PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢Colletotrichumfructicola原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

韓小路，白靜科，張 　瑋，張　榮，孫廣宇

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌　712100)

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PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢Colletotrichumfructicola原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

韓小路，白靜科，張 瑋，張榮，孫廣宇

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,陜西楊凌712100)

摘要為建立PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢Colletotrichum fructicola的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以果生刺盤孢SQ06-E的幼嫩菌絲為受體，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，將含有潮霉素標(biāo)記的質(zhì)粒pCB1003轉(zhuǎn)入果生刺盤孢菌絲的原生質(zhì)體中；對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測、PCR檢測和Southern雜交分析。試驗(yàn)獲得果生刺盤孢的最優(yōu)轉(zhuǎn)化體系為：密度為1×106 mL-1分生孢子在M3S培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)8 h；過濾收集菌絲，在質(zhì)量濃度為0.25 g/mL崩潰酶+0.05 g/mL溶壁酶的10 mL酶解液中加入0.5 g濕菌體酶解3 h；整個(gè)試驗(yàn)的滲透壓穩(wěn)定劑為0.8 mol/L KCl。試驗(yàn)共得到76個(gè)轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化率為1 μg DNA獲得3～4個(gè)轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子的PCR檢測和Southern雜交分析都表明hph基因已整合入果生刺盤孢的基因組中。所有轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上繼代5次后仍能正常生長，說明外源基因hph能在果生刺盤孢中穩(wěn)定遺傳。

關(guān)鍵詞蘋果炭疽葉枯??；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化子鑒定

蘋果炭疽病是由刺盤孢屬(ColletotrichumCda.)的真菌引起的一類重要病害，包含果實(shí)上的苦腐病(Bitter rot of apple)和葉片上的葉枯病(Glomerellaleaf spot)[1]?？喔≈饕鸫罅柯涔?、果實(shí)腐爛、降低果品的產(chǎn)量和質(zhì)量，并可能危害后期的貯藏和運(yùn)銷。葉枯病是一種流行性很強(qiáng)的病害，一旦發(fā)生，造成早期大量落葉，樹勢變?nèi)?，枝條二次開花和發(fā)芽，對蘋果產(chǎn)業(yè)威脅很大[2-3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在分類學(xué)中的應(yīng)用，特別是“系譜一致性系統(tǒng)發(fā)育種識別(Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition，GCPSR)”理論[4]的提出，使許多復(fù)合種得以澄清，刺盤孢屬的分類有很大變化，以前被認(rèn)為是蘋果炭疽病病原菌的真菌分類地位有很大變動[5-7]。引起中國蘋果炭疽葉枯病的病原被鑒定為果生刺盤孢(C.fructicola)和隱秘刺盤孢(C.aenigma)，其中果生刺盤孢為優(yōu)勢種[8]。

目前，刺盤孢屬已有6個(gè)種完成基因組測序，故對刺盤孢的研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時(shí)代[9-12]。因此，建立方便、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系對進(jìn)一步研究刺盤孢的功能基因組學(xué)和致病機(jī)制有重要意義。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法是使用較早的細(xì)胞融合方法，由Kao等[13]建立。PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化在絲狀真菌中應(yīng)用廣泛，如在稻瘟菌[14]、禾谷鐮刀菌[15-16]等病原真菌中進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育、致病等相關(guān)基因敲除突變體的研究取得許多重要進(jìn)展。Rodriguez等[17]首次使用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將amdS+和hygBR基因成功轉(zhuǎn)入豆刺盤孢(Colletotrichumlindemuthianum)中，開啟刺盤孢的轉(zhuǎn)化研究。目前，已報(bào)道的利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的刺盤孢有膠孢刺盤孢(C.gloeosporioides)[18]、瓜類刺盤孢(C.lagenarium)[19-21]和三葉草刺盤孢(C.trifolii)[22-23]等。但是研究[20,23]發(fā)現(xiàn)，不同刺盤孢的原生質(zhì)體制備條件和轉(zhuǎn)化條件都存在差異。

