小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌的抑菌活性及其作用機(jī)制的初步研究

馬江鋒,曾　紅

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾　843300;2.新疆建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，烏魯木齊　830011 )

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小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌的抑菌活性及其作用機(jī)制的初步研究

馬江鋒1,2,曾紅1

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300;2.新疆建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，烏魯木齊830011 )

摘要研究小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌抑菌活性及其初步作用機(jī)制，為開發(fā)植物源防治紅棗黑斑病菌農(nóng)藥提供理論依據(jù)。采用微量稀釋法測(cè)定小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)(MIVF)，并研究小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌離體(菌絲、孢子萌發(fā)和生物量抑制作用)和活體的抗菌活性。采用碘化吡啶染色法測(cè)定小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌孢子細(xì)胞膜的損壞。結(jié)果表明，小茴香揮發(fā)油對(duì)棉花黃萎病菌的MIVF為0.312 mL/L，小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌生物量、孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)有抑制作用且呈體積分?jǐn)?shù)依賴關(guān)系。由碘化吡啶染色試驗(yàn)結(jié)果可知小茴香揮發(fā)油能嚴(yán)重破壞紅棗黑斑病菌孢子的細(xì)胞膜而達(dá)到抑菌作用。

關(guān)鍵詞小茴香揮發(fā)油；紅棗黑斑病菌；抑菌活性；細(xì)胞膜

新疆是中國(guó)聞名遐邇的瓜果之鄉(xiāng)，而南疆(新疆南部)是新疆瓜果之鄉(xiāng)的軸心。紅棗產(chǎn)業(yè)已成為南疆果農(nóng)致富增收的支柱產(chǎn)業(yè)之一。紅棗黑斑病是影響紅棗產(chǎn)量和質(zhì)量重要病害之一。許多研究者對(duì)紅棗黑斑病病原菌存在很大分歧，可能源于不同地區(qū)、不同時(shí)期、不同生態(tài)型棗園分離的病原菌所有差異。而對(duì)于南疆紅棗黑斑病病原菌不同學(xué)者鑒定為鏈格孢 (Alternariasp.)[1-3]。目前，針對(duì)紅棗黑斑病的防治主要是使用化學(xué)殺菌為主，但化學(xué)殺菌劑因殘留毒性不但危害人類健康和造成環(huán)境污染，而且易使病原菌產(chǎn)生耐藥性。因此尋找一種安全、有效、環(huán)境友好的殺菌劑是必然趨勢(shì)。植物源揮發(fā)油作為殺菌劑是目前研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)植物源揮發(fā)油是天然抗菌物質(zhì)之一。研究集中在植物源揮發(fā)油抗人體病原菌活性、殺蟲活性和抗食品腐敗真菌活性方面[4-10]。近些年，不同學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)天然植物源揮發(fā)油對(duì)植物致病菌有抑制作用，比如Kumar等[11]報(bào)道多舌飛蓬揮發(fā)油對(duì)植物病原菌有抑制作用。Znin等[12]報(bào)道植物源揮發(fā)油對(duì)蘋果病原真菌有抑制作用等。小茴香(FoeniculumvulgareMill)屬傘形科草本植物，是一種藥食兩用植物，其揮發(fā)油具有降血脂、抗氧化、抗菌等多種生物活性[13-14]。而對(duì)小茴香揮發(fā)油抗紅棗黑斑病菌活性及其作用機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)主要研究小茴香揮發(fā)油抗紅棗黑斑病菌活性，觀察不同體積分?jǐn)?shù)小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌菌絲、孢子、生物量的影響，以及揮發(fā)油處理對(duì)紅棗黑斑病菌孢子細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步開發(fā)植物源抗菌劑和科學(xué)評(píng)價(jià)其作為抗真菌農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料與菌株

1.1.1供試材料 小茴香(FoeniculumvulgareMill)揮發(fā)油(Essential oil，EO)及其主要成分香芹酮反式茴香腦(Trans-anethole)和蒎烯(Pinene)，由塔里木大學(xué)胡建偉教授饋贈(zèng)，保存于塔里木大學(xué)生物研究發(fā)展中心。

1.1.2供試菌種細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)由塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種編號(hào)為CGMCC3.3935。

