鹽酸?？颂婺釋?duì)人T淋巴細(xì)胞增殖的影響

韓貴良 石巖 任冠穎 王小磊

（河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北保定071000）

鹽酸?？颂婺釋?duì)人T淋巴細(xì)胞增殖的影響

韓貴良 石巖 任冠穎 王小磊

（河北大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北保定071000）

目的觀察酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）鹽酸?？颂婺釋?duì)人T淋巴細(xì)胞增殖的影響。方法應(yīng)用免疫磁珠分選的方法從外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中分選出T淋巴細(xì)胞，分別加入不同濃度的鹽酸埃克替尼培養(yǎng)1 h后，加入PMA刺激T細(xì)胞增殖，培養(yǎng)48～72 h后分別收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用四氮甲唑蘭比色法（MTT法）檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果本研究比較了培養(yǎng)72 h后各組細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓細(xì)胞的增殖，各組抑制率如下：鹽酸埃克替尼1000 ng/mL組為（12.0±5.0）%（P=0.053），2500 ng/mL組為20.0±3.6%（P=0.011），5000 ng/mL組為21.6±5.6%（P=0.022）。結(jié)論鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓細(xì)胞的增殖。

酪氨酸激酶抑制劑；腫瘤免疫；T淋巴細(xì)胞

鹽酸埃克替尼是我國具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的小分子靶向抗癌創(chuàng)新藥，臨床研究表明鹽酸?？颂婺嵩谕砥诜切〖?xì)胞肺癌治療過程中顯示一定優(yōu)越性[1]。有研究報(bào)道酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼[2]、達(dá)沙替尼[3]、厄洛替尼[4]能夠抑制T細(xì)胞的增殖，但鹽酸?？颂婺釋?duì)T淋巴細(xì)胞的增殖有何影響，尚未見報(bào)道，故作者進(jìn)行了相關(guān)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料：①細(xì)胞：人外周血T淋巴細(xì)胞為從人外周富集血中分離；②細(xì)胞培養(yǎng)試劑：細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640（美國Invitrogen公司），胎牛血清（美國Gibco公司），96孔培養(yǎng)板（美國Corning公司），F(xiàn)icoll分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），Pan T cell isolation kitⅡ（德國Miltenyi Biotec公司）。

1.2 設(shè)備：超凈工作臺(tái)（上海力申科學(xué)儀器有限公司），HEPA CLASS100加濕CO2孵箱（美國Thermo公司），JX70倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），Synergy HT酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 T細(xì)胞的分離：取4 mL富集外周血，F(xiàn)icoll分離法提取單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用Pan T cell isolation kitⅡ分選單個(gè)核細(xì)胞，分選柱下方所收集細(xì)胞即為T細(xì)胞。

1.3.2 T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)：所得T細(xì)胞以細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，使細(xì)胞濃度為1.5×106/mL，以200 μL每孔接種到96孔板中。設(shè)對(duì)照組、鹽酸?？颂婺峤M，對(duì)照組鹽酸?？颂婺釢舛葹? ng/mL，鹽酸?？颂婺峤M設(shè)三個(gè)濃度：1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/ mL；各組加入藥物后于37℃加濕5%CO2孵箱中培養(yǎng)1 h，然后各組均加入佛波酯（PMA），終濃度分別為50 ng/mL，培養(yǎng)48～72h。

1.3.3 MTT法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況：T淋巴細(xì)胞密度為1.5×106/mL，接種于96孔板中，每孔培養(yǎng)液200 μL，空白對(duì)照孔只加培養(yǎng)液。各組按1.3.2描述中加入藥物，37℃，5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h，每組每濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入5 mg/ mL MTT液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，離心培養(yǎng)板，吸棄上清，每孔加入DMSO150 μL，微量震蕩器震蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度（OD）值。按下列公式計(jì)算抑制率：抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組定量資料的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

鹽酸?？颂婺崮軌蛞种芓淋巴細(xì)胞的增殖。我們比較了實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的抑制率，鹽酸?？颂婺峤M1000ng/m組為12.0±5.0%（P=0.053），2500ng/ mLl組為20.0±3.6%（P=0.011），5000ng/mL組為21.6±5.6%（P=0.022）。隨藥物濃度增加，抑制率有提高趨勢(shì)，提示鹽酸?？颂婺釋?duì)T細(xì)胞增殖的抑制呈濃度依賴性。