建立方便、穩(wěn)定、高效的蘋果果生刺盤孢遺傳轉(zhuǎn)化體系是研究基因功能的前提，而在眾多轉(zhuǎn)化方法中，PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法在基因定點(diǎn)敲除上有很大優(yōu)勢。在該方法中能否制備大量完整的原生質(zhì)體是轉(zhuǎn)化成功與否的關(guān)鍵。目前，有關(guān)蘋果果生刺盤孢原生質(zhì)體制備及PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究尚未見報(bào)道。因此，本研究建立PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步研究果生刺盤孢功能基因組學(xué)和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株和質(zhì)粒蘋果果生刺盤孢SQ06-E為西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌研究室于2012年從河南商丘的蘋果葉片上分離純化得到；攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)的質(zhì)粒pCB1003由西北農(nóng)林科技大學(xué)許金榮教授惠贈。

1.1.2供試引物、培養(yǎng)基和試劑檢測潮霉素抗性基因的引物序列為H852：5′-AACTCACCGCGACGTCTGTC-3′，H850：5′-TTGTCCGTCAGGACATTGTT-3′[24]，由上海生工生物有限公司合成。

CMC培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉15 g，NaNO31 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O0.5 g，酵母膏1 g，加水定容至1 000 mL[25]。

M3S培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 2.5 g，KH2PO42.7 g，蛋白胨1 g，酵母膏1 g，蔗糖10 g，加水定容至1 000 mL[26]。

TB3培養(yǎng)基：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，加水定容至1 000 mL[27]。

Top Ager：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，瓊脂15 g，加水定容至1 000 mL[27]。

Bottom Ager：酵母膏3 g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖200 g，瓊脂10 g，加水定容至1 000 mL[27]。

STC溶液：蔗糖200 g，0.5 mol/L Tris-HCl 100 mL，KCl 7.351 g，加水定容至1 000 mL[27]。

PTC：40 g PEG 8000 ，用STC定容至100 mL，加熱溶解，4 ℃保存[27]。

潮霉素B和DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I購自德國Roche公司。MiraCloth購自美國Calbiochem公司。崩潰酶(Driselase)和溶壁酶(Lysing Enzymes)購自美國Sigma公司。其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑均購自TaKaRa公司。

1.2潮霉素質(zhì)量濃度與供試蘋果炭疽菌的關(guān)系

配制潮霉素B質(zhì)量濃度梯度(0、30、60、90和100 mg/L)的PDA平板，在活化好的果生刺盤孢菌落邊緣打取菌餅(d=6 mm)，接種在平板中央，25 ℃培養(yǎng)5 d后觀察菌落生長情況。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3果生刺盤孢分生孢子誘導(dǎo)及萌發(fā)

1.3.1果生刺盤孢分生孢子的誘導(dǎo)將果生刺盤孢SQ06-E接種于PDA平板上活化培養(yǎng)7 d，挑取3塊2 cm2的菌餅接種到裝有100 mL CMC培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，誘導(dǎo)產(chǎn)孢。

1.3.2分生孢子數(shù)與分生孢子萌發(fā)的關(guān)系震蕩培養(yǎng)72 h后，用1層MiraCloth過濾，收集液體，3 500 r/min離心10 min，棄上清。用無菌水沖洗孢子2遍，再用無菌水將孢子配成一定密度的懸液，加入到100 mL M3S培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中孢子終密度分別為1×103、1×104、1×105、1×106和1×107mL-1，28 ℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)8 h后計(jì)孢子萌發(fā)率并測量菌絲長度。每個(gè)密度3個(gè)重復(fù)。

1.4果生刺盤孢原生質(zhì)體制備的影響因素

將分生孢子懸液配成最適密度，加入到裝有100 mL M3S培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)8 h，用1層MiraCloth過濾培養(yǎng)基并收集菌絲，再用0.8 mol/L KCl沖洗2次，將菌絲分裝于50 mL離心管中，每管0.5 g，加入10 mL酶解液，在搖床上31 ℃、80 r/min振蕩酶解3 h。用3層擦鏡紙和1層MiraCloth過濾酶解混合物到50 mL離心管中，室溫、3 500 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體，用STC溶液沖洗原生質(zhì)體后懸浮，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)計(jì)數(shù)3次，計(jì)算平均值。

1.4.1菌齡供試菌株分生孢子培養(yǎng)時(shí)間分別為8、10、12和14 h，其他操作同“1.4”。

1.4.2酶質(zhì)量濃度分別用質(zhì)量濃度為1.5、2.0、2.5和3 g/mL的崩潰酶與0.05 g/mL的溶壁酶配成酶解液處理菌絲，其他操作同“1.4”。