1.2方 法

1.2.1培養(yǎng)基和揮發(fā)油配制馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)配方見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[15]；小茴香揮發(fā)油的配制：揮發(fā)油用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的無(wú)菌吐溫20配成體積分?jǐn)?shù)為10 mL/L的儲(chǔ)備液，分裝，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2A.tenuissima菌種的活化及孢子制備將A.tenuissima接種在PDA斜面上28 ℃培養(yǎng)7 d，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水將孢子洗下，然后涂布于PDA平板上，同樣在25 ℃條件下培養(yǎng)，用直徑9 mm打孔器制菌餅，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將A.tenuissima接種在PDB中，振蕩培養(yǎng)(25 ℃、160 r/min)4 d，離心(5 000 r/min、 5 min)，棄上清液收集沉淀，加無(wú)菌水，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液孢子含量為6×106mL-1，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima抑菌活性的測(cè)定參閱微量稀釋法[16]用96孔板測(cè)定小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)(MIVF)。向96孔板中加入100 μL的PDB培養(yǎng)基，再向第1孔加入100 μL揮發(fā)油儲(chǔ)備液(體積分?jǐn)?shù)為10 mL/L)，然后進(jìn)行倍性稀釋，使96孔板從第1至10孔揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為5～0.018 mL/L。再接種100 μLA.tenuissima孢子含量為6×106mL-1的懸浮液，使每孔終體積為200 μL，第11孔只加入200 μL的PDB培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)基對(duì)照孔，第12孔加入100 μL的PDB培養(yǎng)基和接種100 μL的菌懸液作為生長(zhǎng)對(duì)照孔，96孔板加蓋并密封以減少生長(zhǎng)過(guò)程中水分的蒸發(fā)，置于25 ℃溫箱中培養(yǎng)4 d，眼觀無(wú)菌生長(zhǎng)孔所含該揮發(fā)油的最低體積分?jǐn)?shù)即為MIVF，重復(fù)3次。最低殺菌體積分?jǐn)?shù)(MFVF)的判定：從每個(gè)孔無(wú)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)取100 μL接種于PDA培養(yǎng)基，再次在25 ℃培養(yǎng)7 d，無(wú)菌落形成的孔所對(duì)應(yīng)的體積分?jǐn)?shù)為其MFVF值。

1.2.4小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響PDB培養(yǎng)基中加入小茴香揮發(fā)油，接種A.tenuissima孢子菌懸液(孢子含量為6×106mL-1)，使小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L，混勻， 25 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，移液器取20 μL菌液置于顯微鏡(4×100倍)，用血球計(jì)數(shù)板觀察A.tenuissima孢子萌發(fā)情況，以長(zhǎng)出菌絲為依據(jù)。重復(fù)3次，取平均值，并按如下公式計(jì)算孢子萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率=發(fā)芽孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%。

1.2.5小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima菌絲抑制作用將A.tenuissima接種PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，用直徑9 mm的打孔器取邊緣菌塊作為菌餅。將19 mL PDA培養(yǎng)基和1 mL不同體積分?jǐn)?shù)的揮發(fā)油混勻，倒入直徑為9 cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，使小茴香揮發(fā)油終體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L；以不加揮發(fā)油組為空白對(duì)照，倒入平板中，冷卻。將9 mm菌餅反接入平皿中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每天測(cè)量菌絲長(zhǎng)度，每個(gè)濃度平行重復(fù)3次。計(jì)算公式：抑制菌絲生長(zhǎng)百分率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.2.6小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima生物量的影響在58 mL PDB培養(yǎng)基中加入2 mL不同體積分?jǐn)?shù)的小茴香揮發(fā)油，混勻，使揮發(fā)油終體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L；以不加揮發(fā)油組為空白對(duì)照。每瓶接種6塊9 mm菌餅，25 ℃振蕩培養(yǎng)7 d，過(guò)濾，棄上清收集菌絲體，蒸餾水沖洗3次，于60 ℃烘干6 h，然后置于40 ℃過(guò)夜。用分析天平準(zhǔn)確稱量菌絲體的質(zhì)量，平行重復(fù)3次。計(jì)算公式：菌絲質(zhì)量抑制率=(空白對(duì)照組質(zhì)量-揮發(fā)油處理組質(zhì)量)/空白對(duì)照組質(zhì)量×100%。

