組織工程血管的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

張佳玲　付　煒　殷　猛

200127，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科(張佳玲，殷　猛)；兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所(付　煒)

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組織工程血管的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

張佳玲付煒殷猛

200127，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心心胸外科(張佳玲，殷猛)；兒科轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所(付煒)

【摘要】在組織工程血管向臨床轉(zhuǎn)化的過程中，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是關(guān)鍵，選擇合適的動(dòng)物模型尤為重要。篩選動(dòng)物模型通常以血管直徑的匹配度為主要參考因素，此外還受物種差異、移植部位、促凝性等多種因素的影響。該文介紹近幾年血管移植動(dòng)物模型在組織工程血管領(lǐng)域中的應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】組織工程血管；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；動(dòng)物模型

雖然已有許多生物材料以及高分子材料應(yīng)用于組織工程血管的重建，但是仍然沒有一種“完美”的移植材料可以廣泛應(yīng)用。特別是在小口徑人工血管(直徑<6 mm)的重建和再生過程中，發(fā)生血栓、感染等并發(fā)癥的概率也在上升[1]。近年來，多學(xué)科的交叉研究促進(jìn)了小口徑人工血管的發(fā)展，但是其臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[2]。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體內(nèi)環(huán)境，對(duì)移植血管進(jìn)行合理而準(zhǔn)確的評(píng)估，是組織工程血管向臨床轉(zhuǎn)化過程中必不可少的一步，選擇合適的動(dòng)物模型至關(guān)重要。

1動(dòng)物模型的篩選標(biāo)準(zhǔn)

理想的血管移植動(dòng)物模型需要考慮以下幾個(gè)因素：移植物直徑、植入部位、促凝性、免疫原性以及特定的臨床需求[3]。完全理想的動(dòng)物模型是不存在的，應(yīng)針對(duì)具體的研究目的，根據(jù)不同動(dòng)物的特性以及移植部位等，選擇合適的動(dòng)物模型。在篩選過程中，除了上述條件外，還需要考慮動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)成本、實(shí)用性；手術(shù)以及術(shù)后實(shí)驗(yàn)易操作；動(dòng)物對(duì)麻醉和手術(shù)的反應(yīng)和耐受性；動(dòng)物接受移植部位的自體血管固有直徑和流量也要作為篩選標(biāo)準(zhǔn)；實(shí)驗(yàn)所用的動(dòng)物模型移植部位在生理功能方面應(yīng)接近人體相對(duì)應(yīng)的部位[2-4]。

2組織工程血管動(dòng)物模型的應(yīng)用

血管直徑匹配度是選擇動(dòng)物模型最關(guān)鍵的因素。根據(jù)動(dòng)物自體血管直徑大小，可將組織工程血管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)常用的動(dòng)物分為以下幾類。

2.1直徑為0.5～2 mm的血管

直徑為0.5～2 mm的小口徑血管可應(yīng)用于周圍血管疾病，尤其是動(dòng)脈系統(tǒng)疾病。由于小口徑血管遠(yuǎn)期通暢率不高，臨床應(yīng)用一直較困難，開發(fā)空間較大。

2.1.1兔兔的頸動(dòng)脈和股動(dòng)脈長直且分支少，適用于直徑1.5～2 mm組織工程血管的移植。

兔頸動(dòng)脈是小口徑血管移植中最常用的部位。Zheng等[5]制備的直徑為2.2 mm，長度為1.5 cm的小口徑人工血管，經(jīng)多肽修飾后植入到新西蘭大白兔頸動(dòng)脈中段，于術(shù)后2周和4周時(shí)分別行數(shù)字減影血管造影術(shù)(DSA)觀察人工血管在體內(nèi)的通暢性。結(jié)果顯示，經(jīng)多肽修飾后的人工血管在通暢率、內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率等方面明顯優(yōu)于未經(jīng)修飾的對(duì)照人工血管。

兔股動(dòng)脈也是建立小口徑血管動(dòng)物模型的常用部位[6-8]，并且逐漸向臨床疾病模型轉(zhuǎn)化。Zhu等[9]用體外構(gòu)建的組織工程血管在兔股動(dòng)脈上建立了外周血管疾病模型，在一定程度上模擬人的冠狀動(dòng)脈(冠脈)慢性完全閉塞病變(CTO),可用于臨床疾病的監(jiān)測、診斷以及治療。

2.1.2大鼠大鼠的頸總動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈是血管移植中常用的血管模型。尤其是大鼠的腹主動(dòng)脈較長，易于操作，顯影清晰，為后續(xù)的影像學(xué)監(jiān)測提供了方便。適用于直徑0.5～1.5 mm組織工程血管的移植。

