去甲萬古霉素生產(chǎn)菌株Amycolatopsisorientalis遺傳操作體系的建立

趙 穎， 戴 夢， 章 麗， 張雪霞

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

去甲萬古霉素生產(chǎn)菌株Amycolatopsisorientalis遺傳操作體系的建立

趙 穎， 戴 夢， 章 麗， 張雪霞*

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

為了對去甲萬古霉素高產(chǎn)菌中的功能基因進行研究，以整合型pZMW為載體，考察了去甲萬古霉素生產(chǎn)菌東方擬無枝酸菌屬間接合轉(zhuǎn)移限制因素，優(yōu)化3個關(guān)鍵限制因素：產(chǎn)孢培養(yǎng)基為YD，起始孢子量控制在1×108～4×108/反應，抗生素覆蓋時間為16～17 h為宜。建立了東方擬無枝酸菌生產(chǎn)菌株NCPC 2-48的操作方法和培養(yǎng)條件，使體內(nèi)分析該菌的生物合成及調(diào)控基因的功能成為可能，并為建立其他放線菌遺傳操作體系提供了參考。

去甲萬古霉素；東方擬無枝酸菌；接合轉(zhuǎn)移；整合

去甲萬古霉素(Norvancomycin)是由東方擬無枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種糖肽類抗生素，為華北制藥自主研發(fā)品種。去甲萬古霉素與萬古霉素結(jié)構(gòu)類似，作用于細菌細胞壁，與粘肽的側(cè)鏈形成復合物，從而抑制細胞壁的合成，對各種革蘭陽性球菌與桿菌均具強大抗菌活性，尤其對甲氧西林耐藥菌極其有效，是目前治療由甲氧西林耐藥菌引起嚴重感染的主要藥物[1]。作為糖肽類的去甲萬古霉素結(jié)構(gòu)復雜，化學合成具有極大的難度，微生物發(fā)酵有不可替代的優(yōu)勢。菌種的優(yōu)化在微生物制藥領(lǐng)域是永恒不變的話題，而傳統(tǒng)育種有耗時、耗力、正突變低等弊端。針對生物合成基因及其調(diào)控基因開展多表達、敲除、突變等一系列操作，不但可以增加天然產(chǎn)物的產(chǎn)量，定向積累某種化合物，還可以對天然產(chǎn)物進行定向改造，為藥物發(fā)現(xiàn)開辟一條新的途經(jīng)[2-3]。本研究對去甲萬古霉素高產(chǎn)菌接合轉(zhuǎn)移方法進行了詳細的摸索及優(yōu)化，初步建立了穩(wěn)定的遺傳操作體系，為次級代謝中生物合成基因及調(diào)控基因的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒 ET12567(pUZ8002)為接合轉(zhuǎn)移供體菌，東方擬無枝酸菌NCPC 2-48為受體菌，以上均為本實驗室保存。pZMW是在pSET152質(zhì)粒的基礎(chǔ)上添加了紅霉素的強啟動子，攜帶阿泊拉霉素抗性基因，含噬菌體φC31-attP整合位點，可以特異性地整合到鏈霉菌中，由張部昌博士惠贈[4]。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 ①LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g，酵母抽提物 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水至1 000 mL[5]； ②2×YT培養(yǎng)基：蛋白胨 16 g，酵母提取物 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水至1 000 mL[5]；③MS培養(yǎng)基：黃豆粉 20 g，甘露醇 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水至1 000 mL[5]；④2CMY培養(yǎng)基： 可溶性淀粉 10 g，蛋白胨 2 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，硫酸銨 2 g，碳酸鈣 2 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL;⑤YD培養(yǎng)基： 酵母抽提物 4 g， 麥芽糖 10 g，葡萄糖 4 g，MgCl22 g，CaCl21.5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL， pH 7.2;⑥瓦氏肉汁瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，牛肉膏10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL;⑦YEME培養(yǎng)基：酵母提取物 3 g， 蛋白胨 5 g，麥芽提取物3 g，葡萄糖 10 g；蔗糖 340 g，蒸餾水至1 000 mL，滅菌條件115 ℃，15 min;⑧TSBY培養(yǎng)基： TSB 30 g，蔗糖 340 g，酵母抽提物 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水至1 000 mL;⑨YMB培養(yǎng)基：K2HPO40.5 g，MgSO420 g，NaCl 0.1 g，甘露醇 10 g，酵母提取物 0.4 g，蒸餾水至1 000 mL，pH 7.0[6];⑩斜面培養(yǎng)基： 葡萄糖 30 g，蛋白胨 5 g，NaCl 2.5 g ，豌豆浸液 10 g ，瓊脂 18 g，加水至1 000 mL[7]。