1.4.3酶解時(shí)間菌絲于酶解液中的酶解時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0和3.5 h，其他操作同“1.4”。

1.4.4滲透壓穩(wěn)定劑濃度滲透壓穩(wěn)定劑分別是濃度為0.7、0.8、1、1.2和1.4 mol/L的 KCl溶液，沖洗菌絲和配制酶解液的滲透壓穩(wěn)定劑濃度保持一致，其他操作同“1.4”。

1.5果生刺盤孢原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

將制備好的原生質(zhì)體用STC重新懸浮到2～5×107mL-1。加入10～20 ng的DNA片段到含有200 μL原生質(zhì)體懸浮液的50 mL離心管中，輕輕混合均勻后室溫靜置20 min。緩慢加入1 mLw=40%的PTC(用細(xì)菌過濾器過濾)到管中輕輕混勻，靜置20 min。加入TB3，25 ℃、80 r/min搖床中過夜。3 500 r/min離心10 min，棄上清，余下1 mL殘夜將剩余物懸浮。加入10～15 mL Bottom Ager(含抗生素和潮霉素B)，混勻后倒板，室溫培養(yǎng)10 h。用10 mL Top Ager覆蓋于平板上，25 ℃下培養(yǎng)2～3 d，挑取轉(zhuǎn)化子。

1.6果生刺盤孢轉(zhuǎn)化子的鑒定

1.6.1轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性檢測挑取果生刺盤孢轉(zhuǎn)化子接種于含潮霉素的PDA平板上，繼代培養(yǎng)5次，觀察轉(zhuǎn)化子對潮霉素抗性的情況。

1.6.2轉(zhuǎn)化子的PCR檢測用CTAB法提取果生刺盤孢轉(zhuǎn)化子和野生型菌株SQ06-E的基因組DNA，以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶特異性引物H852和H850進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測hph基因的插入和整合情況。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸70 s，循環(huán)37次；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.3轉(zhuǎn)化子的Southern blot分析基因組DNA使用BioFlux的真菌基因組提取試劑盒提取，PstⅠ單酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。以hph的PCR產(chǎn)物為模板，探針標(biāo)記和檢測方法按照試劑盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ)說明書進(jìn)行，檢測轉(zhuǎn)化子基因組中hph基因的插入拷貝數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1潮霉素對供試果生刺盤孢的影響

將果生刺盤孢接種于含有不同質(zhì)量濃度潮霉素B的PDA平板上，培養(yǎng)5 d后觀察果生刺盤孢的生長情況。結(jié)果表明，當(dāng)潮霉素質(zhì)量濃度為30 mg/L時(shí)，SQ06-E菌株就已經(jīng)停止生長，由于潮霉素有見光分解的特性，考慮培養(yǎng)時(shí)間較長，故選擇50 mg/L潮霉素B進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。

2.2分生孢子密度對分生孢子萌發(fā)的影響

將分生孢子懸液配成1×103、1×104、1×105、1×106和1×107mL-1的密度，于250 mL三角瓶中振蕩培養(yǎng)8 h，孢子萌發(fā)率及萌發(fā)后菌絲的長度如圖1所示。結(jié)果表明，當(dāng)孢子密度為1×103、1×104和1×105mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)率均為100%，而當(dāng)孢子密度為1×106和1×107mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)率降至60%和11%。同時(shí)，當(dāng)孢子密度為1×103、1×104和1×105mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)長出的菌絲長度約為890 μm，而當(dāng)孢子密度為1×106和1×107mL-1時(shí)，菌絲長度明顯變短為380和240 μm(圖1)。由此可知，當(dāng)分生孢子密度過高時(shí)，孢子的萌發(fā)和菌絲的生長都存在一定地自抑作用，而孢子密度過低又收集不到大量幼嫩菌絲，當(dāng)分生孢子懸液密度為1×106mL-1時(shí)，孢子的萌發(fā)率、菌絲量和菌絲長度最適宜。

柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Different letters in column indicate significant difference atP<0.05.The same below.