Zeng等[10]使用Wistar大鼠作為受體，將神經(jīng)生長因子(NGF)偶聯(lián)后的脫細(xì)胞血管植入大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，用多普勒超聲監(jiān)測和評(píng)估血管通暢情況。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α/肝素涂層的生物可降解人工血管(內(nèi)徑為1 mm,長度為6 mm)[11]和蛋白質(zhì)表面結(jié)合的組織工程血管[12]均利用SD大鼠的頸總動(dòng)脈為植入位點(diǎn)，研究目的血管的體內(nèi)過程。

大鼠的腹主動(dòng)脈也是常用的血管移植部位。將LacZ基因轉(zhuǎn)染的肌源性干細(xì)胞種植所得的組織工程血管(直徑為1.2 mm，長度為10 mm)，端端吻合于Lewis大鼠的腹主動(dòng)脈，8周后行血管造影術(shù)并作組織學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示LacZ陽性細(xì)胞出現(xiàn)在血管重構(gòu)形成的平滑肌細(xì)胞層中[13]。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在組織工程血管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用，可以針對(duì)性地研究分子水平的機(jī)制。

2.1.3小鼠小鼠的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈是小口徑血管較常用的移植部位，適用于直徑0.5～1 mm組織工程血管的移植。

免疫缺陷類小鼠：Roh等[14]將人的骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMC)種植在高分子材料支架上，制成小口徑組織工程血管，在SCID/bg小鼠的下腔靜脈中段植入，并且進(jìn)行長達(dá)24周的實(shí)驗(yàn)，組織工程血管在體內(nèi)的通暢性和形態(tài)學(xué)則通過各個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的微型CT血管成像來評(píng)價(jià)。以聚乳酸為材料的內(nèi)徑為0.5～0.6 mm，長度為3 mm的小口徑血管植入SCID/Bg小鼠的腹主動(dòng)脈，采用超聲波和微型CT血管造影作為移植后連續(xù)監(jiān)測的手段[15]。Nelson等[16]也用SCID/Bg小鼠的腹主動(dòng)脈作為目標(biāo)位點(diǎn)，植入直徑約0.9 mm的組織工程小動(dòng)脈，研究其在體內(nèi)血管新生組織的形成，同樣以微型CT血管造影來進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。

活體分子成像技術(shù)也被應(yīng)用在組織工程血管在體內(nèi)監(jiān)測領(lǐng)域中，將熒光蛋白標(biāo)記的種子細(xì)胞和支架組裝而成的小口徑組織工程血管(內(nèi)徑約1 mm)植入裸鼠頸動(dòng)脈中段，然后用活體分子成像技術(shù)進(jìn)行分子水平的追蹤，監(jiān)測結(jié)果與最后的組織學(xué)評(píng)價(jià)一致[17]。這種無創(chuàng)監(jiān)測方法不僅可以觀察到組織工程血管在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)重構(gòu)過程，還可以研究種子細(xì)胞的動(dòng)態(tài)和走向，但是活體分子成像技術(shù)不能完全穿透整個(gè)支架壁，不能觀察移植物在體內(nèi)是否通暢。

小型動(dòng)物來源廣泛，不僅手術(shù)操作簡單，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，樣本量可以很大，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可信度較高。但是小動(dòng)物與人類差異太大，模擬人體疾病以及免疫反應(yīng)的相似度不高，只能用于近期實(shí)驗(yàn)觀察。

2.2直徑為3～5 mm的血管

直徑為3～5 mm的小口徑血管臨床需求大，是組織工程血管領(lǐng)域研究和開發(fā)的重點(diǎn)。

2.2.1犬犬的心血管生理機(jī)能與人相似，且血管通路相對(duì)簡單，犬在實(shí)驗(yàn)外科的應(yīng)用歷史悠久，但是它在促凝血方面有較大的個(gè)體差異性，是犬在血管移植應(yīng)用中的缺陷[4]。犬作為血管移植模型，有多個(gè)部位可供選擇，以滿足不同的血管口徑需求。

在血管組織工程體內(nèi)再生中，動(dòng)物模型可以提供細(xì)胞來源，解決了種子細(xì)胞的排異反應(yīng)及免疫反應(yīng)。將犬的隱靜脈酶消化而來的細(xì)胞，與脫細(xì)胞支架在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后回植入細(xì)胞捐贈(zèng)犬的頸動(dòng)脈，術(shù)后6個(gè)月通暢率良好，組織學(xué)及免疫組化分析顯示血管結(jié)構(gòu)和細(xì)胞密度接近天然血管[18]。除了生物材料支架，目前天然材料以及高分子材料在組織工程血管支架中的應(yīng)用也頗為廣泛[19-20]。Zhou等[21]用犬外周血中分離出來的生長內(nèi)皮細(xì)胞與高分子材料支架(直徑為3 mm，長度為4～5 cm)體外培養(yǎng)后，植入供體犬的頸動(dòng)脈內(nèi)，并用多普勒超聲進(jìn)行監(jiān)測，3個(gè)月后實(shí)驗(yàn)組的通暢率達(dá)83.3%，免疫熒光鑒定也證實(shí)種子細(xì)胞參與了體內(nèi)的血管組織再生。

