Slug 、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子和E-鈣黏蛋白在唾液腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及意義

徐娟

（山東省菏澤市立醫(yī)院 口腔科，山東 菏澤 274000）

唾液腺腺樣囊性癌（salivary gland adenoid cystic carcinoma, SACC）是臨床上較為常見(jiàn)的唾液腺惡性腫瘤，發(fā)病率占唾液腺惡性腫瘤的20%左右[1]。其具有發(fā)展緩慢、易轉(zhuǎn)移及侵襲神經(jīng)等特點(diǎn)，引起相關(guān)專家學(xué)者的研究。目前隨著科技的不斷進(jìn)步，有研究顯示，Slug、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）以及細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN）與肝癌的轉(zhuǎn)移、侵襲及發(fā)生、發(fā)展具有重要關(guān)系[2]。Slug是一種轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為與惡性腫瘤的侵襲性關(guān)系密切。EMMPRIN被認(rèn)為與惡性腫瘤的耐藥性、轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)等有著重要聯(lián)系。E-cadherin則是一種黏附蛋白，可以抑制細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT） 過(guò) 程，而EMT在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中又有重要作用。因此人們認(rèn)為，Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中也具有重要地位[3-4]。本文采用免疫組織化學(xué)染色法結(jié)合SACC組織的病理特征，檢測(cè)Slug、EMMPRIN和E-cadherin的表達(dá)結(jié)果，分析Slug、EMMPRIN和E-cadherin的表達(dá)與SACC病理特征的聯(lián)系以及三者相互之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取該院2012年5月-2015年6月期間收治的96例SACC患者手術(shù)中切除的病理標(biāo)本，患者手術(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療，病理資料保存完整。其中，男42例，女54例；年齡42～85歲，平均（61.4±3.5）歲。發(fā)生部位：大唾液腺50例，小唾液腺46例。唾液腺腫瘤組織分型：篩狀型及管狀型（統(tǒng)稱篩管型）68例，實(shí)性型28例。惡性腫瘤TNM（tumor node metastasis）分期：其中Ⅰ期患者19例，Ⅱ期患者21例，Ⅲ期患者30例，Ⅳ期患者26例。確認(rèn)神經(jīng)侵襲病例32例，未發(fā)生神經(jīng)侵襲病例64例。轉(zhuǎn)移病例19例，未轉(zhuǎn)移病例77例。復(fù)發(fā)病例31例，未復(fù)發(fā)病例65例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 一抗：由Abcam生產(chǎn)的兔抗人多克隆Slug抗體；由Santa Cruz生產(chǎn)的兔抗人多克隆EMMPRIN抗體；由Bioss生產(chǎn)的兔抗人多克隆E-cadherin抗體。二抗：由中杉金橋生產(chǎn)的SP- 9001試劑盒。

1.2.2 檢測(cè)方法 將所有標(biāo)本甲醛固定、石蠟包埋并制成4 μm切片。使用鏈霉菌親和素-過(guò)氧化物酶（streptavidin-perosidase, SP）三步法檢測(cè)切片組織中Slug、EMMPRIN以及E-cadherin的表達(dá)，使用二甲苯浸泡標(biāo)本使標(biāo)本脫蠟，梯度乙醇水化，放入3% H2O2，在室溫下孵育15 min，消除過(guò)氧化物酶活性。將標(biāo)本置于濃度為0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸15 min，將煮沸的標(biāo)本進(jìn)行20 min自然冷卻，后加快冷卻至室溫，并使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）液洗滌3次，3 min/次。滴入山羊抗兔二抗工作液（IgG/ Bio），生物素標(biāo)記，30 min室溫孵育。滴入鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），30 min室溫孵育。后再次使用PBS洗滌3次，3 min/次。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色，蘇木精染色，乙醇脫水，干燥，樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗滴入作為空白對(duì)照組。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察唾液腺腺樣囊性癌組織中Slug、EMMPRIN和E-cadherin表達(dá)情況，分析三者與SACC病理特征的關(guān)系。觀察三者間相關(guān)性情況。免疫組化結(jié)果由本院2名檢驗(yàn)科資深醫(yī)師進(jìn)行檢驗(yàn)，顯微鏡方法倍數(shù)400倍，視野中出現(xiàn)棕黃色顆粒細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量計(jì)算組織病理特征。視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞低于5%為陰性；視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞等于5%～50%為弱陽(yáng)性；視野計(jì)數(shù)細(xì)胞大于50%為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）差表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；采用Fisher概率檢驗(yàn)對(duì)三者間相關(guān)性進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達(dá)情況

