外周血游離DNA作為腫瘤標(biāo)志物的臨床展望和生物學(xué)意義*

瞿國英 綜述，郁愛平 審校

(上海濰坊社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，上海 200122)

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外周血游離DNA作為腫瘤標(biāo)志物的臨床展望和生物學(xué)意義*

瞿國英 綜述，郁愛平△審校

(上海濰坊社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心檢驗(yàn)科，上海 200122)

關(guān)鍵詞:CFDNA;腫瘤標(biāo)志物;基因改變

早在1977年，即有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在癌癥患者血漿和血清中循環(huán)游離DNA(CFDNA)異常增高[1]。然而直到近期，人們才意識(shí)到癌癥患者外周血CFDNA可以作為癌癥早期診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，并加以研究。至今，已發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤患者中，包括結(jié)直腸癌、胰腺癌、肺癌等，CFDNA出現(xiàn)特征性基因改變，包括點(diǎn)突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定、DNA超甲基化、雜合子缺失等[2-5]。多項(xiàng)研究表明，CFDNA的變化與腫瘤原發(fā)部位基因改變完全相同。雖然，CFDNA的基因改變與數(shù)量上升不能鑒別特定腫瘤，但是處于腫瘤晚期且發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者往往伴有CFDNA的顯著升高。因此，利用CFDNA傳遞的遺傳信息，對腫瘤患者進(jìn)行早期分子診斷和預(yù)后評估，具有潛在臨床價(jià)值。

1CFDNA的特征與起源

CFDNA在健康人外周血濃度平均值為30 ng/mL。推定每個(gè)細(xì)胞DNA水平為6.6 pg，則1 mL血中平均含有5 000個(gè)DNA基因組。在系統(tǒng)紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎、肝炎、癌癥患者外周血中，CFDNA常表現(xiàn)為高水平。癌癥患者外周血CFDNA平均值為180 ng/mL[4-6]。CFDNA為雙鏈，常與蛋白結(jié)合成為核蛋白復(fù)合物，但是目前復(fù)合物的具體成分還不清楚[7]。對CFDNA實(shí)行低百分率瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示0.18～21.00 kbp的DNA片段在標(biāo)本間差異最大。CFDNA在血液中清除速率極快，它對DNAse.1等血漿核酸酶極為敏感。但是肝臟和腎對CFDNA的生理清除作用還未徹底闡明。胎兒分娩后，對母體中胎兒CFDNA的清除研究表明，CFDNA的半衰期為16.3 min[8]。如果腫瘤患者CFDNA的半衰期類似母體中胎兒CFDNA的清除率，那么每小時(shí)必須有數(shù)百萬個(gè)DNA基因組釋放入血才能維持血中CFDNA濃度達(dá)到180 ng/mL。這個(gè)數(shù)目看似巨大，但與同時(shí)機(jī)體內(nèi)新陳代謝更新的細(xì)胞相比，只占很小一部分。

CFDNA的腫瘤起源說的產(chǎn)生是因?yàn)樵谀[瘤患者的腫瘤位點(diǎn)和CFDNA發(fā)現(xiàn)了原癌基因和抑癌基因發(fā)生相同突變。與此結(jié)果相符的是，腫瘤患者CFDNA的生物物理特性與腫瘤細(xì)胞極為相似。腫瘤患者的CFDNA經(jīng)體外致癌物處理后，相比正常DNA雙鏈穩(wěn)定性下降，健康志愿者的CFDNA同樣處理后卻與正常DNA一樣保持雙鏈穩(wěn)定。

源自腫瘤的CFDNA占全部CFDNA比例在個(gè)體間差異極大。Jahr等[9]通過定量PCR發(fā)現(xiàn)外周血中腫瘤CFDNA占全體CFDNA的比例維持在10%～90%，腫瘤比例最高者總體CFDNA較低。但是，Hibi等[10]的研究卻表明腫瘤CFDNA所占比例相當(dāng)?shù)?為0.2%～10.0%)。這些差異有可能反映腫瘤狀態(tài)(組織學(xué)、腫瘤起源、分級(jí)、大小)也可能是技術(shù)問題(外周血標(biāo)本處理、CFDNA分離、突變檢測)。腫瘤的位點(diǎn)、組織學(xué)、分級(jí)分期對于CFDNA有很大影響，然而目前還缺乏合適的數(shù)據(jù)系統(tǒng)比較不同類型腫瘤之間CFDNA的差異。高水平的CFDNA并不能特異反映腫瘤，因?yàn)槠渌装Y病理狀況，如肝硬化、肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡都會(huì)出現(xiàn)CFDNA的升高。所以，確定腫瘤特異的遺傳改變是評估CFDNA腫瘤起源的最好辦法。

