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組與單獨(dú)2,4-D實(shí)驗(yàn)組的生物量比單獨(dú)鹽脅迫組分別提高了45.60%、55.45%、55.00%、53.70%與57.93%。此外，2,4-D的添加也增加了小球藻的油脂含量，從圖2-b中可以看到隨著所添加的2,4-D濃度的增大，小球藻的油脂含量也不斷提高。添加2 mg/L 2,4-D的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組在第4天時(shí)油脂含量達(dá)到了(26.90±0.50)%，分別比單獨(dú)鹽脅迫組(24.35±2.50)%與對(duì)照組(19.20±1.21)%獲得的最高油脂含量顯著高出10.47%與40.10%，其油脂生產(chǎn)力也達(dá)到了(41.32±0.59) mg/(L·d)，是單鹽脅迫時(shí)的1.66倍(表2)。試驗(yàn)說(shuō)明了2,4-D與NaCl的組合不但可以提高小球藻的生物量，提高它對(duì)鹽的耐受能力，其對(duì)油脂的積累也優(yōu)于單鹽脅迫下的小球藻。

2.3 2,4-D與NaCl聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)小球藻生化指標(biāo)的影響

在2,4-D與NaCl的聯(lián)合培養(yǎng)下，還測(cè)定了小球藻的葉綠素a、類胡蘿卜素、碳水化合物和可溶性蛋白的含量。當(dāng)微藻處于脅迫環(huán)境下，細(xì)胞的氧化應(yīng)激能力會(huì)發(fā)生改變，以應(yīng)對(duì)不適環(huán)境下產(chǎn)生的大量ROS。此前已經(jīng)有研究表示色素對(duì)于各種脅迫條件下微藻細(xì)胞的抗氧化能力有著至關(guān)重要的作用，因此可以通過(guò)定量測(cè)定色素中的葉綠素a含量與類胡蘿卜素含量來(lái)評(píng)估2,4-D和NaCl聯(lián)合培養(yǎng)的小球藻對(duì)其脂質(zhì)積累的潛在影響。如圖3-a所示，小球藻的葉綠素a含量隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)均上升，而對(duì)照組與添加了2,4-D的小球藻中葉綠素a含量的上升速度顯著高于只添加NaCl的小球藻，這與上述實(shí)驗(yàn)中的生物量變化(圖2-b)趨勢(shì)相似。2,4-D與NaCl聯(lián)合培養(yǎng)下的小球藻中葉綠素a含量在第6天達(dá)到(12.19±0.08) mg/L，僅次于單獨(dú)2,4-D實(shí)驗(yàn)組中的葉綠素a含量，比單鹽脅迫時(shí)高18%。之前有研究表示，在高鹽脅迫的過(guò)程中葉綠素a的降低與脂質(zhì)的合成增強(qiáng)有關(guān)，這是由于光合作用中的碳源被用于生成脂質(zhì)、碳水化合物和蛋白質(zhì)等生物大分子，從而使小球藻從快速生長(zhǎng)階段過(guò)渡到了生物質(zhì)合成階段[17]。由此說(shuō)明，2,4-D的添加能夠改變小球藻細(xì)胞中碳源的轉(zhuǎn)化，提高葉綠素a含量，增強(qiáng)其光合作用效率從而提高了小球藻的生物量。圖3-b中的類胡蘿卜素含量在不同培養(yǎng)條件下的變化與葉綠素a的變化類似，2,4-D與NaCl聯(lián)合培養(yǎng)下比單鹽脅迫時(shí)高17.77%。類胡蘿卜素是一種天然抗氧化劑，因此2,4-D的添加對(duì)小球藻在鹽脅迫下清除過(guò)量的ROS也有著重要意義。

a-生物量；b-油脂含量圖2 不同濃度2,4-D對(duì)小球藻的生物量與油脂含量的影響Fig.2 The biomass and lipid content of Chlorella vulgaris under the condition of adding different concentrations of 2,4-D

表2 2,4-D與NaCl聯(lián)合處理下小球藻的生物量、生物生產(chǎn)力、油脂產(chǎn)量與油脂生產(chǎn)力Table 2 The biomass, biomass productivity, oil production and oil production of Chlorella vulgaris under the combined treatment of 2,4-D and NaCl

