牛蒡子苷對L6骨骼肌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶信號通路的影響

相　芳,魏　瑋，相　紅，王玉蘭，季　蔚，許　諾，萬小梅

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·論著·

牛蒡子苷對L6骨骼肌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶信號通路的影響

相芳1,魏瑋1，相紅2，王玉蘭3，季蔚1，許諾1，萬小梅1

1. 210002江蘇南京，解放軍81醫(yī)院藥劑科；2. 210000江蘇南京，南京軍區(qū)第一干休所；3. 210005江蘇南京，南京軍區(qū)第二干休所

[摘要]目的探討牛蒡子苷在L6骨骼肌細胞中對葡萄糖消耗和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路的調節(jié)作用。方法用含 2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基誘導L6骨骼肌細胞分化，直至細胞生長出肌管，分化完成后的L6骨骼肌細胞用含有不同濃度牛蒡子苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，采用葡萄糖氧化酶法檢測細胞葡萄糖消耗，western blot法檢測AMPK的亞單位AMPKα和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMP-activated protein kinase，p-AMPKα)的蛋白表達水平；以real-time PCR法檢測過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome-proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)mRNA表達水平。結果牛蒡子苷濃度為1000 g/L時，可增加L6骨骼肌細胞的葡萄糖消耗，差異顯著(P<0.01)；與對照組相比，牛蒡子苷呈濃度依賴性的增強L6骨骼肌細胞中p-AMPKα蛋白表達水平；并以相同的趨勢增強PGC-1α mRNA表達水平。結論牛蒡子苷增加L6骨骼肌細胞的葡萄糖消耗，并激活AMPK/PGC-1α信號通路，具有潛在的改善胰島素抵抗的作用。

[關鍵詞]牛蒡子苷；胰島素抵抗；腺苷酸活化蛋白激酶；L6骨骼肌細胞

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球有3.47億人患有糖尿病，預計至2030年糖尿病將成為全球第七大死亡原因，糖尿病患者中約90% 為2型糖尿病(T2DM)[1]。2型糖尿病是以胰島素分泌相對不足和胰島素抵抗(insulin resistance，IR)為特征的代謝綜合征，改善胰島素抵抗是降低血糖和防治糖尿病并發(fā)癥的重要干預措施[2]。肌肉組織是維持葡萄糖內穩(wěn)態(tài)的主要組織，研究表明骨骼肌中葡萄糖轉運減少可以導致機體葡萄糖攝取能力受損，進而導致胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生[3]。因此，促進骨骼肌細胞的葡萄糖轉運是改善胰島素抵抗的重要治療措施。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為細胞的“能量感受器”在葡萄糖轉運中發(fā)揮著重要作用。研究表明，激活AMPK可促進骨骼肌中不依賴胰島素的葡萄糖轉運，增加胰島素敏感性，因此，AMPK途徑是改善胰島素抵抗及治療2型糖尿病的重要靶點[4]。

牛蒡子苷(Arctiin，ARC)是從菊科兩年生草本植物牛蒡屬牛蒡(ArctiumlappaL.)的干燥成熟果實牛蒡子中提取分離的木脂素類化合物[5]，其結構見圖1。大量研究表明牛蒡子苷及其苷元對改善炎癥、抗腫瘤和改善腎病等具有顯著療效[6-8]。本研究通過觀察牛蒡提取物牛蒡子苷對L6骨骼肌細胞中AMPK信號通路的調節(jié)作用，進而研究牛蒡子苷對胰島素抵抗的改善作用。由于哺乳動物的AMPK是一個三聚體結構，由α、β、γ三個亞單位組成，通常研究中所檢測的總AMPK及活性AMPK蛋白是指其α亞單位。本研究即檢測AMPK的亞單位AMPKα和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMP-activated protein kinase，p-AMPKα)的蛋白表達水平，并檢測過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome-proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)mRNA的表達。以探討牛蒡子苷在L6骨骼肌細胞中對葡萄糖消耗和AMPK信號通路的調節(jié)作用。