2CFDNA釋放入血的機(jī)制

游離DNA釋放入血的生物機(jī)制目前仍不明晰。目前研究人員主要提出了2種主要機(jī)制：一是凋亡和壞死；二是完整細(xì)胞釋放入血并發(fā)生裂解。

腫瘤位點(diǎn)發(fā)生凋亡和壞死都較為頻繁。凋亡細(xì)胞具有特征化的DNA片斷典型模式(“凋亡階梯”)。在某些情況下，CFDNA表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞才有的階梯模式。但是，大片段甚至接近全基因組大小的DNA片段也常能檢測到。對DNA特定大小片段進(jìn)行定量PCR發(fā)現(xiàn)，血漿中完整DNA的量相比正常人有升高。近期，Diehl等[11]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生DNA突變的大多為小片段，而大片段大多為野生型。據(jù)此，他們提出突變DNA來自壞死細(xì)胞經(jīng)巨噬細(xì)胞消化后的產(chǎn)物。按照這個(gè)理論，突變CFDNA的水平應(yīng)該與腫瘤壞死的程度相一致。但是也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在前列腺癌、乳腺癌、肝癌患者中有完整細(xì)胞釋放入血。值得注意的是，這些細(xì)胞并非轉(zhuǎn)移細(xì)胞，它們僅僅能夠進(jìn)入血液而不能侵襲其他器官，它們在血液中的降解產(chǎn)物構(gòu)成了CFDNA的大片段。Anker等[12]提出細(xì)胞會(huì)主動(dòng)分泌DNA，以核蛋白復(fù)合物的形式入血。該假說基于培養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)新合成的雙鏈DNA。許多附加實(shí)驗(yàn)表明DNA釋放進(jìn)入基質(zhì)并不受到細(xì)胞周期的影響。然而，目前仍然缺乏數(shù)據(jù)闡明DNA主動(dòng)分泌的機(jī)制。

目前對于CFDNA在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮何種生物學(xué)功能還不確定。有人提出釋放入血、發(fā)生基因突變的CFDNA可能會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能。它會(huì)整合進(jìn)入細(xì)胞并改變接受細(xì)胞的遺傳信息。這種學(xué)說甚至導(dǎo)致了“基因組轉(zhuǎn)移”概念的提出。認(rèn)為腫瘤DNA具有改變遠(yuǎn)端器官中干細(xì)胞基因組的潛在能力。

3外周血CFDNA的檢測方法

CFDNA可由酚/氯仿或者商業(yè)化離子交換試劑盒抽提獲得。已有多種高靈敏度方法檢測血漿或血清中的CFDNA。其中包括競爭性放射免疫測定，靈敏度可達(dá)25～1 000 ng/mL，以及對經(jīng)切口翻譯純化的DNA進(jìn)行直接放射標(biāo)記(靈敏度可達(dá)1.6 ng/mL)。DNA嵌入染料，如SYBR Green，Hoechst等，靈敏度還無法達(dá)到檢測微量DNA的水平。利用免疫測定檢測組蛋白和雙/單鏈DNA已有商業(yè)化試劑盒(Cell Death Detection plus-EILSA，Roche,Mannheim,Germany)，但是試驗(yàn)結(jié)果無法與其他方法比較確定敏感性?，F(xiàn)在，最簡單、最適宜進(jìn)行CFDNA濃度測定的方法還是應(yīng)用特異結(jié)合于DNA雙鏈的染料(PicoGreen,Molecular Probes,Inc,Eugene,OR)，能夠檢測到25 pg/mL的雙鏈DNA[13]。

