纖維素降解真菌DF14101的篩選與鑒定

鄒瀟瀟， 易子霆,2， 孫前光, 鮑時(shí)翔, 黃惠琴*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？?571101；2.海南大學(xué) 環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228)

纖維素降解真菌DF14101的篩選與鑒定

鄒瀟瀟1， 易子霆1,2， 孫前光1, 鮑時(shí)翔1, 黃惠琴1*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海南 海口 571101；2.海南大學(xué) 環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228)

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是人類寶貴的天然可再生資源之一。由于纖維素不易降解，嚴(yán)重限制了生物質(zhì)廢棄物中纖維素的有效利用。從?？?、儋州、屯昌市郊的森林、農(nóng)田以及香蕉園采集土壤和腐爛秸稈樣品中，篩選獲得1株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的真菌DF14101。在以香蕉秸稈粉為碳源的培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d時(shí)，該菌株發(fā)酵液的內(nèi)切葡聚糖酶酶活(CMCase)為43.98 U/mL，濾紙酶活(FPA)為14.05 U/mL。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將該菌株鑒定為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。

纖維素酶；篩選；鑒定；草酸青霉

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，自然界每年通過(guò)光合作用合成的纖維素超過(guò)1 000億t[1]，是人類寶貴的天然可再生資源之一。但由于纖維素的理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，自然條件下難以降解，嚴(yán)重限制了生物質(zhì)廢棄物中纖維素的有效利用。纖維素由吡喃型D-葡萄糖以β-1, 4糖苷鍵結(jié)合而成。纖維素酶是降解β-1, 4-糖苷鍵的酶類的總稱，包括內(nèi)切葡聚糖水解酶、外切葡聚糖水解酶和β-葡萄糖苷酶等組分[2-3]。纖維素酶來(lái)源廣泛，自然界中的細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物都具有產(chǎn)生纖維素酶的種類[4]。相對(duì)于細(xì)菌和放線菌，真菌具有生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)纖維素酶活性高、酶系組成全面等優(yōu)點(diǎn)，而且在生長(zhǎng)過(guò)程中真菌菌絲的穿透作用會(huì)對(duì)作物秸稈造成機(jī)械破壞效果；同時(shí)，真菌還可以分泌大量胞外酶降解纖維素，這些特性使得產(chǎn)纖維素酶真菌被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。海南省位于我國(guó)最南端，屬熱帶季風(fēng)性氣候，常夏無(wú)冬，光照充足，雨量充沛。特殊的熱帶生態(tài)環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，其中不乏產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)的微生物。此外，海南省也是我國(guó)高效農(nóng)業(yè)和海洋生產(chǎn)大省，每年產(chǎn)生的農(nóng)作物和大型海藻類生物質(zhì)廢棄物數(shù)量相當(dāng)可觀，這些都是纖維素的寶貴來(lái)源。但長(zhǎng)期以來(lái)，大量的農(nóng)業(yè)廢棄物和海藻藻體廢棄物多以焚燒或堆積于田間、灘頭的方式進(jìn)行處理，不僅對(duì)周邊環(huán)境造成了污染，也是資源的極大浪費(fèi)。如果可以提高纖維素的降解效率，不但可以解決環(huán)境污染問(wèn)題，還有利于改善農(nóng)村生態(tài)環(huán)境、增加農(nóng)民收入，具有良好的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)效益。因此，本研究旨在從海南豐富的熱帶微生物資源中篩選出產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)的真菌，為纖維素的可再生利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 從?？?、儋州、屯昌市郊的森林、農(nóng)田以及香蕉園采集土壤和腐爛秸稈，置于潔凈塑料袋，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離，剩余樣品置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)瓊脂培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 20.0 g，pH 7.2，瓊脂20.0 g ，蒸餾水1 000 mL。加入青霉素、鏈霉素使終濃度為100 U/mL，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，便于真菌分離。濾紙條培養(yǎng)基：(NH4)2SO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 1.7 g，NaCl 0.5 g，蒸餾水1 000 mL。向試管中加入培養(yǎng)基5 mL，并垂直放入瓦特曼濾紙(6 cm×1 cm)，部分露出液面。