1.2.7小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima活體抗菌試驗(yàn)選擇新疆種植面積較大的駿棗為研究對(duì)象，隨機(jī)選取紅棗置于聚苯乙烯盒(容積為0.9 L)，每盒30個(gè)紅棗，共設(shè)5組。第1組：空白對(duì)照組；第2組：0.156 mL/L揮發(fā)油處理組；第3組：0.312 mL/L揮發(fā)油處理組；第4組：0.625 mL/L揮發(fā)油處理組；第5組：1.25 mL/L揮發(fā)油。駿棗用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3～5 次，在無(wú)菌室，每個(gè)駿棗用打孔器打成直徑6 mm、深3 mm 的孔，然后接種10 μLA.alternata菌液(孢子含量為6×106mL-1)，置于容積為 0.7 L無(wú)菌聚苯乙烯盒中，盒子一側(cè)放稱量瓶，瓶里盛放不同體積分?jǐn)?shù)小茴香揮發(fā)油30 mL，空白對(duì)照組加入30 mL無(wú)菌水。25 ℃下培養(yǎng) 60 d，測(cè)定駿棗紅棗腐敗真菌感染率，每處理重復(fù)10次。

1.2.8小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜通透性的影響將A.tenuissima接種于PDA，25 ℃下培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌生理鹽水洗孢子，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度(孢子含量為6×106mL-1)，備用。

7 mL離心管中加入100 μL揮發(fā)油貯備液，再分別向試管中加入3.8 mL PBS-2%(體積分?jǐn)?shù))葡萄糖，使小茴香揮發(fā)油終體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L，接種100 μL孢子懸浮液，以不加小茴香揮發(fā)油組為空白對(duì)照組。振蕩培養(yǎng)24 h(25 ℃，150 r/min)，2 000 g離心5 min，收集沉淀，用無(wú)菌PBS洗滌2次，A.tenuissima細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，加入5 μL PI(PI終質(zhì)量濃度為1 mg/L)，25 ℃避光培養(yǎng)30 min，用PBS洗2次，重新懸于500 μL PBS中，于FACSCalibur (BD Biosciences)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)620 nm (FL2通道)，側(cè)向角散射光(SSC)表示細(xì)胞顆粒度。

1.2.9小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜麥角固醇合成的影響參照文獻(xiàn)[17]測(cè)定小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜麥角固醇含量的影響。250 mL三角瓶中加入58 mL PDB和1 mL小茴香揮發(fā)油儲(chǔ)備液，混勻，使其終體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L，以不加揮發(fā)油為空白對(duì)照組。接種1 mLA.tenuissima菌懸液(孢子含量為6×106mL-1)，振蕩培養(yǎng)(25 ℃、150 r/min)4 d。5 000 g離心5 min，收集細(xì)胞，并稱取1 g，加入10 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%氫氧化鉀乙醇溶液，劇烈震動(dòng)10 min，然后85 ℃水浴2 h。加入水和正庚烷混合溶液[V(水)∶V(正庚烷)=1∶3]劇烈振蕩10 min，室溫靜置，待分層后，將正庚烷層轉(zhuǎn)移至干凈瓶中，于-20 ℃冰箱中放置24 h。分析時(shí)將正庚烷層用無(wú)水乙醇進(jìn)行稀釋，于全波長(zhǎng)紫外可見分光光度計(jì)掃描(波長(zhǎng)230～300 nm)。麥角固醇和去氫麥角固醇[24(28)DHE，為合成麥角甾醇的中間產(chǎn)物]，都在波長(zhǎng)281.5 nm處有吸收峰，但去氫麥角固醇在波長(zhǎng)230 nm處也有強(qiáng)吸收峰。麥角固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算公式：麥角固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)=[(A281.5/290-A230/518)×F]/菌絲質(zhì)量。其中，F(xiàn)為稀釋倍數(shù)，290和518為常數(shù)。

1.2.10小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞通透性的影響于5 mL離心管中加入揮發(fā)油儲(chǔ)備液100 μL，再向試管中加入3.8 mL PBS和200 μL菌懸液，使揮發(fā)油終體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于2、4、6 h取樣，5 000 g離心5 min，測(cè)定上清液(上清液用PBS稀釋)260 nm處OD值(OD260)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 13.0中One way ANOVA中Student-Newman-Keuls對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima孢子的MIVF、MFVF的影響

由表1可知，小茴香揮發(fā)油及其主要成分(反式茴香腦和蒎烯)對(duì)A.tenuissima具有抑制作用，小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima的MIVF和MFVF分別為0.312 mL/L和 0.625 mL/L；反式茴香腦對(duì)A.tenuissima的MIVF和MFVF分別為0.312 mL/L和 0.625～1.25 mL/L；蒎烯對(duì)A.tenuissima的MIVF和MFVF分別為0.625 mL/L和 1.25 mL/L。以上結(jié)果說(shuō)明小茴香揮發(fā)油具有抗農(nóng)業(yè)病原真菌活性取決于其主要成分反式茴香腦和蒎烯。