圖1孢子密度與孢子萌發(fā)率和菌絲長的關(guān)系

Fig.1Relationship between spore density and spore

germination rate and hyphae length

2.3原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化

2.3.1菌 齡當(dāng)分生孢子震蕩培養(yǎng)到8～14 h時(shí)，每2 h取樣1次，酶解試驗(yàn)所用菌絲菌齡分別為搖培8、10、12和14 h 4個(gè)對照。當(dāng)果生刺盤孢的搖培時(shí)間為8 h時(shí)，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多，可達(dá)3.64×106mL-1(圖2)。分生孢子搖培時(shí)間過短，菌絲生長較短，收集不到大量的幼嫩菌絲；而搖培時(shí)間過長，菌絲的細(xì)胞壁生長過厚，不易酶解。故搖培時(shí)間過短或過長，原生質(zhì)體的產(chǎn)量均有所下降。因此，選擇分生孢子在25 ℃、200 r/min搖培8 h后酶解，獲得的原生質(zhì)體最多。

2.3.2酶質(zhì)量濃度分別用質(zhì)量濃度為1.5 、2、2.5和3 g/mL的崩潰酶與0.05 g/mL的溶壁酶混合配成酶解液處理菌絲。當(dāng)崩潰酶的質(zhì)量濃度為2.5 g/mL時(shí)，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多，可達(dá)3.24×106mL-1(圖3)。酶質(zhì)量濃度過低時(shí)，得不到足夠量的原生質(zhì)體。而酶質(zhì)量濃度過高時(shí)，過量的酶會繼續(xù)降解原生質(zhì)體，導(dǎo)致原生質(zhì)體量減少，同時(shí)還會影響原生質(zhì)體的再生。

圖2　孢子培養(yǎng)時(shí)間與原生質(zhì)體量的關(guān)系

圖3　酶質(zhì)量濃度與原生質(zhì)體量的關(guān)系

2.3.3酶解時(shí)間在質(zhì)量濃度為2.5 g/mL崩潰酶+0.05 g/mL溶壁酶的酶解液中酶解菌絲，菌絲分別酶解2、2.5、3和3.5 h。當(dāng)菌絲酶解3 h時(shí)，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量最多，達(dá)到3.21×106mL-1(圖4)。酶解時(shí)間過短，菌絲未被酶解完全，得到原生質(zhì)體數(shù)量少；而酶解時(shí)間過長，已形成的原生質(zhì)體會被酶破壞，導(dǎo)致原生質(zhì)體數(shù)量減少；同時(shí)，酶解時(shí)間過長會導(dǎo)致原生質(zhì)體再生困難。

2.3.4滲透壓穩(wěn)定劑濃度滲透壓穩(wěn)定劑起保護(hù)作用時(shí)，需要一定濃度，其濃度過高或過低都會最終影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量和質(zhì)量。濃度過低時(shí)，原生質(zhì)體釋放后體積較大，容易破裂；而濃度較高時(shí)，不利于原生質(zhì)體的釋放，且形成的原生質(zhì)體較小，對再生和轉(zhuǎn)化效率都有影響。試驗(yàn)中，分別使用濃度為0.7 、0.8、1、1.2和1.4 mol/L的KCl溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑。結(jié)果表明，使用濃度為0.8 mol/L的KCl溶液為滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，獲得原生質(zhì)體量最多，達(dá)2.8×106mL-1(圖5)。

圖4　酶解時(shí)間與原生質(zhì)體量的關(guān)系

圖5　穩(wěn)滲劑濃度與原生質(zhì)體量的關(guān)系

2.4果生刺盤孢轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

將所有果生刺盤孢的轉(zhuǎn)化子在含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代后，發(fā)現(xiàn)所有轉(zhuǎn)化子仍表現(xiàn)出對潮霉素B的抗性，表明hph基因已經(jīng)插入基因組中，并隨著菌絲的有絲分裂能夠穩(wěn)定遺傳。利用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的特異性引物H850和H852對上述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，所有轉(zhuǎn)化子和質(zhì)粒對照均能擴(kuò)增到750 bp大小的特異性條帶，而在野生型菌株中未擴(kuò)增到目標(biāo)片段，初步證明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因成功插入并整合到果生刺盤孢基因組中，并且具有遺傳穩(wěn)定性(圖6)。

以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段(750 bp)為探針，對果生刺盤孢的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern blot雜交分析，由圖7可知，野生型菌株SQ06-E未能雜交到任何條帶，但質(zhì)粒對照和7個(gè)轉(zhuǎn)化子均可雜交到特異性條帶，由此證明hph基因已整合到果生刺盤孢基因組中，其中轉(zhuǎn)化子SA3、SD12、SB14、SC11、SD9和SD11都有多拷貝插入，只有轉(zhuǎn)化子SA7為雙拷貝插入。