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：香蕉秸稈粉 30 g，(NH4)2SO41.4 g，KH2PO42.0 g，CO(NH2)20.3 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 mg，ZnSO4·7H2O 1.4 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，CoCl22.0 mg，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL。PDA培養(yǎng)基：稱取200 g去皮的馬鈴薯切塊，加水煮沸20～30 min，過(guò)濾，定容至1 000 mL，加入葡萄糖 20 g，瓊脂20 g。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌株的初步篩選 稱取樣品5 g，磨碎后加入45 mL滅菌水，充分震蕩20 min，制備成樣品原液。梯度稀釋后涂布于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)瓊脂平板，28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。挑取生長(zhǎng)快、菌落形態(tài)不同的真菌進(jìn)行劃線純化后，點(diǎn)接到新的CMC-Na瓊脂平板，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，用0.1%剛果紅染液對(duì)培養(yǎng)平板染色，再用1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行脫色[5]，測(cè)量并計(jì)算透明水解圈與菌落直徑比值(Hc)。同時(shí)將菌株接種到放置于濾紙條培養(yǎng)基中的濾紙條上(露在上面部分)，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，觀察濾紙條的潰爛程度。選擇透明水解圈/菌落直徑比大、濾紙潰爛程度高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的復(fù)篩 將初篩得到的活性菌株接種到以香蕉秸稈粉為碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%。180 r/min、28 ℃培養(yǎng)5 d后，取發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，測(cè)上清液(初酶液)的羧甲基纖維素(CMC)酶活、濾紙纖維素(FPA)酶活[6]。①羧甲基纖維素(CMC)酶活的測(cè)定：取0.5 mL粗酶液，加入2 mL 1% CMC溶液(溶于pH 6.8 磷酸鹽緩沖液)，50 ℃恒溫水浴60 min。加入1.5 mL DNS試劑，混合均勻，置于沸水浴中加熱10 min。冷卻后用蒸餾水稀釋至25 mL。空白對(duì)照測(cè)定時(shí)，取0.5 mL粗酶液，先加DNS試劑1.5 mL，后加2 mL 1%CMC溶液，其余步驟相同。540 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，測(cè)量3次取平均值。②濾紙纖維素(FPA)酶活的測(cè)定：取0.5 mL粗酶液，在試管中加入2 mL pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和1條1.0 cm×6.0 cm去淀粉處理的定性濾紙，50 ℃恒溫水浴60 min。加入1.5 mL DNS試劑，混合均勻，置于沸水浴中加熱10 min。冷卻后用蒸餾水稀釋至25 mL。空白對(duì)照測(cè)定時(shí)，取0.5 mL粗酶液，先加DNS試劑1.5 mL，再加2 mL pH 6.8磷酸鹽緩沖液和定性濾紙，其余步驟同上。540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，測(cè)量3次取平均值。酶活定義：在反應(yīng)溫度50 ℃、pH 4.8的條件下，1 mL酶液在1 min內(nèi)使底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需酶量定義為一個(gè)酶活單位(U/mL)。

1.2.3 真菌菌株降解香蕉秸稈實(shí)驗(yàn) 將真菌菌株接種于以香蕉秸稈為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量2%，搖瓶培養(yǎng)16 d，稱取殘留物質(zhì)干重，并計(jì)算測(cè)量香蕉秸稈干重的失重率：失重率(%)=(Mck-M)/M×100%，其中，Mck：對(duì)照發(fā)酵后香蕉秸稈干重(g)；M：處理的樣品發(fā)酵后香蕉秸稈干重(g)。

1.2.4 菌株分類鑒定 ①形態(tài)鑒定:將菌株點(diǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。待菌株產(chǎn)孢后挑取菌體于載玻片上，用棉蘭染液染色后置于顯微鏡下觀察。菌株形態(tài)鑒定參照文獻(xiàn)[7-8]提供的方法進(jìn)行。②ITS序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析：利用TIANGEN公司的基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以提取的DNA為模板，擴(kuò)增菌株的ITS序列，引物為Pf(5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)、Pr(5′-CGACGGGCGGTGTGTAC-3′)[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格樣品送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得序列于NC-BI中進(jìn)行BLAST比對(duì)(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)，選取同源性高的菌株序列利用Clustal X2.1進(jìn)行多序列比對(duì)，在MEGA 5.0軟件中采用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