由于組織工程中的體外培養(yǎng)操作要求高且周期較長，近年來有人提出了體內(nèi)組織工程的概念[2]，即省略種子細(xì)胞體外培養(yǎng)階段，僅對(duì)支架進(jìn)行抗凝血等修飾，或者將支架與天然生物材料交聯(lián)。將支架直接植入體內(nèi)受損傷部位，依靠體內(nèi)自身細(xì)胞的趨化作用以及細(xì)胞的遷移進(jìn)行局部組織重建，實(shí)現(xiàn)活體內(nèi)組織的自身修復(fù)和原位再生[22-23]。

2.2.2豬豬的心血管系統(tǒng)從解剖學(xué)和生理學(xué)方面都接近于人類，尤其是豬的冠脈系統(tǒng)在缺血再灌注和冠脈支架技術(shù)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用極為廣泛。由于豬的個(gè)體相對(duì)較大、生長速度過快、麻醉耐受性差、飼養(yǎng)價(jià)格較為昂貴，在3～5 mm直徑的血管組織工程的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，豬的應(yīng)用不及犬和羊。

Niklason等[24]以高分子材料聚乳酸作為支架制備的組織工程血管(TEBV),在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)8周后植入豬體內(nèi)，進(jìn)行28 d的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，首次證明了體外構(gòu)建組織工程血管的可行性。針對(duì)人工血管的快速內(nèi)皮化問題，Lu等[25]在豬的頸動(dòng)脈驗(yàn)證了接枝CD133抗體和肝素后的膨體聚四氟乙烯(ePTFE)血管在體內(nèi)的快速內(nèi)皮化過程。

然而，相比體內(nèi)血管的中段植入，血管的端側(cè)吻合旁路移植模型能更好地模擬旁路移植手術(shù)，但是血管內(nèi)膜增生的概率較高，對(duì)組織工程血管的評(píng)價(jià)更為嚴(yán)格。Quint等[26]在此模型上建立了一個(gè)“現(xiàn)成”的組織工程血管，他們用供體豬的平滑肌細(xì)胞和生物可降解材料制備的支架在仿生灌流裝置中進(jìn)行體外培養(yǎng)，在此過程中生物材料降解，而平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。將得到的血管進(jìn)行脫細(xì)胞處理，最終得到由細(xì)胞外基質(zhì)組成的“現(xiàn)成”血管支架，再與受體豬的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，制備成組織工程血管。將此血管植入受體豬頸動(dòng)脈行端側(cè)吻合旁路移植，結(jié)果顯示30 d后通暢率為100%，無明顯內(nèi)膜增生。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了同種異體細(xì)胞產(chǎn)生的結(jié)締組織在組織工程血管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的有效性。

2.2.3羊羊的凝血系統(tǒng)更接近于人類,但其血液處于相對(duì)高凝狀態(tài)[4]。羊頸動(dòng)脈移植在直徑3～5 mm組織工程血管體內(nèi)試驗(yàn)中的應(yīng)用較廣泛。Koch等[27]將羊頸動(dòng)脈作為移植部位，對(duì)種植有其自身細(xì)胞的復(fù)合支架分別進(jìn)行了短期以及中長期評(píng)價(jià)。另外,動(dòng)物模型也可以對(duì)組織工程血管中的新型材料進(jìn)行測試，利用羊頸動(dòng)脈移植進(jìn)行新型材料細(xì)菌纖維素的評(píng)估[28]。

對(duì)血管體內(nèi)移植后的監(jiān)測手段也在不斷地改進(jìn)和發(fā)展，其中動(dòng)物模型的貢獻(xiàn)也必不可少。為了評(píng)價(jià)無創(chuàng)成像監(jiān)測過程中納米顆粒標(biāo)記材料的作用，用目的標(biāo)記物標(biāo)記的編織支架和種子細(xì)胞組裝而成的TEBV在羊頸部作動(dòng)靜脈分流，進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，結(jié)果證明目的標(biāo)記物的有效性和安全性[29]。

羊、豬、犬的頸動(dòng)脈和股動(dòng)脈直徑為3～5 mm，與人的外周血管匹配，部位淺顯易暴露。此外，這類動(dòng)物模型價(jià)格較為低廉，飼養(yǎng)和術(shù)后觀察方便。組織工程血管體內(nèi)移植后血管內(nèi)腔需要實(shí)現(xiàn)快速的內(nèi)皮化，犬和羊的血管內(nèi)皮化速度遠(yuǎn)高于人類[4]，這也是臨床前期實(shí)驗(yàn)中需要考慮到的因素。