M.DL2000 DNA marker;CK.質(zhì)粒pCB1003Plasmid pCB1003; W.野生型菌株SQ06-EWide-type strain SQ06-E; 1～15.轉(zhuǎn)化子Transformants

圖6果生刺盤孢部分轉(zhuǎn)化子的PCR檢測結(jié)果

Fig.6 PCR detection results of partial transformants

ofColletotrichumfructicolastrain SQ06-E

M.DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)λ-Hind Ⅲλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker; CK.質(zhì)粒pCB1003Plasmid pCB1003; 1～7.轉(zhuǎn)化子SA3、SD12、SB14、SC11、SD11、SD9和SA7Transformants SA3,SD12,SB14,SC11,SD11,SD9 and SA7; 8.野生型菌株SQ06-EWide-type strain SQ06-E

圖7 果生刺盤孢部分轉(zhuǎn)化子的Southern blot分析

Fig.7Southern blot analysis of transformants

ofColletotrichumfructicolastrain SQ06-E

3討 論

1990年刺盤孢屬第1次國際研討會在英國巴斯大學(xué)舉行，匯集分類學(xué)、分子生物學(xué)、植物免疫和病理學(xué)各領(lǐng)域的專家，這次會議促進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)在刺盤孢領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用[28]。自此以后，隨著多基因分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，刺盤孢屬的系統(tǒng)分類發(fā)生巨大變化[6-7,29]，作為引起蘋果炭疽類病病原菌的刺盤孢也被重新定義，以前被認(rèn)為是蘋果炭疽病病原菌的膠孢刺盤孢實(shí)際上為多種刺盤孢的復(fù)合群。本試驗(yàn)將其中的果生炭疽菌作為供試菌株，建立蘋果果生刺盤孢的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(ATMT)和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是常用的真菌轉(zhuǎn)化方法。由于ATMT方法具有轉(zhuǎn)化率高和單拷貝插入等優(yōu)點(diǎn)，在過去的10 a中，該方法在各種真菌中被廣泛應(yīng)用。但是，作為基因敲除等研究的基礎(chǔ)，該方法需要反復(fù)構(gòu)建載體以適應(yīng)不同的敲除片段，過于繁瑣。而PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化是應(yīng)用較早和較普遍的方法，該方法操作簡便，能夠有效、準(zhǔn)確的敲除目的基因。因此，本研究對PEG介導(dǎo)的蘋果果生刺盤孢原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中的條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得1個(gè)穩(wěn)定、高效的轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)果生刺盤孢致病基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

Cappellini等[25]發(fā)現(xiàn)在震蕩條件下羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose，CMC)能使不產(chǎn)孢的Gibberellazeae產(chǎn)生大孢子，在其他真菌中也發(fā)現(xiàn)含有纖維素的物質(zhì)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)孢[30]。本試驗(yàn)中，果生刺盤孢SQ06-E在固體培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，故采用CMC培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMC同樣能在震蕩條件下誘導(dǎo)果生刺盤孢產(chǎn)生大量分生孢子。由于CMC是天然維生素羧甲基化的產(chǎn)物，難分解，不能為真菌孢子萌發(fā)提供碳源，同時(shí)它還具有良好的乳狀、打散、懸浮和粘連作用，這使得誘導(dǎo)產(chǎn)生的分生孢子在培養(yǎng)基中均勻懸浮且不萌發(fā)。因此，使用CMC培養(yǎng)基震蕩促進(jìn)產(chǎn)孢的同時(shí)可以抑制分生孢子萌發(fā)，這就可以保證萌發(fā)的分生孢子處于同一生長發(fā)育階段，適于進(jìn)一步的原生質(zhì)體制備。

原生質(zhì)體的數(shù)量和質(zhì)量直接影響轉(zhuǎn)化效率。在原生質(zhì)體制備過程中，菌齡和菌量都會影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量。Chen等[23]用YPSS培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)C.trifolii的分生孢子5～7 d后制備原生質(zhì)體；Takano等[20]用PSY培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)C.lagenarium的分生孢子3 d后制備原生質(zhì)體；Redman等[26]用M3S培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)C.lindemuthianum、C.magna和C.coccodes的分生孢子48 h后制備原生質(zhì)體。本試驗(yàn)中使用M3S培養(yǎng)分生孢子，孢子培養(yǎng)6 h后，由于孢子萌發(fā)的菌絲太短，用MiraCloth無法收集到幼嫩菌絲，而孢子培養(yǎng)8 h后，菌絲長度和收集的菌量都能滿足制備原生質(zhì)體的條件。由此看來，不同種刺盤孢分生孢子的萌發(fā)條件和萌發(fā)速度都存在較大差異。同時(shí)，在液體培養(yǎng)基中，果生刺盤孢分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)都需要震蕩來提供氧氣。

PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法具有隨機(jī)插入多個(gè)拷貝的特點(diǎn)，本試驗(yàn)的Southern blot雜交分析表明，外源基因hph已經(jīng)成功插入隨機(jī)選擇的7個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因組中，只有轉(zhuǎn)化子SA7中僅有2個(gè)拷貝的插入，而其他6個(gè)轉(zhuǎn)化子中都有多于2個(gè)拷貝的插入，這與PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法的特點(diǎn)完全吻合。在獲得突變再生的菌絲后，使用有效的選擇標(biāo)記獲得轉(zhuǎn)化子是關(guān)鍵步驟，本試驗(yàn)選擇的潮霉素B抗性標(biāo)記基因hph是目前使用較為廣泛的選擇標(biāo)記。對于黃瓜炭疽病菌(C.lagenarium)[21]、鱷梨炭疽病菌(C.gloeosporioides)[31]、有節(jié)黧豆炭疽病菌(C.gloeosporioides)[32]、楊樹炭疽病菌(C.gloeosporioides)[33]等的生長有良好的抑制效果，抑制質(zhì)量濃度為50～300 mg/L。本試驗(yàn)中，30 mg/L的潮霉素B即可完全抑制蘋果炭疽菌的生長。而王海艷等[34]測得的潮霉素B對蘋果炭疽病菌(C.gloeosporioides)生長完全抑制的最低質(zhì)量濃度為300 mg/L。由此看來，潮霉素B對刺盤孢屬不同種的生長抑制存在差異，對同一復(fù)合群下不同種的刺盤孢生長抑制也存在差異。這可能與刺盤孢屬種間和復(fù)合種內(nèi)的生理特性差異有關(guān)。

參考文獻(xiàn)Reference：

[1]張 榮,王素芳,崔靜秋,等.陜、豫兩省蘋果炭疽病病原鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(9): 3224-3229.

ZHANG R,WANG S F,CUI J Q,etal.Identification of pathogens causing apple fruit bitter rot in Shaanxi and He’nan provinces[J].ScientiaAgriculturaSinica,2009,42(9):3224-3229 (in Chinese with English abstract).

[2]宋 清,王素俠,楊春亮,等.蘋果炭疽葉枯病的研究初報(bào)[J].落葉果樹,2012,44(2):29-30.

SONG Q,WANG S X,YANG CH L,etal.Preliminary study on apple anthrax leaf blight[J].DeciduousFruits,2012,44(2):29-30 (in Chinese).

[3]孫共明,劉利民,朱其高,等.蘋果新病害-蘋果炭疽葉枯病的發(fā)生與防控[J].果農(nóng)之友,2011,12:21.

SUN G M,LIU L M,ZHU Q G,etal.A new apple disease - occurrence and prevention of apple anthrax leaf blight[J].FruitGrowers’Friend,2011,12:21 (in Chinese).

[4]TAYLOR J W,JACOBSON D J,KROKEN S,etal.Phylogenetic species recognition and species concepts in fungi[J].FungalGeneticsandBiology,2000,31(1):21-32.

[5]CANNON P F,DAMM U,JOHNSTON P R,etal.Colletotrichum-current status and future directions[J].StudiesinMycology,2012,73: 181-213.

[6]WEIR B S,JACOBSON P R,DAMM U.TheColletotrichumgloeosporioidesspecies complex[J].StudiesinMycology,2012,73: 115-180.

[7]DAMM U,CANNON P F,WOUDENBERG J H C,etal.TheColletotrichumacutatumspecies complex[J].StudiesinMycology,2012,73: 37-113.

[8]王 薇,符丹丹,張 榮,等.蘋果炭疽葉枯病病原學(xué)研究[J].菌物學(xué)報(bào),2015,34(1): 13-25.

WANG W,FU D D,ZHANG R,etal.Etiology of apple leaf spot caused byColletotrichumspp.[J].Mycosystema,2015,34(1):13-25 (in Chinese with English abstract).