利用CMC-Na固體培養(yǎng)基從采集的樣品中分離到104株具有纖維素降解能力的真菌，其中40株透明水解圈/菌落直徑(Hc)在1.30～2.85之間，相對(duì)酶活較高，用于進(jìn)一步液體發(fā)酵產(chǎn)酶復(fù)篩。通過(guò)液體產(chǎn)酶復(fù)篩獲得5株FPA、CMC酶活較高的真菌(表1)。其中，菌株DF14101的兩種酶活力均較高，其發(fā)酵液的CMC酶活力為43.98 U/mL、FPA酶活力為14.05 U/mL。觀察濾紙條降解情況，發(fā)現(xiàn)濾紙條被折斷，降解程度較高。

表1 菌株發(fā)酵液纖維素酶活力

2.2 菌株DF14101降解秸稈能力測(cè)試

通過(guò)產(chǎn)纖維素酶真菌的初篩和復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)菌株DF14101產(chǎn)CMC和FPA酶能力均較強(qiáng)，為進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株降解秸稈的能力，將菌株DF14101接種到以香蕉秸稈為唯一碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)16 d，測(cè)量香蕉秸稈干重的失重率。以未接種產(chǎn)纖維素能力的菌株為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株DF14101發(fā)酵后，香蕉秸稈干重的失重率達(dá)29.18%(表2)，說(shuō)明該菌株具有較好的秸稈降解的能力。

表2 降解秸稈實(shí)驗(yàn)

2.3 菌株DF14101的分類鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 菌株DF14101在蛋白質(zhì)、PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，初生菌絲白色，菌落藍(lán)綠色，培養(yǎng)后期有水滴滲出，大量產(chǎn)孢，無(wú)可溶性色素。帚狀枝單輪生，較緊密；分生孢子橢圓形、鏈狀(圖1)。根據(jù)菌落特征和顯微結(jié)構(gòu)特征，初步鑒定DF14101隸屬于半知菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科、青霉屬。

圖1 菌株DF14101的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)Fig.1 Sporogenous structure of strain DF14101

2.3.2 ITS序列測(cè)定及其系統(tǒng)發(fā)育分析 通過(guò)測(cè)序獲得菌株DF14101的ITS序列為533 bp，將所得ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果顯示，與菌株同源性高的菌株均為青霉屬，與PenicilliumoxalicumB7(JN676114)同源性最高，ITS序列相似性達(dá)100%。選擇同源性較高的相關(guān)菌株在MEGA5.0中利用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，菌株DF14101與P.oxalicum的菌株處在同一分支，表明它們的親緣關(guān)系最近。對(duì)菌株DF14101與P.oxalicumB7的形態(tài)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們的特征基本一致：菌絲、分生孢子梗有橫隔，光滑，基部無(wú)足細(xì)胞，頂端不形成膨大的頂囊，分生孢子梗不對(duì)稱分支、掃帚狀，分生孢子橢圓形，光滑。因此，結(jié)合菌株形態(tài)特征和ITS系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株DF14101為Penicilliumoxalicum(草酸青霉)。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的DF14101菌株與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of stain DF14101 and related strains based on ITS sequences

3 討 論

纖維素酶來(lái)源廣泛，自然界中很多微生物都能產(chǎn)生纖維素酶。雖然從各種自然環(huán)境中分離到了大量的產(chǎn)纖維素微生物，但它們普遍酶活力低，酶系組成不全，不能用于工業(yè)生產(chǎn)[11]。因而，產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選是生物法降解纖維素的首要問(wèn)題。透明水解圈法是分離纖維素菌株的常用方法[12-13]，產(chǎn)酶愈多，透明水解圈愈大；產(chǎn)酶越快，透明水解圈出現(xiàn)越早。該方法因觀察方便而得到廣泛應(yīng)用。本研究中首先用CMC-Na固體培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)纖維素酶真菌進(jìn)行快速篩選，結(jié)合透明水解圈法測(cè)定了各菌株纖維素酶的相對(duì)酶活，為避免漏掉那些產(chǎn)酶量小但酶活高的菌株，實(shí)驗(yàn)中還測(cè)定了菌株對(duì)濾紙條的降解率，結(jié)合兩種方法篩選到40株相對(duì)酶活較高的菌株。通過(guò)液體發(fā)酵對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行復(fù)篩，獲得了最優(yōu)菌株DF14101。