表1　小茴香揮發(fā)油、反式茴香腦和蒎烯對(duì)A.tenuissima的MIVF和MFVF的影響

2.2小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)的影響

由圖1可知，小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima孢子萌發(fā)有一定抑制作用，當(dāng)小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為0.156、0.321、0.625 mL/L時(shí)，A.tenuissima孢子萌發(fā)率依次為66.31%、48.23%、25.20%；當(dāng)小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為1.25 mL/L時(shí)，孢子萌發(fā)率僅為3.21%，而抑制率達(dá)到96.79%。由此說(shuō)明，小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima重要繁殖體有影響。

2.3小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima菌絲的抑制作用

小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima菌絲有較好的抑制作用(圖2)，當(dāng)揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為0.156、0.312、0.625 mL/L時(shí)，小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima的抑制率分別為18.35%、35.50%、80.10%，當(dāng)小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為1.25 mL/L 時(shí)，抑制率可達(dá)100%。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下圖同。

Bars with different superscripts letters in the bars (a-e) show differ significantly difference (P<0.05)，the same as below.

圖1小茴香揮發(fā)油處理下A.tenuissima

孢子萌發(fā)率的變化 (n=3)

Fig.1Changes of different volume fraction EO from

FoeniculumvulgareMill on spore

germination ofA.tenuissima(n=3)

圖2　小茴香揮發(fā)油處理下A.tenuissima

2.4小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima生物量的影響

由圖3可知，小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima生物量的形成有抑制作用。A.tenuissima接種于含不同體積分?jǐn)?shù)小茴香揮發(fā)油(0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L)的PDB中，振蕩培養(yǎng)7 d時(shí)，對(duì)A.tenuissima生物量的抑制率分別為21.54%、48.62%、79.21%、98.01%。

圖3　小茴香揮發(fā)油處理下A.tenuissima

2.5小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima活體抗菌試驗(yàn)

小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima活體抗菌試驗(yàn)如圖4所示，由圖可知，揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima的生長(zhǎng)有明顯抑制作用。隨著揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)的增加，駿棗的腐爛率明顯減少，而對(duì)照組幾乎所有的紅棗都腐爛，當(dāng)揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為1.25 mL/L時(shí)，對(duì)A.alternata感染的紅棗抑制率達(dá)到86.77%。

圖4　小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima

2.6小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜通透性的影響

碘化吡啶(PI)是一種熒光染料，可以評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響，當(dāng)藥物破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，PI可以進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核結(jié)合發(fā)出紅色熒光，本試驗(yàn)用此方法檢測(cè)小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。空白對(duì)照組，(3.12±0.42)%的A.tenuissima細(xì)胞被PI染色，說(shuō)明在不加任何藥物的情況下，PI幾乎無(wú)法穿越A.tenuissima細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合；當(dāng)小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625 mL/L時(shí)PI著色率依次為(20.03±2.14)%、(65.21±3.51)%、(82.63±2.45)%，說(shuō)明小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜有一定的損傷，且與小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)性；當(dāng)揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為1.25 mL/L時(shí)，(98.30±3.56)%的細(xì)胞被PI染色，說(shuō)明該體積分?jǐn)?shù)下小茴香揮發(fā)油可對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜造成較大的損傷或使細(xì)胞膜通透性變大，致使PI能夠透過(guò)膜進(jìn)入胞內(nèi)與DNA結(jié)合。說(shuō)明小茴香揮發(fā)油可能破壞了A.tenuissima細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其細(xì)胞膜失去完整性。

A.空白對(duì)照組Control；B、C、D、E.揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/LEO at 0.156,0.312,0.625,1.25 mL/L,respectively

圖5小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜損傷的影響

Fig.5Effect of EO fromFoeniculumvulgareMill on lesion of plasma membrane ofA.tenuissima

2.7小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜麥角固醇合成的影響

與空白對(duì)照組相比，小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)分別為0.156、0.312、0.625、1.25 mL/L時(shí)，對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜中麥角固醇合成的抑制率分別為(17.21±1.36)%、(35.81±2.35)%、(53.64±3.21)%和(83.26±2.41)%(圖6)。說(shuō)明小茴香揮發(fā)油明顯地影響麥角固醇的合成，且呈體積分?jǐn)?shù)依賴關(guān)系，從而影響細(xì)胞膜的完整性。