2.3直徑>5 mm的血管

大口徑組織工程血管的臨床需求和應(yīng)用也非常廣泛，如用在慢性腎病患者血液透析的動(dòng)靜脈短路血管以及外周血管疾病的血管旁路治療。直徑6～10 mm的人工血管可應(yīng)用于四肢動(dòng)脈及頸部動(dòng)脈的人工血管轉(zhuǎn)流術(shù)。

2.3.1狒狒及非人靈長類動(dòng)物狒狒等靈長類動(dòng)物能很好地模擬人類，成為組織工程血管在臨床前實(shí)驗(yàn)中最為準(zhǔn)確的評(píng)估模型，在基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化的過程中作用重大，但是動(dòng)物獲取來源困難、價(jià)格昂貴。

靈長類動(dòng)物全身多個(gè)部位都可用于血管的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。Clowes等[30]在狒狒的頸動(dòng)脈和髂動(dòng)脈植入長度為7～9 cm的膨體聚四氟乙烯(ePTFE)人工血管，12個(gè)月后60%的血管已經(jīng)達(dá)到完全內(nèi)皮化。

狒狒的血管動(dòng)靜脈短路模型具有操作簡便、長度可控等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程血管試驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。Jordan等[31]用新型材料涂層的ePTFE人工血管造成狒狒的動(dòng)靜脈短路，以觀察機(jī)體對(duì)新型材料的凝血活性反應(yīng)。前文中提到的“現(xiàn)成”的組織工程血管，在狒狒動(dòng)靜脈短路模型上(直徑為6 mm)也得到了證實(shí)[18]。利用狒狒上臂腋動(dòng)脈和遠(yuǎn)端肱靜脈的短路模型，發(fā)現(xiàn)此類血管移植后內(nèi)膜增生減輕的機(jī)制在于血流動(dòng)力學(xué)改變輕微以及炎癥反應(yīng)較弱[32]。

2.3.2犬犬的胸主動(dòng)脈以及腹主動(dòng)脈在早期就用于大口徑血管(直徑為6～8 mm)的置換研究。為了評(píng)價(jià)體內(nèi)組織工程血管，前人建立了胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈旁路[33-34]。1996年，Marois等[35]用直徑8 mm,長度為30 cm的白蛋白涂層人工血管在犬的胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈建立旁路，研究血管表面血栓形成以及治療效果。也有實(shí)驗(yàn)利用犬的主要?jiǎng)屿o脈以構(gòu)建大口徑血管[22,36]。Isayama等[23]用生物可降解材料制備直徑8 mm的無細(xì)胞血管支架，在犬的下腔靜脈證實(shí)了組織工程血管的原位再生。

大型動(dòng)物心血管系統(tǒng)的解剖和生理更接近人類，一般用于中長期的移植研究。

3小結(jié)

隨著組織工程血管的不斷發(fā)展以及迫切的臨床需求，血管由體外培養(yǎng)和制備向體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化成為趨勢。0.5～2 mm的小口徑血管的抗凝作用和快速內(nèi)皮化是研究難點(diǎn)和重點(diǎn)，小型動(dòng)物模型可提供多樣本、短期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察；直徑3～5 mm的血管在冠脈搭橋術(shù)等手術(shù)中應(yīng)用廣泛，羊、豬、犬的全身多部位都可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；較大的動(dòng)物模型在模擬人體反應(yīng)方面更好，可用于臨床前預(yù)實(shí)驗(yàn)。

由于組織工程血管的免疫原性，免疫缺陷動(dòng)物模型更適宜體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，但是目前應(yīng)用較多的免疫缺陷動(dòng)物只限于裸鼠、Beige小鼠以及SCID小鼠等小型動(dòng)物。近年有學(xué)者用基因重組和體細(xì)胞克隆技術(shù)，培育出T細(xì)胞和NK細(xì)胞缺陷的免疫缺陷小型豬模型[37]；Song等[38]利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)，將家兔負(fù)責(zé)T細(xì)胞和B細(xì)胞重排的重組激活基因(RAG)敲除，獲得了世界上首例免疫缺陷家兔模型。這些免疫缺陷大動(dòng)物模型的應(yīng)用將會(huì)推動(dòng)組織工程血管的發(fā)展。

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(收稿:2015-10-14 修回:2016-01-04)

(本文編輯：丁媛媛)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.02.012

通信作者：殷猛, Email: yinmengmdphd@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81271726)，上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉基金(YG2012MS35)