傳統(tǒng)的真菌鑒定以形態(tài)鑒定為主，但由于形態(tài)描述具有主觀性，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不同培養(yǎng)條件對(duì)真菌形態(tài)也有影響，對(duì)形態(tài)鑒定造成了一定的困擾。因此，研究者在形態(tài)鑒定的同時(shí)，又引入了分子鑒定的手段。本研究結(jié)合形態(tài)鑒定和分子鑒定兩種手段，將菌株DF14101鑒定為草酸青霉。

目前廣泛應(yīng)用的產(chǎn)纖維素酶真菌有木霉(Trichderm)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、根霉(Rhizopus)等[4]。其中，里氏木霉(Trichodermareesei)因具有產(chǎn)生大量纖維素酶的能力而得到廣泛地研究和應(yīng)用[14]，但其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的活力很低，限制了其對(duì)纖維素的降解效率。研究發(fā)現(xiàn)，青霉能分泌較全的降解纖維素的聚糖酶系。與木霉相比，青霉能產(chǎn)生較多的β-葡萄糖苷酶，且其生長(zhǎng)速度也比木霉快[15-16]，因而青霉具有明顯的商業(yè)價(jià)值和應(yīng)用潛力。當(dāng)前研究較多的降解纖維素青霉有斜臥青霉(P.decumbens)、繩狀青霉(P.funiculosum)和微紫青霉(P.janthinellum)等[17-20]，但是對(duì)草酸青霉的研究報(bào)道很少。因此，本研究篩選和鑒定出的草酸青霉高活性產(chǎn)纖維素酶菌株，為農(nóng)業(yè)生物質(zhì)廢棄物和大型海藻中纖維素的有效降解提供了新的菌種資源。

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歡迎訂閱《微生物學(xué)雜志》

Screening and Identification of a Cellulose-Degrading Fungus DF14101

ZOU Xiao-xiao1, YI Zi-ting1, 2, SUN Qian-guang1, BAO Shi-xiang1, HUANG Hui-qin1

(1.Inst.ofTropicalBiosci. &Biotech.,CATAS,Haikou,Hainan571101; 2.Coll.ofEnviron’t&PlantProtect.,HainanUni.,Haikou,Hainan570228)

Cellulose is the major ingredient of plants’ cell walls, and is one of the valuable natural renewable resources for human beings. The difficulty of cellulose degradation severely limits the effective utilization of bio-waste. Adding cellulolytic microorganism during the composting process of plant stalks, can effectively improve degradation rate of fibers. Strain DF14101 with cellulose degrading capability was screened out from soil and the rotten stalks on CMC-Na agar. The endoglucanase (CMCase) activity and filter paper activity (FPA) of the strain were at 43.98 U/mL and 14.05 U/mL respectively, when cultured in medium with banana stalk powder as a carbon source for five days at 180 r/min and 28 ℃. Combined with the results of morphological characteristics with phylogenetic analysis based on ITS sequences, strain DF14101 was identified asPenicilliumoxalicum.

cellulase; screening; identification;Penicilliumoxalicum

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303094)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(2014050402)；海南省科技興海專項(xiàng)(XH201408)；

鄒瀟瀟 女，博士。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源應(yīng)用研究。E-mail:zouxiaoxiao@itbb.org.cn

易子霆 男，碩士研究生。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail:648241879@qq.com。前兩位作者為并列第一作者。

2016-02-21；

2016-04-07

Q939

A

1005-7021(2016)06-0068-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.011

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(ITBB2015ZD08，ITBB2015RC07)

* 通訊作者。女，博士，研究員。研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail:huanghq21@163.com