圖3-c為在不同培養(yǎng)條件下碳水化合物含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。如圖所示，單獨(dú)2,4-D實(shí)驗(yàn)組的小球藻細(xì)胞中的碳水化合物在第2天迅速下降至(13.28±0.02)%，隨后緩慢上升。這可能是因?yàn)樵?,4-D的刺激下，培養(yǎng)初期細(xì)胞的快速生長(zhǎng)活動(dòng)會(huì)消耗大量的葡萄糖、淀粉等初級(jí)能源物質(zhì)，因此造成了碳水化合物的減少。隨著2,4-D的消耗，微藻生長(zhǎng)變慢，碳水化合物開(kāi)始積累[18]。單獨(dú)NaCl實(shí)驗(yàn)組和2,4-D與NaCl聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組的小球藻細(xì)胞中的碳水化合物含量下降速度顯著小于單獨(dú)2,4-D實(shí)驗(yàn)組，并分別在第6天與第4天達(dá)到最低，而它們?cè)谶@一天均獲得了各自培養(yǎng)條件下的最高油脂含量[分別為(24.35±2.50)%和(26.90±0.50)%]。HO等[19]也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下微藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的含量會(huì)減少，并且減少的碳水化合物以碳源及能量的形式轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)中。因此，鹽脅迫下的碳水化合物含量的降低與油脂積累有著密切的關(guān)聯(lián)。圖3-d為培養(yǎng)過(guò)程中小球藻細(xì)胞中可溶性蛋白含量的趨勢(shì)圖，單獨(dú)添加2,4-D的實(shí)驗(yàn)組中可溶性蛋白含量由(6.82±0.04)%逐漸增加到(9.40±0.09)%，2,4-D與NaCl聯(lián)合實(shí)驗(yàn)組中可溶性蛋白含量也達(dá)到(9.32±0.22)%，它們分別比單鹽脅迫實(shí)驗(yàn)組中的可溶性蛋白含量高29.66%與28.55%，2,4-D的添加顯著增加了小球藻在鹽脅迫中的可溶性蛋白的合成。

2.4 2,4-D與NaCl聯(lián)合培養(yǎng)對(duì)小球藻脂肪酸組成的影響

微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的構(gòu)成是判斷其是否可以作為生物柴油原料的重要指標(biāo)。表3所示為通過(guò)幾種不同的方式培養(yǎng)后的小球藻細(xì)胞中的脂肪酸組成，所有實(shí)驗(yàn)組的脂肪酸均分布約16～18個(gè)碳原子，適合生物柴油的生產(chǎn)。與對(duì)照組相比，2,4-D與NaCl聯(lián)合處理的實(shí)驗(yàn)組中，飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)含量達(dá)到最高，為37.79%，比對(duì)照組高出15.50%。單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)也比對(duì)照組提高了22.12%，而它的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)顯著下降，從而使得不飽和度(degree of unsaturation，DU)下降至102.79，比對(duì)照組低了約12%。微藻的油脂作為生物柴油，較低的PUFA會(huì)使其生產(chǎn)的柴油品質(zhì)更好，較低的DU也會(huì)使小球藻的氧化穩(wěn)定性有顯著的提高[20]。因此，2,4-D聯(lián)合NaCl處理后的小球藻可以獲得更具有市場(chǎng)價(jià)值的生物柴油。

a-葉綠素a含量；b-類胡蘿卜素含量；c-碳水化合物含量；d-可溶性蛋白含量圖3 不同處理?xiàng)l件對(duì)小球藻的葉綠素a、類胡蘿卜素、碳水化合物和可溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effects of different treatment conditions on chlorophyll a content, carotene content, carbohydrate content and soluble protein content of Chlorella vulgaris

表3 不同條件下小球藻的脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of Chlorella vulgaris under different conditions

3 結(jié)論

本研究在鹽脅迫的條件下添加植物激素2,4-D，探究這種培養(yǎng)條件對(duì)小球藻的生物量及油脂積累的影響。研究結(jié)果表明，小球藻在2 mg/L 2,4-D 與10 g/L NaCl 聯(lián)合培養(yǎng)的條件下能夠獲得最高油脂生產(chǎn)力。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了2,4-D的添加不僅提高了小球藻的總脂含量還進(jìn)一步改善了其脂肪酸的構(gòu)成，提高了微藻作為生物柴油的品質(zhì)，對(duì)實(shí)際中生產(chǎn)微藻生物柴油具有一定的指導(dǎo)意義。另外，根據(jù)分析結(jié)果推測(cè)小球藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素a、類胡蘿卜素、碳水化合物等生理生化指標(biāo)的變化與油脂的積累可能存在潛在關(guān)系，而對(duì)于這種潛在關(guān)系以及油脂積累的原因還需以后從分子水平進(jìn)一步分析。