[9]O’CONNELL R J,THON M R,HACQUARD S,etal.Lifestyle transitions in plant pathogenicColletotrichumfungi deciphered by genome and transcriptome analyses[J].Naturegenetics,2012,44(9):1060-1065.

[10]GAN P,IKEDA K,IRIEDA H,etal.Comparative genomic and transcriptomic analyses reveal the hemibiotrophic stage shift ofColletotrichumfungi[J].NewPhytologist,2013,197(4):1236-1249.

[11]BARONCELLI R,SREENIVASAPRASAD S,SUKNO S A,etal.Draft genome sequence ofColletotrichumacutatumSensu Lato(Colletotrichumfioriniae)[J].GenomeAnnouncements,2014,2(2):e00112-14.

[12]BARONCELLI R,SANZ-MARTIN J M,RECH G E,etal.Draft genome sequence ofColletotrichumsublineola,a destructive pathogen of cultivatedSorghum[J].GenomeAnnouncements,2014,2(3): e00540-14.

[13]KAO K N,MICHAYLUK M R.A Method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts[J].Planta,1974,115(4):355-367.

[14]LI L,XUE C,BRUNO K,etal.Two PAK kinase genes,CHM1 andMST20,have distinct functions inMagnaporthegrisea[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2004,17(5):547-556.

[15]DING S,MEHRABI R,KOTEN C,etal.The transducin beta like gene FTL1 is essential for pathogenesis inFusariumgraminearum[J].EukaryoticCell,2009,8(6):867-876.

[16]BLUHM B H,ZHAO X,FLAHERTY J E,etal. RAS2 regulates growth and pathogenesisinFusariumgraminearum[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2007,20(6):627-636.

[17]RODRIGUEZ R J,YODER O C.Selectable genes for transformation of the fungal plant pathogenGlomerellacingulataf.sp.phaseoli(Colletotrichumlindemuthianum)[J].Gene,1987,54(1):73-81.

[18]POPLAWSKI A M,HE C,IRWIN J A,etal.Transfer of an autonomously replicating vector between vegetatively incompatible biotypes ofColletotrichumgloeosporioides[J].CurrentGenetics,1997,32(1):66-72.

[19]TSUJI G,FUJII S,TSUGE S,etal.TheColletotrichumlagenariumSte12-like gene CST1 is essential for appressorium penetration[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2003,16(4):315-325.

[20]TAKANO Y,KOMEDA K,KOJIMA K.Proper regulation of cyclic AMP-dependent protein kinase is required forgrowth,conidiation,and appressorium function in the anthracnose fungusColletotrichumlagenarium[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2001,14(10):1149-1157.

[21] KOJIMA K,KIKUCHI T,TAKANO Y.The mitogen-activated protein kinase gene MAF1 is essential for the early differentiation phase of appressorium formation inColletotrichumlagenarium[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2002,15(12):1268-1276.

[22]DICKMAN M B.Whole cell transformation of the alfalfa fungal pathogenColletotrichumtrifolii[J].CurrentGenetics,1988,14(3):241-246.

[23]CHEN C,HA Y S,MIN J Y.Cdc42 is required for proper growth and development in the fungal pathogenColletotrichumtrifolii[J].EukaryoticCell,2006,5(1):155-166.

[24]徐齊君,胡小平,陳婷,等.PEG介導(dǎo)的棉花枯萎病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的建立[J].棉花學(xué)報(bào),2012,24(3):222-228.

XU Q J,HU X P,CHEN T,etal.Protoplast transformation ofFusariumoxysporumf.sp.vasinfectummediated by polyethylene glycol[J].CottonScience,2012,24(3):222-228 (in Chinese with English abstract).

[25]CAPPELLINI R A,PETERSON J L.Macroconidium formation in submerged cultures by a non-sporulating strain ofGibberellazeae[J].Mycologia,1965,57(6):962-966.

[26]REDMAN R S,RODRIGUEZ R J.Factors affecting the efficient transformation ofColletotrichumspecies[J].ExperimentalMycology,1994,18(3):230-246.

[27]李依民.禾谷鐮孢菌組蛋白去乙?；富?HDACs)功能驗(yàn)證[D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2011.

LI Y M.Functional characterization of the genesHDACsinFusaruimgraminearium[D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2011 (in Chinese with English abstract).