1.1.3 試劑及儀器 ExTaq酶、DNA Marker購自TaKaRa公司；阿泊拉霉素購自Sigma公司，純度95%；萘啶酮酸、硫鏈絲菌素、卡那霉素、氯霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司，純度均>97%；酵母抽提物、蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；麥芽提取物、TSB為BD公司產(chǎn)品；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純試劑。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR儀為PE公司9600，電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品，成像系統(tǒng)為富士LAS 3000。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)孢培養(yǎng) 共嘗試5種產(chǎn)孢培養(yǎng)基：2CMY、YEME、TSBY、YD、瓦氏肉汁瓊脂培養(yǎng)基。將斜面生長的孢子用水洗下，玻璃珠打散，過濾除掉未打散的孢子及菌絲，血球計數(shù)板計數(shù)，用水稀釋至103個/mL，取50 μL單孢子液均勻涂布于以上5種固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 東方擬無枝酸菌抗生素敏感性實驗 針對常用的接合轉(zhuǎn)移抗生素篩選壓力，分別考察東方擬無枝酸菌對阿泊拉霉素(Apramycin)和硫鏈絲菌素(Thiostrepton)的耐受情況。將阿泊拉霉素和硫鏈絲菌素按0、25、50、75、100 μg/mL的質(zhì)量濃度加入45 ℃左右的MS培養(yǎng)基中倒平板，凝固后均勻涂布約含1×108個單孢子懸液，28 ℃培養(yǎng)7～10 d。

1.2.3 接合轉(zhuǎn)移實驗 東方擬無枝酸菌菌株在YD固體平板中培養(yǎng)5～7 d，無菌棉簽洗下表面孢子，用含10個玻璃珠的無菌水三角錐瓶打散，過濾吸管過濾以除去未打散的孢子團及菌絲體，稀釋后血球計數(shù)板計數(shù)，取1×108個/反應的孢子分裝至1.5 mL Ep管中(如果用20%甘油打散的孢子可凍存于-20 ℃?zhèn)溆?。40、45、50 ℃下分別熱激10 min和20 min，作為接合轉(zhuǎn)移的受體菌。供體菌E.coliET12567/pUZ8002/pZMW在50 mL含25 mg/L卡那霉素，25 mg/L氯霉素和50 mg/L阿泊拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃生長至OD600值約為0.4～0.6時，離心收集菌體，用LB清洗菌體2～3遍除去抗生素，重懸于5 mL LB培養(yǎng)基中，作為接合轉(zhuǎn)移的供體菌。將上述受體菌和5 μL供體菌混合均勻，離心，去適量上清后重懸涂布于含10 mmol/L MgCl2的MS固體培養(yǎng)基上，吹干后，置于28 ℃培養(yǎng)約17 h。用1 mL含25 mg/L萘啶酮酸和25～100 μg/mL阿泊拉霉素的無菌水覆蓋，輕搖平皿使溶液分布均勻，置于28 ℃培養(yǎng)7 d后觀察。待長出單菌落后，用牙簽將菌落轉(zhuǎn)移至含相同量萘啶酮酸和阿泊拉霉素的MS固體平板上復篩。再次長出的菌落在斜面上涂布均勻，待用。

1.2.4 接合轉(zhuǎn)移中熱激條件的考察 在接合轉(zhuǎn)移實驗初步建立后考察3個溫度：40、45、50 ℃，分別熱激10 min和20 min。28 ℃培養(yǎng)5～7 d后觀察。

1.2.5 陽性接合子的鑒定 接合子及出發(fā)菌株用YMB培養(yǎng)基搖培3～4 d，用微波法[8]快速提取基因組DNA。用Am-1/Am-2引物對提取的基因組DNA進行PCR驗證。PCR引物：Am-1 5′-gtg caa tac gaa tgg cga-3′，Am-2 5′-cag cca atc gac tgg cga g-3′。PCR條件反應程序：96 ℃，5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)。取5 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)采集影像。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)孢培養(yǎng)基的選擇

