樺樹皮甲醇提取物的體外抗氧化活性研究

寇智斌　徐鳳玲　何林林　夏曉慧　林奇泗

【摘要】目的：測定樺樹皮甲醇提取物的體外抗氧化活性。方法：以2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）和維生素C 為對照，測定樺樹皮甲醇提取物對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率，并用鐵離子還原法（FRAP）分析了樺樹皮甲醇提取物的抗氧化活性。結(jié)果：樺樹皮甲醇提取物、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）和維生素C對DPPH的IC50分別為0.43、0.09和0.21mg/ml，F(xiàn)RAP值分別為1.54±0.012、4.54±0.028.和5.76±0.041mmol/g。結(jié)論：樺樹皮甲醇提取物對DPPH自由基有良好的清除作用，對鐵離子的還原性較強，具有良好的抗氧化活性。

【關(guān)鍵詞】樺樹皮；抗氧化； 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法；鐵離子還原法

【中圖分類號】R285.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）01-0026-02

樺樹皮為樺樹科植物白樺（Betula platyphylla Suk）的柔軟樹皮，具有清熱利濕、解毒的功效[1]。以往報道鮮見樺樹皮的抗氧化活性研究，因此研究樺樹皮甲醇提取物的抗氧化活性，為進一步探討樺樹皮藥理作用奠定基礎(chǔ)[2-3]。天然藥物的抗氧化能力評價主要采用化學測定法和細胞測定兩類方法[4-5]。研究采用FRAP法和DPPH法分別對樺樹皮甲醇提取物進行體外抗氧化活性檢測，為樺樹皮的抗氧化活性及相關(guān)應(yīng)用開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 UV-MODEL752型可見-紫外分光光度計（上海現(xiàn)科分光儀器有限公司）；SB-5200D超聲波清洗器； N-1100V-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；四兩裝高速中藥粉碎機；PL203電子分析天平；OSB-2100水浴鍋。

1.2 試劑 樺樹皮藥材購自大興安嶺，粉碎后過二號篩干燥備用；水為雙蒸水；甲醇、乙醇均為分析純，購自科特試劑有限公司；TPTZ（2，4，6-反式2-吡啶基三嗪）、BHT（2，6-二叔丁基對甲酚）和VC等均購自上海柏卡試劑有限公司。

2 實驗方法

2.1 樺樹皮提取物的制備 取干燥的樺樹皮5g，用甲醇200ml于索氏提器中水浴恒溫85℃提取60min，過濾，液濾濃縮干燥成浸膏。

2.2 對DPPH自由基的清除作用 將“2.1”項下樺樹皮提取物用乙醇溶解，并配制為一系列不同濃度提取物乙醇溶液。分別平行移取3.0ml的兩份。其中，一份與3.0ml 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液混合均勻，于暗處靜置30min后取出，用紫外分光光度計于516nm處測定吸光度（A1）；另一份與3.0ml乙醇混合均勻，于暗處靜置30min后取出，同法測定其吸光度（A2）。另取一份3.0ml 0.2mmol/l DPPH 溶液與3.0ml乙醇溶液同法操作，混合反應(yīng)30min后測定其吸光度（A3）。每樣測定3次取平均值。按公式計算清除率，以濃度（mg/ml）為橫坐標，清除率為縱坐標繪制標準曲線。當清除率達到50%時的供試品濃度即為半數(shù)抑制率（IC50）。同法以VC和BHT水溶液為陽性對照。

DPPH 自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A3]×100%

2.3 FRAP值的測定

2.3.1 TPTZ 溶液的配制 取一定量的TPTZ，以40mmol/L鹽酸溶解配置成10mmol/L溶液，取5ml上述溶液，加入5ml 20mmol/L三氯化鐵和50ml 0.3mmol/L的醋酸緩沖液（pH3.6）混合即得。

2.3.2 FeSO4標準曲線的繪制 分別取不同濃度的FeSO4 溶液100μl，分別加入6.0ml“2.3.1”項下配制的TPTZ溶液，于37℃水浴加熱30min后，用紫外可見分光光度計于596nm處測定其吸光度。以FeSO4的質(zhì)量濃度（mmol/g）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=0.186x+0.012（r=0.9993）。

2.3.3 樣品抗氧化能力的測定 準確吸取“2.2”項下樺樹皮乙醇溶液100μl，加入6.0ml“2.3.1”項下配制的TPTZ溶液，于37℃水浴加熱30min后，用紫外可見分光光度計于596nm處測定其吸光度。將吸光度代入“2.3.2”項下的回歸方程計算其FRAP值，F(xiàn)RAP值表示為每克該供試品消耗的Fe2+毫摩爾數(shù)（mmol/g）。

3 結(jié)果與討論

3.1 對DPPH自由基的清除作用 以VC和BHT為對照，分別測出樺樹皮一系列不同濃度提取物吸光度A1，A2，A3，根據(jù)公式計算相應(yīng)的自由基清除率，以清除率為縱坐標，以質(zhì)量濃度（mg/ml）為橫坐標，結(jié)果見圖1。從圖1可看出，隨著樺樹皮提取物濃度的增加，自由基清除率也相應(yīng)增加，且增長的趨勢由快變慢。從初期提取物濃度的增加，清除的DPPH自由基也越來越多，之后供試品溶液逐漸達到飽和狀態(tài)，清除率的增長也逐漸趨于緩慢。

計算供試品及對照品的IC50，結(jié)果樺樹皮甲醇提取物（以甲醇提取物的濃度計）、BHT和VC的IC50分別為0.43、0.09、0.21mg/ml。

3.2.2 FRAP法測定 以FeSO4為對照品確定還原能力的回歸方程為y=0.186x+0.012（r=0.9993）。將樺樹皮甲醇提取物（以甲醇提取物的濃度計）、BHT和VC分別測定吸光度并代入回歸方程，測得三種溶液的FRAP值分別為1.54±0.012、4.54±0.028.、5.76±0.041mmol/g。

由上述實驗可知，樺樹皮甲醇提取物對DPPH自由基有良好的清除作用，對鐵離子的還原性較強，具有良好的抗氧化活性。

參考文獻

[1]李敬芬，王旭，周淑晶.樺樹皮化學成分研究[J].中藥材，1998，21（2 ）：83-85.

[2]Qisi Lin， Ling Zhang， Dongzhi Yang. Contribution of Phenolics and Essential Oils to the Antioxidant and Antimicrobial Properties of Disporopsis Pernyi （Hua） Diels[J]. Journal of Medicinal Food， 2014，17（6）：714-722.

[3]Qisi Lin， Miao Wang， Jinghua Li， et al.Studies of Antioxidant and Antimicrobial Activities for Recineckea Carnea and Tupistra Chinensis from the Guizhou Province[J]. Journal of Medicinal Food，2014，17（2）：236-243.

[4]Aruoma， O. I.. Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods[J]. Mutation Research， Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis， 2003， （523-524）： 9-20.

[5]楊錦華，李博，籍保平. 我國常見食用和藥用植物的抗氧化性研究[J].食品科學， 2006，27（6）：87-91.

（收稿日期：2015.09.22）