早期，人們采用微衛(wèi)星分析檢測CFDNA中等位基因變化，發(fā)現(xiàn)與腫瘤DNA具有較高一致性。然而，必須考慮到源自腫瘤的CFDNA只占了全部CFDNA中很小一部分，腫瘤DNA等位基因改變在野生型的大背景下難以檢測得到。通過附加PCR測定微衛(wèi)星不穩(wěn)定可檢測到CFDNA中0.1%～0.2%的不穩(wěn)定DNA。CFDNA基因點(diǎn)突變的檢測，如TP53、KRAS2，相比腫瘤組織需要更加精密的方法。在很多情況下，直接基因測序的靈敏度并不能保證，因?yàn)樗鼰o法檢測到野生型基因背景下小于25%的突變信號(hào)。后來出現(xiàn)了2種改進(jìn)方法，一種是限制性位點(diǎn)突變(RSM)，對DNA先進(jìn)行限制性酶消化后再行PCR。另一種是限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，即PCR完成后再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化。但是這兩種方法只能檢測到限制性酶切位點(diǎn)特異的點(diǎn)突變，無法大量應(yīng)用[14-16]。最近，人們應(yīng)用2種較高靈敏度的方法定量檢測特定位點(diǎn)的突變，分別是短片斷寡核苷酸質(zhì)譜分析(SOMA)和乳膠顆粒擴(kuò)增磁性(BEAMing)。在SOMA方法中，通過PCR和酶消化產(chǎn)生突變點(diǎn)周圍的小DNA片段，然后根據(jù)HPLC-電噴離子質(zhì)譜確定特征。一項(xiàng)在非洲岡比亞的病例對照研究采用SOMA檢測突變CFDNA，TP53基因在249位絲氨酸突變在肝細(xì)胞癌患者中位數(shù)水平較高(2 800 copy/mL，范圍500～11 000 copy/mL)，肝硬化和健康者中位數(shù)水平均為500 copy/mL。249位絲氨酸突變對于鑒別診斷肝細(xì)胞癌具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]。在BEAMing方法中，第一輪PCR的產(chǎn)物經(jīng)標(biāo)記轉(zhuǎn)移到顆粒上，然后對于突變位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸，使得野生型與突變型和不同的熒光染料結(jié)合，最后進(jìn)行流失細(xì)胞術(shù)分析。該方法對晚期結(jié)直腸癌患者定量分析發(fā)現(xiàn)，血漿中APC突變平均值為5 300 copy/mL[18]。

對于非特定位點(diǎn)突變的檢測，大部分研究傾向于從采用預(yù)先篩選法。比如變性高壓液相色譜(DHPLC)、時(shí)間溫度梯度電泳(TTGE)、單鏈構(gòu)相多態(tài)性(SSCP)。這些方法的靈敏度范圍為3%～50%(根據(jù)突變的位置和類型)，因此只適合在腫瘤CFDNA所占比例較大時(shí)檢測突變[19]。

4CFDNA與臨床研究

腫瘤患者體內(nèi)CFDNA相比健康人有升高使得CFDNA成為腫瘤早期診斷和預(yù)后評估的有用工具。然而，目前還無法確定CFDNA應(yīng)用于篩選的臨床決定濃度。而且CFDNA濃度與患者實(shí)際的臨床、生物學(xué)、組織學(xué)特征之間的聯(lián)系還未建立起來。比較有希望的是檢測基因改變的CFDNA應(yīng)用于早期診斷或預(yù)后評估。突變CFDNA檢測早于傳統(tǒng)腫瘤診斷的例子還不多。對49例支氣管鏡檢查疑似肺癌患者的CFDNA測定中，Allan等[20]發(fā)現(xiàn)有13例可檢測到雜合子缺失，其中有2例，遺傳改變的CFDNA檢測早于腫瘤診斷幾個(gè)月。所以，對于一些傳統(tǒng)方法難以檢測的腫瘤，遺傳改變的CFDNA可能是有用工具。CFDNA的濃度變化和遺傳改變也可作為疾病治療后監(jiān)測復(fù)發(fā)的有用標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)臨床癥狀的改善往往伴有CFDNA濃度下降。有多項(xiàng)研究表明，腫瘤治療后患者CFDNA的基因改變，如KRAS2突變、多位點(diǎn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定、CDKN2A的超甲基化，可反映疾病的復(fù)發(fā)程度。在一項(xiàng)大規(guī)模的結(jié)直腸癌患者回訪研究中，Ryan等[21]發(fā)現(xiàn)血清中KRAS2突變對于疾病復(fù)發(fā)具有91.0%的靈敏度、88.0%的特異度、62.5%的陽性預(yù)測值。

在過去的10年中，對CFDNA的多項(xiàng)研究使得它成為認(rèn)識(shí)腫瘤的有用工具。然而，進(jìn)一步的臨床應(yīng)用和群體研究還需要更深入了解DNA釋放入血的機(jī)制，CFDNA與疾病進(jìn)展的聯(lián)系基本問題。目前而言，CFDNA作為腫瘤標(biāo)志物的優(yōu)勢在于它可以經(jīng)非侵入性方法獲得，患者痛苦較少，操作性好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于保存。缺點(diǎn)在于特異性較差(遺傳改變的CFDNA無法反應(yīng)腫瘤類型和部位)，而且在非腫瘤患者中也會(huì)出現(xiàn)CFDNA的改變。進(jìn)一步研究工作應(yīng)該是尋找并確定具有最大預(yù)后和診斷價(jià)值的遺傳改變，以發(fā)揮優(yōu)點(diǎn)克服不足。

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(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.033

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)09-1234-03

*基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題計(jì)劃項(xiàng)目(201440470)。

作者簡介：瞿國英，女，副主任檢驗(yàn)技師，主要從事臨床檢驗(yàn)方向的研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：172327959@qq.com。