Slug為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率高達(dá)77.08%；EMMPRIN為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為68.75%；E-cadherin為弱陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率為52.08%。見(jiàn)表1。

表1 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達(dá)情況 例（%）

2.2 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達(dá)與SACC病理特征的關(guān)系

SACC組 織 中 Slug、EMMPRIN和 E-cadherin的表達(dá)性別、年齡與部位比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Slug、EMMPRINⅢ、Ⅳ期陽(yáng)性率與Ⅰ、Ⅱ期陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Slug、EMMPRIN實(shí)性型陽(yáng)性率分別為91.43%、94.29%，Slug、EMMPRIN篩管型陽(yáng)性率分別為68.86%、54.10%，Slug、EMMPRIN實(shí)性型陽(yáng)性率明顯高于篩管型陽(yáng)性率（P＜0.05）；Slug有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率分別為93.75%、91.67%和90.32%，Slug無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率分別為68.75%、68.33%和70.77%，EMMPRIN有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率分別為93.75%、97.22%和87.10%，EMMPRIN無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率分別為56.25%、51.67%和60.00%，Slug、EMMPRIN有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率明顯高于無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)（P＜0.05）；E-cadherin在Ⅰ、Ⅱ期的陽(yáng)性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期（P＜0.05）；E-cadherin篩管型的陽(yáng)性率明顯高于實(shí)性型（P＜0.05）；E-cadherin無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率明顯高于有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)（P＜0.05）。見(jiàn)表 2。

表2 Slug、EMMPRIN和E-cadherin在SACC中的表達(dá)與SACC病理特征的關(guān)系 （n =96）

2.3 Slug、E MMPRIN在SACC中表達(dá)的相關(guān)性分析

SACC中Slug的表達(dá)與EMMPRIN呈明顯正相關(guān)（r=0.836,P=0.002）。見(jiàn)表3。

2.4 Slug、E-cadherin在SACC中表達(dá)的相關(guān)性分析

SACC中Slug的表達(dá)與E-cadherin呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.542,P=0.025）。見(jiàn)表4。

2.5 EMMPRIN、E-cadhe rin在SACC中表達(dá)的相關(guān)性分析

SACC中EMMPRIN的表達(dá)與E-cadherin呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.461,P=0.031）。見(jiàn)表5。

表3 Slug、EMMPRIN在SACC中的表達(dá)相關(guān)性分析 （n =96）

表4 Slug、E-cadherin在SACC中表達(dá)的相關(guān)性分析 （n =96）

表5 EMMPRIN、E-cadherin在SACC中表達(dá)的相關(guān)性分析 （n =96）

3 討論

SACC是一種臨床上唾液腺較為常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性。與大多數(shù)惡性腫瘤相同，SACC手術(shù)治療效果較佳，但對(duì)于SACC患者術(shù)前術(shù)后的病理分析較為重要，如何采取可靠的觀察指標(biāo)觀察患者術(shù)后的預(yù)后情況是關(guān)鍵。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，越來(lái)越多的腫瘤指標(biāo)物被人們挖掘出來(lái)，成為腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床腫瘤病人預(yù)后的評(píng)估奠定了依據(jù)。為進(jìn)一步研究SACC轉(zhuǎn)移、侵襲等過(guò)程，本文對(duì)SACC組織進(jìn)行研究，觀察Slug、EMMPRIN以及E-cadherin在SACC中表達(dá)情況，分析與病理特征的關(guān)系以及三者互相的關(guān)系。