去甲萬古霉素產(chǎn)生菌東方擬無枝酸菌的形態(tài)特征表現(xiàn)為氣生菌絲菌層薄，孢子少[9]。生產(chǎn)菌株在經(jīng)歷了20多年選育后，氣生菌絲及孢子變得更加貧瘠，這給接合轉(zhuǎn)移帶來了較大困難。為了獲得足夠量的孢子進行接合轉(zhuǎn)移實驗，本研究嘗試了5種常用放線菌培養(yǎng)基。

單孢子在2CMY、YEME、TSBY、YD、瓦氏肉汁瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后觀察，該菌在這5種培養(yǎng)基上的形態(tài)差異較大，菌落形態(tài)見圖1。其中YEME、TSBY、2CMY平板上呈現(xiàn)扁平片狀菌落，且沒有孢子產(chǎn)生。YD、瓦氏肉汁瓊脂培養(yǎng)基上呈花形，有灰白色孢子，經(jīng)過活計數(shù)顯示YD培養(yǎng)基孢子量最豐富，一支YD斜面孢子量可達到1.5×109個，而瓦氏肉汁瓊脂培養(yǎng)基只能達到2.6×107個。最終確定YD培養(yǎng)基為產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

圖1 不同產(chǎn)孢培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 The colonial morphology of different media to spores culture

2.2 抗生素敏感性實驗

為了確定接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒適合的抗生素篩選標記，首先對東方擬無枝酸菌進行了抗生素敏感實驗。在含常用的阿泊拉霉素或硫鏈絲菌素抗生素平板上涂布了接合轉(zhuǎn)移等量的孢子量，結(jié)果見表1。

表1 東方擬無枝酸菌抗生素敏感性實驗

東方擬無枝酸菌對硫鏈絲菌素不敏感，且有波動。而對阿泊拉霉素有較為穩(wěn)定的敏感度，50 mg/L只有1個菌落長出。確定質(zhì)粒的抗性篩選標記為阿泊拉霉素，使用濃度為50 mg/L。

2.3 孢子濃度

東方擬無枝酸菌對孢子濃度較為敏感，適量孢子濃度可以順利地獲得接合子。而該菌的孢子很小，計數(shù)困難，給孢子濃度的考察帶來一定難度。經(jīng)多次實驗，按1×108～4×108/反應的孢子濃度較為適宜，過多則會產(chǎn)生連片的菌苔干擾接合子的挑選，過少則沒有接合子長出。

2.4 熱激條件的確定

適度的熱激更有利于接合轉(zhuǎn)移的順利進行。在控制孢子量的前提下，考察了40、45、50 ℃三個溫度，分別熱激10 min和20 min，結(jié)果均有接合子長出。從接合子的生長情況來看，20 min熱激時間普遍比10 min好，但3個溫度差異不顯著，由此可見熱激溫度在該菌的接合轉(zhuǎn)移中并不是關(guān)鍵點，暫定40 ℃熱激20 min。

2.5 阿泊拉霉素抗性覆蓋時間

如果用抗生素作為篩選壓力，則抗性覆蓋時間很重要。覆蓋過早，則接合轉(zhuǎn)移不完全，抗性基因未得到充分表達，最終沒有接合子長出；覆蓋過晚，假陽性菌落較多，干擾接合子的篩選。東方擬無枝酸菌的正常菌落形態(tài)是不規(guī)則的花形，不像很多鏈霉菌菌落形態(tài)規(guī)則，大小均一。經(jīng)反復實驗，該菌的抗性覆蓋時間應該在16～17 h為宜，超過17 h則會有片狀菌苔出現(xiàn)，嚴重影響正常接合子的生長。

2.6 接合子的獲得及鑒定

pZMW為整合型載體，進入鏈霉菌體內(nèi)不能自主復制，需要整合至宿主菌基因組上。因此，如果在覆蓋阿泊拉霉素后長出的單菌落，繼續(xù)在含阿泊拉霉素及萘定酮酸平皿上復篩，再次長出的正常菌落可以初步認為是陽性接合子。

以徐平等[8]用微波法簡便、快速提取放線菌菌落基因組DNA作為本文優(yōu)選的實驗方案。液體培養(yǎng)收獲菌絲，利用微波法提取基因組。用一對Am抗性引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。