[28]BAILEY J A,JEGER M J.Colletotrichum:biology,pathology and control.CAB Inthernational[M].Wallingford,UK,1992.

[29]DAMM U,CANNON P F,WOUDENBERG J H C,etal.TheColletotrichumboninensespecies complex[J].StudiesinMycology,2012,73:1-36.

[30]DARBY R T,MANDELS G R.Effects of sporulation medium and age on fungus spore physiology[J].PlantPhysiology,1955,30(4):360-366.

[31]YAKOBY N,ZHOU R,KOBILER I.Development ofColletotrichumgloeosporioidesrestriction enzyme-mediated integration mutants as biocontrol agents against anthracnose disease in Avocado fruits[J].Phytopathology,2001,91(2):143-148.

[32]ROBINSON M,SHARON A.Transformation of the bioherbicideColletotrichumgloeosporioidesf.sp.aeschynomeneby electroporation of germinated conidia[J].CurrentGenetics,1999,36(1-2):98-104.

[33]李思蒙,王永林,黃冬輝,等.楊樹炭疽病菌原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化的建立及綠色熒光蛋白的表達(dá)[J].林業(yè)科學(xué),2013,49(5):121-127.

LI S M,WANG Y L,HUANG D H,etal.Establishment of a PEG-Mediated genetic transformation system and expression of green fluorescence protein inColletotrichumgloeosporioides[J].ScientiaSilvaeSinicae,2013,49(5):121-127(in Chinese with English abstract).

[34]王海艷,李保華,張清明,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)蘋果炭疽病菌的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,46(9):1799-1807.

WANG H Y,LI B H,ZHANG Q M,etal.Transformation ofAgrobacteriumtumefaciens-mediatedColletotrichumgloeosporioidesand identification of transformants[J].ScientiaAgriculturaSinica,2013,46(9):1799-1807 (in Chinese with English abstract).

Received 2015-06-01Returned2015-09-12

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No.31171797).

First authorHAN Xiaolu,female,master student.Research area:plant pathology and mycology.E-mail: hanxiaolugood@163.com

SUN Guangyu,male,Ph.D,professor.Research area: plant pathology and mycology.E-mail：sgy@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

>PEG-Mediated Transformation ofColletotrichumfructicola

HAN Xiaolu，BAI Jingke，ZHANG Wei，ZHANG Rong and SUN Guangyu

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

AbstractTo establish the PEG-mediated transformation technology system of Colletotrichum fructicola,we used the fresh hypha of Colletotrichum fructicola strain SQ06-E as recipient and then transformed a plasmid pCB1003 harboring the hygromycin B phosphotransferase gene (hph) into the protoplast of SQ06-E mediated by PEG (polyethylene glycol).The obtained transformants were screened and identified by hygromycin B resistance,PCR and method of Southern Blot analysis.The optimal transformation conditions were that 1×106 spores per milliliter of Colletotrichum fructicola spore suspension were shocked in M3S medium for 8 h in 200 r/min at 28 ℃; collecting 0.5 g hypha and hydrolyzing them in 10 mL enzyme solution which contained 0.25 g/mL Driselase and 0.05 g/mL Lysing enzyme for 3 h;using 0.8 mol/L KCl as the osmotic pressure stabilizer in all experiments.76 transformants have been get and the efficiency reached to 3-4 transformants per microgramme.DNA.Analysis of the transformants by PCR and Southern Blot showed that the selectable marker gene hph was integrated effectively into the genome of Colletotrichum fructicola.After 5 subculturing on PDA,all transformants could grow.This stability test of transformants suggested that the foreign gene hph was stable in heredity.

Key wordsApple Glomerella leaf spot；Genetic transformation；Transformants identification

Corresponding authorZHANG Rong,female,professor.Research area:plant pathology and comprehensive management of apple disease.E-mail: rongzh@nwsuaf.edu.cn

中圖分類號S582.28；S432.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1004-1389(2016)03-0442-08

通信作者：張榮，女，教授，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)和蘋果病害綜合治理。E-mail：rongzh@nwsuaf.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31171797)。

收稿日期：2015-06-01修回日期：2015-09-12

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.034.html

第一作者：韓小路，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)和真菌學(xué)。E-mail：hanxiaolugood@163.com

孫廣宇，男，教授，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)和真菌學(xué)。E-mail：sgy@nwsuaf.edu.cn