Slug屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤EMT過(guò)程中起到重要作用，最初學(xué)者發(fā)現(xiàn)其參與了神經(jīng)胚的形成和發(fā)育。隨著腫瘤發(fā)病率的不斷升高，人們又在惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Slug的身影，而在惡性腫瘤中，Slug一般表現(xiàn)為過(guò)度表達(dá)，引起了相關(guān)專家學(xué)者的興趣[5]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Slug在惡性腫瘤EMT過(guò)程中具有重要作用，且參與了惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[6]。在本文中對(duì)SACC組織中Slug的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Slug在SACC中呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率高達(dá)77.08%，顯著高于Tang等[7]研究正常唾液腺組織中陽(yáng)性表達(dá)率的0%（0/10）。本文觀察Slug與病理特征關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，Slug在Ⅲ、Ⅳ期的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，實(shí)性型的陽(yáng)性率明顯高于篩管型，有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率明顯高于無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)（P＜0.05）。同時(shí)證實(shí)了Slug在SACC中發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)以及侵襲中的重要性。

EMMPRIN是免疫球蛋白家族中的一員，是跨膜糖蛋白的一種，研究人員首次在腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[8]。有研究顯示EMMPRIN可誘導(dǎo)部分基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase, MMPs）的表達(dá)[9]。EMMPRIN通過(guò)刺激成纖維細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力和轉(zhuǎn)移能力。在正常細(xì)胞中，EMMPRIN位于細(xì)胞膜上，而當(dāng)EMMPRIN轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中時(shí)會(huì)誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)。謝宏亮等[10]的研究中使EMMPRIN沉默表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的侵襲力明顯降低，體現(xiàn)了EMMPRIN參與了惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。本文中研究結(jié)果顯示，EMMPRIN在SACC組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)率高達(dá)68.75%。結(jié)果顯示EMMPRIN可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)從而達(dá)到增強(qiáng)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲力的結(jié)果。本文中還顯示，EMMPRIN在Ⅲ、Ⅳ期的陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，實(shí)性型的陽(yáng)性率明顯高于篩管型，有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率明顯高于無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)（P＜0.05）。同樣證實(shí)了其在SACC中的重要性和影響。

E-cadherin是鈣黏附蛋白的一種，主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞之間的互相黏附，在以往作為EMT的重要標(biāo)志[11]。E-cadherin的下調(diào)會(huì)使細(xì)胞發(fā)生EMT，使細(xì)胞喪失細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)向間質(zhì)細(xì)胞的特征轉(zhuǎn)化，使腫瘤細(xì)胞具備了轉(zhuǎn)移能力[12]。目前對(duì)大腸癌、前列腺癌、肝癌及肺癌等多數(shù)研究均發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)，表明EMT在多種惡性腫瘤中均起到重要作用[13-14]。因此本文對(duì)SACC組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin在SACC組織中呈弱陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率僅為52.08%，遠(yuǎn)低于駱一西等[15]研究的正常唾液腺組織中表達(dá)的100%。本文還發(fā)現(xiàn)E-cadherin與病理特征的關(guān)系與Slug、EMMPRIN不同，在Ⅰ、Ⅱ期的陽(yáng)性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期，篩管型的陽(yáng)性率明顯高于實(shí)性型，無(wú)神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的陽(yáng)性率明顯高于有神經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)（P＜0.05）。

本文還進(jìn)一步研究了Slug、EMMPRIN和E-cadherin三者在SACC中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SACC中Slug的表達(dá)與EMMPRIN呈明顯正相關(guān)（r=0.836,P＜0.05）；Slug的表達(dá)與E-cadherin呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.542,P＜0.05）；EMMPRIN的表達(dá)與E-cadherin呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.461,P＜0.05）。

綜上所述，本文對(duì)Slug、EMMPRIN和E-cadherin三者在SACC中的表達(dá)做了深入分析，發(fā)現(xiàn)三者與SACC病理特征關(guān)系密切，Slug、EMMPRIN表達(dá)與SACC呈正相關(guān)性，E-cadherin表達(dá)與SACC呈負(fù)相關(guān)性。因此三者表達(dá)的聯(lián)合檢測(cè)可能成為對(duì)SACC的疾病程度、預(yù)后等評(píng)估的有效指標(biāo)。

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