3 討論

鹽酸?？颂婺崾俏覈灾餮兄频?、具有世界專利的治療非小細(xì)胞肺癌的國家一類新藥，在分子水平，鹽酸?？颂婺嵋种艵GFR激酶活性的IC50（當(dāng)50%酶活性被抑制時(shí)的抑制劑濃度）為5 nM，和國外上市產(chǎn)品相當(dāng)。在測(cè)定了鹽酸?？颂婺釋?duì)85種激酶（包括其突變型）的抑制活性的結(jié)果顯示，鹽酸埃克替尼在0.5 μM（100倍于對(duì)EGFR激酶活性抑制的IC50）時(shí)對(duì)EGFR激酶的抑制特異性較高，沒有顯示出對(duì)其它激酶的抑制，表明鹽酸?？颂婺崾且粋€(gè)特異性較高的EGFR激酶抑制劑[5]。目前該藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，并改善了腫瘤患者的生存，但該藥物需長(zhǎng)期應(yīng)用，在用藥過程中是否會(huì)影響T細(xì)胞的增殖，目前尚未見報(bào)道，我們對(duì)此進(jìn)行了研究。為了更加貼近臨床實(shí)際，我們選取人外周血中的T細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察了鹽酸埃克替尼對(duì)人T淋巴細(xì)胞增殖的影響。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，我們盡量使實(shí)驗(yàn)條件與體內(nèi)環(huán)境相似，藥物濃度的選取以腫瘤患者服藥后達(dá)到的穩(wěn)態(tài)血藥濃度為參考，實(shí)驗(yàn)藥物濃度均在其附近。按臨床常規(guī)劑量（125 mg tid）應(yīng)用鹽酸?？颂婺?，穩(wěn)態(tài)血藥濃度為2500±378 ng/mL[6]，實(shí)驗(yàn)組藥物濃度設(shè)為1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/mL。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹽酸埃克替尼能夠抑制T細(xì)胞的增殖，僅在較高濃度時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。鹽酸埃克替尼是通過何種機(jī)制抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，目前已有酪氨酸激酶抑制劑影響細(xì)胞周期分布的報(bào)道，Ling等[7]已證實(shí)厄洛替尼通過誘導(dǎo)p27kip1的產(chǎn)生阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而實(shí)現(xiàn)G1期阻止，Qiong等[4]也發(fā)現(xiàn)厄洛替尼能夠使活化T細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）抑制劑p27kip1的表達(dá)升高。舒尼替尼對(duì)細(xì)胞周期的影響亦有報(bào)道，Yanhong等[8]發(fā)現(xiàn)舒尼替尼能夠使T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期素D3和磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）減少，同時(shí)CDK6、CDK4磷酸化水平降低，從而實(shí)現(xiàn)G1期阻滯。楊彩玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸?？颂婺嵬ㄟ^降低人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113，改變Tca8113的細(xì)胞周期分布，有明顯的G0/G1期阻滯作用，由此推斷鹽酸埃克替尼可能是通過影響T細(xì)胞的周期分布，從而影響T淋巴細(xì)胞的增殖。

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［9］楊彩玲，韓新光，于春亞.鹽酸埃克替尼對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞周期及Cy-clinD1、P27表達(dá)的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，25（1）：82-85.

The Effect of Icotinib on the Proliferation of T Lymphocyte

Han Guiliang Shi Yan Ren Guanying Wang Xiaolei

（Department of Oncology；Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo observe the effect of tyrosine kinase inhibitor（TKI）such as icotinib on T lymphocyte.MethodsTlymphocytes were selected from peripheral blood mononuclear cells by immunomagnetic cell sorting.Then the T lymphocytes were stimulated by Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）and increasing dose of icotinib was added to the experimental group.After culturing 48-72 hours the proliferation rate of the T lymphocytes was analyzed by MTT.ResultsWe compared the inhibitory rate between the control group and experiment group，and we found that icotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.ConclusionIcotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.

Targeted therapy；Tyrosine kinase inhibitor；Tumor immunology

R453

A 學(xué)科分類代碼：32067

1001-8131（2016）06-0639-02

2016-07-18