1材料與方法

1.1主要試劑牛蒡子苷為四川省維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品(批號：150821，純度：>98%)。1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清和青霉素鏈霉素混合液購自美國Hyclone公司；葡萄糖檢測試劑盒購自普利萊基因技術有限公司； Trizol試劑購自美國Invitrogen 公司；Takara逆轉錄試劑盒和PCR引物購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Supermix試劑盒購自美國Bio-Rad公司；熒光定量 PCR儀購自美國Bio-Rad公司；AMPK和p-AMPK蛋白含量檢測相關試劑：AMPK α亞型、p-AMPK α亞型(蘇氨酸172位點)和β-actin抗體購自美國CST公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2小鼠L6細胞小鼠L6骨骼肌細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)。

1.3L6細胞培養(yǎng)及誘導分化L6骨骼肌細胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加青霉素100 U/mL及 鏈霉素100 U/mL。待細胞生長至70%～80%融合時，換為含 2%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進行誘導分化，每隔2 d換液，直至細胞生長出肌管，培養(yǎng)6 d。分化完成后的L6骨骼肌細胞在含有不同濃度牛蒡子苷的無血清1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后進行葡萄糖消耗檢測及蛋白和RNA提取。

1.4葡萄糖消耗分析將96孔板中分化完成的L6骨骼肌細胞分別用濃度為1000、100、10、及0 g/L(對照組)的牛蒡子苷溶液適量處理24 h后，采用葡萄糖氧化酶法檢測各孔培養(yǎng)基中葡萄糖量，用不含細胞的孔內培養(yǎng)基中葡萄糖量均值減去各組培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基中剩余葡萄糖量，即為每孔細胞葡萄糖消耗量。

1.5Western Blot法檢測細胞蛋白表達水平收集加藥處理24 h后的細胞，按照說明書操作，提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg細胞蛋白提取液，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。用含0.1%吐溫20的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液(TBST)洗膜3×5 min。再加HRP標記的二抗室溫孵育1 h，Tris-HCl緩沖溶液洗滌后按照說明書操作顯色。以β-actin作為內參，采用Quantity One軟件對Western Blot條帶進行分析。

1.6實時熒光PCR檢測PGC-1α mRNA表達水平按照Trizol試劑盒說明書進行提取細胞總RNA，每個樣品取1 g RNA按照Takara逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。使用Bio-Rad熒光定量PCR儀檢測各目的基因mRNA表達水平。GAPDH上游引物5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物5′-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-3′；PGC-1α上游引物5′-GCCCGGTACAGTGAGTGTTC-3′，下游引物5′-CTGGGCCGTTTAGTCTTCCT-3′[由寶生物工程(大連)有限公司提供]；擴增條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 15 s；65～95 ℃，每升高0.5攝氏度保持10 s；共40個循環(huán)。反應完畢后，根據(jù)循環(huán)數(shù)(Ct 值)對所有基因的表達進行數(shù)據(jù)分析。

2結果

2.1牛蒡子苷增加L6骨骼肌細胞中葡萄糖消耗葡萄糖消耗是檢測細胞葡萄糖攝取能力的常用指標。如圖2所示，牛蒡子苷可以促進L6骨骼肌細胞的葡萄糖消耗，當牛蒡子苷濃度為1000 g/L時，葡萄糖消耗量為對照組的1.8倍。

2.2牛蒡子苷增強L6骨骼肌細胞AMPK蛋白磷酸化水平如圖3所示，牛蒡子苷對AMPKα蛋白表達沒有明顯影響，但牛蒡子苷呈濃度依賴型增強p-AMPKα蛋白表達。

2.3牛蒡子苷增強L6骨骼肌細胞PGC-1α mRNA表達水平PGC-1α是AMPK的下游效應分子，參與調控線粒體功能和生物發(fā)生，并影響胰島素抵抗[9]。如圖4所示，分別用不同濃度的牛蒡子苷處理分化完成的L6細胞24 h后，與對照組相比，牛蒡子苷各處理組的PGC-1α mRNA表達水平顯著升高，并且這種作用隨著牛蒡子苷給藥濃度增加而增強。