圖2 接合子的鑒定Fig.2 PCR confirmation of conjugonsM：λDNA/HindIII；1：A. orientalis NCPC 2-48基因組；2：pZMW質(zhì)粒；3～10：pZMW不同接合子M: λDNA/HindIII；1: A. orientalis NCPC 2-48 genomic；2: pZMW plasmid；3-10: conjugons of pZMW

3 討 論

接合轉(zhuǎn)移方法是屬間基因轉(zhuǎn)移方法，被廣泛應用于鏈霉菌中[10]，越來越多的放線菌成功建立了接合轉(zhuǎn)移遺傳操作體系[11-13]，極大地方便了次級代謝相關(guān)的生物合成基因及調(diào)控基因的深入研究。

早在1987年由Matsushima P建立了原生質(zhì)體方法，成功地將pIJ702導入萬古霉素產(chǎn)生菌A.orientalisATCC 19795中[14]。2005年，賈素娟等[15]運用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法成功建立了A.orientalis的DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，隨后李航等[16]提到運用接合轉(zhuǎn)移的方法在A.orientalis中成功敲除了vcm14基因，但是文中并未詳細描述接合轉(zhuǎn)移實驗過程。A.orientalisNCPC 2-48是華北制藥廠去甲萬古霉素的生產(chǎn)菌，經(jīng)過多年馴化培養(yǎng)，該菌與低產(chǎn)菌相比在氣生菌絲、產(chǎn)孢能力、發(fā)酵菌絲形態(tài)、培養(yǎng)特性等方面發(fā)生了很大改變。本實驗室欲運用合成生物學理念對生產(chǎn)菌株進行遺傳改造，以期獲得高產(chǎn)量、低雜質(zhì)的工程菌。用傳統(tǒng)的接合轉(zhuǎn)移方法屢次未獲得穩(wěn)定的接合子，或出現(xiàn)成片菌苔，或沒有接合子長出，而且有菌苔出現(xiàn)時，假陽性接合子較多，干擾正常接合子的挑選。本研究通過系統(tǒng)地研究該菌的接合轉(zhuǎn)移條件，建立并優(yōu)化了大腸埃希菌/去甲萬古霉素高產(chǎn)菌的屬間接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

本研究對幾個實驗點嚴格控制，經(jīng)過多次試驗終于找到關(guān)鍵影響因素：產(chǎn)孢培養(yǎng)基、每個反應的孢子量、抗性覆蓋時間。這三個關(guān)鍵點嚴格控制后，每反應可以收獲20 個左右的接合子，接合轉(zhuǎn)移效率大大提高，針對高產(chǎn)菌成功建立了高效、操作簡便的遺傳操作系統(tǒng)，使定向改造基因，提高基因的表達水平和菌種的生產(chǎn)能力，獲得高產(chǎn)出或低雜質(zhì)的工程菌株等成為可能，為該菌的次級代謝合成及調(diào)控機制的探索提供參考。

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The Establishment of Genetic Manipulation System for Norvancomycin Producing StrainAmycolatopsisorientalis

ZHAO Ying, DAI Meng, ZHANG Li, ZHANG Xue-xia

(NewDrugRes. &Devel’tCo.Ltd.,N.ChinaPharm.Co.,Nat’lEngin.Res.Ctr.ofMicrob.Med.,HebeiIndust.Microb.MetabolicEngin. &Technol.Res.Ctr.,Shijiazhuang050015)

In order to study the functional genes inAmycolatopsisorientalis, the key constraints factors of conjugation fromE.colitoA.orientaliswere studied by the integrative plasmid pZMW. Three key restricted factors were optimized: YD spore-producing medium, preliminary spore amount was controlled at 1×108～4×108/reaction, incubation time before covered by antibiotics at suitable at 16～17 hours. A genetic manipulation system for the industrial strainA.orientalisNCPC 2-48 was developed which would make the analysis of the functions of biosynthetic and regulation genes of the straininvivopossible, and provided references for the establishment of the genetic manipulation system of the other Actinomycetes.

norvancomycin;Amycolatopsisorientalis; conjugation transferring; integration

國家科技重大專項(2014ZX09201001-004)

趙穎 女，高級工程師。主要從事工業(yè)微生物遺傳育種工作。E-mail：zhaoyingxx@163.com

2016-01-26；

2016-03-03

Q93

A

1005-7021(2016)06-0035-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.006

* 通訊作者。女，正高級工程師，碩士生導師。研究方向為天然藥物與微生物制藥。Tel：0311-85992995，

E-mail：zhangxuexiazxx@163.com