3討論

AMPK在維持內環(huán)境能量穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的調節(jié)作用，被稱為“細胞能量調節(jié)器”。在探求新型作用分子來治愈2型糖尿病的過程中，AMPK作為一個創(chuàng)新性的藥理靶點，已得到廣泛關注。2型糖尿病是一種較多發(fā)生的代謝性疾病，胰島素抵抗是其主要病理特征之一[10]。產(chǎn)生胰島素抵抗時，組織對胰島素刺激的葡萄糖攝取和利用效率降低[11]。骨骼肌的葡萄糖轉運是機體攝取葡萄糖的主要方式，對于維持機體葡萄糖內穩(wěn)態(tài)具有重要作用[12]。葡萄糖轉運主要有兩條途徑：一條是胰島素依賴途徑，另一條是非胰島素依賴的信號途徑，即AMPK途徑。對于2型糖尿病患者，骨骼肌中胰島素介導的葡萄糖轉運已經(jīng)受損，因此，改善AMPK途徑的葡萄糖轉運成為2型糖尿病更有效、更具前景的治療靶點[13]。AMPK激活可以刺激骨骼肌中葡萄糖攝取和脂肪酸氧化，增強能量代謝，且這種作用不依賴于胰島素[14]。在發(fā)生胰島素抵抗的2型糖尿病動物模型中，其肝臟、肌肉和脂肪組織中AMPK的活性比正常組明顯降低，而AMPK激動劑可以有效降低血糖及改善胰島素抵抗[15]。本研究表明，用牛蒡子苷處理L6骨骼肌細胞可以顯著增加細胞的葡萄糖消耗，升高AMPK蛋白的磷酸化水平，增強AMPK活性，表明牛蒡子苷可以促進骨骼肌細胞的葡萄糖攝取，對胰島素抵抗具有潛在改善作用。

PGC-1α是一種核轉錄共激活因子，在調節(jié)能量平衡中起著重要作用，AMPK激活可以增加PGC-1α的表達水平[16]。近年來，PGC-1α在線粒體功能和胰島素抵抗中的作用成為研究熱點[17]。有研究表明增強PGC-1α活性可以改善線粒體代謝及促進線粒體發(fā)生[18]。另有研究表明PGC-1α可以增強葡萄糖轉運體4(glucose transporter type 4，GLUT4)mRNA表達水平，提高肌細胞的葡萄糖轉運能力及對胰島素的敏感性，進而降低血糖[19]。本研究亦顯示，牛蒡子苷可以濃度依賴性地增強L6骨骼肌細胞中PGC-1α的基因表達水平，證實牛蒡子苷具有潛在的增強胰島素敏感性的作用。

綜上所述， AMPK信號通路可以調節(jié)葡萄糖攝取且不依賴于胰島素，是改善胰島素抵抗的有效途徑；牛蒡子苷可以增加L6骨骼肌細胞的葡萄糖消耗，增強AMPK活性，并促進PGC-1α轉錄，表明牛蒡子苷具有潛在地增強胰島素敏感性和改善2型糖尿病臨床癥狀的作用。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Effect ofarctiin on AMPK signal pathway in L6 myotubes

XIANG Fang1, WEI Wei1, XIANG Hong2,WANGYu-lan3,JIWei1,XUNuo1,WANXiao-mei1.

1.DepartmentofPharmacy, 81HospitalofPLA,Nanjing,Jiangsu210002,China; 2.TheFirstSanatoriumforRetiredCadres,NanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu210000,China; 3.TheSecondSanatoriumforRetiredCadres,NanjingMilitaryCommand,PLA,Nanjing,Jiangsu210005,China

[Key words]arctiin; insulin resistance; AMPK; L6 myotubes

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of arctiin on glucose consumption and AMPK pathway in L6 myotubes. MethodsL6 myoblasts were differentiated to myotubes and treated with or without arctiin. After 24 h, glucose oxidase method was performed at the end of treatment and the AMPKα and p-AMPKα levels were detected by western blot (mammalian AMPK is a trimer structure that composed of alpha, beta, gamma of three subunits, and the content detection of total AMPK and activated AMPK proteins usually refers to the alpha subunit.); The PGC-1α mRNA level were measured with real-time PCR. ResultsThe result of glucose oxidase assay suggested that arctiin increase. Compared with control group, arctiin enhanced the activity of p-AMPKα with a concentration-dependent manner, and arctiin promoted the transcription of PGC-1α with a concentration-dependent manner, too. ConclusionArctiin increases glucose consumption and activates AMPK/PGC-1α signal pathway in L6 myotubes, which suggests that arctiin could potentially improve insulin resistance.

通訊作者：魏瑋，E-mail：gynkey@sina.com

[中圖分類號]R966

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.02.015

(收稿日期：2015-12-08；修回日期：2016-01-25)

引用格式：相芳,魏瑋，相紅,等.牛蒡子苷對L6骨骼肌細胞中腺苷酸活化蛋白激酶信號通路的影響[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(2):157-159,187.