圖6　小茴香揮發(fā)油處理下A.tenuissima

2.8小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞內(nèi)容物的影響

同一處理時(shí)間內(nèi)不同體積分?jǐn)?shù)的小茴香揮發(fā)油(0.156、0.312、0.625、1.25mL/L)OD260值(主要是細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì))依次增大(表2)，說(shuō)明小茴香揮發(fā)油活性成分導(dǎo)致A.tenuissimaOD260特征吸收值物質(zhì)的泄露，細(xì)胞內(nèi)容物與體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)；同一體積分?jǐn)?shù)不同處理時(shí)間(2 h、4 h、6 h、8 h)OD260值也依次增大(表2)，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)容物與藥物處理時(shí)間呈正相關(guān)?？梢?，揮發(fā)油處理A.tenuissima后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露，從而導(dǎo)致A.tenuissima死亡。

Table 2Substance effect of EO onA.tenuissima

揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)/(mL/L)EOvolumefractionOD2602h4h6h8h0.1560.0216±0.0140.0471±0.0050.0531±0.0020.0821±0.0080.3120.0903±0.0110.1118±0.0150.1236±0.0150.1536±0.0180.6250.2416±0.0120.3913±0.0130.5403±0.0130.8301±0.0151.250.3410±0.0150.4963±0.0120.6410±0.0190.9413±0.016

3結(jié)論與討論

據(jù)Zeng等[17]報(bào)道，反式茴香腦和蒎烯為小茴香揮發(fā)油主要成分，本試驗(yàn)采用微量稀釋法測(cè)得小茴香揮發(fā)油及其主要成分反式茴香腦和蒎烯對(duì)A.tenuissima最低抑菌體積分?jǐn)?shù)分別為0.312、0.312和0.625 mL/L。從本試驗(yàn)結(jié)果可知，小茴香揮發(fā)油、反式茴香腦和蒎烯具有抗A.tenuissima活性。小茴香揮發(fā)油具有抗A.tenuissima效果主要?dú)w結(jié)為揮發(fā)油中的主要成分反式茴香腦和蒎烯，國(guó)外研究者也報(bào)道反式茴香腦和蒎烯具有抗微生物活性[18-20]。

綜合抗菌試驗(yàn)可知，小茴香揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為1.25 mL/L時(shí)對(duì)A.tenuissima菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和生物量的生成抑制率大于90%。小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima離外抗菌指標(biāo)表明小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima具有較強(qiáng)抑制作用，活體試驗(yàn)結(jié)果也表明揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima的生長(zhǎng)有抑制作用，揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)為1.25 mL/L時(shí)，對(duì)A.alternata感染的紅棗抑制率達(dá)到86.77%，在同一體積分?jǐn)?shù)下，體外抗菌試驗(yàn)結(jié)果低于活體抗菌試驗(yàn)結(jié)果，可能是因?yàn)轵E棗營(yíng)養(yǎng)成分高于培養(yǎng)基成分。

細(xì)胞膜是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)之一，且其有重要生理功能，比如維持穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞等。許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[ 21-22]植物揮發(fā)油對(duì)病原細(xì)胞膜有損傷而達(dá)到抗菌作用。 本試驗(yàn)通過(guò)PI染色試驗(yàn)、麥角固醇合成抑制試驗(yàn)、細(xì)胞內(nèi)容物泄露試驗(yàn)證實(shí)小茴香揮發(fā)油對(duì)A.tenuissima細(xì)胞膜損壞而達(dá)到抗菌作用，說(shuō)明細(xì)胞膜是其抗菌靶點(diǎn)之一，小茴香揮發(fā)油進(jìn)入A.tenuissima細(xì)胞內(nèi)后，是否影響產(chǎn)生能量的線粒體有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)首次研究小茴香揮發(fā)油對(duì)紅棗黑斑病菌(A.tenuissima)抗菌活性及對(duì)其細(xì)胞膜的影響，由試驗(yàn)結(jié)果可得小茴香揮發(fā)油通過(guò)破壞A.tenuissima細(xì)胞膜而達(dá)到抗菌作用。

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Received 2015-06-18Returned2015-07-12

Foundation itemProgram of Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources(No.BRZD1205).

First authorMA Jiangfeng,male,master.Research area:plant protection.E-mail:30768050@qq.com

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕Responsible editor:PAN Xueyan)

Antifungal Activity and Preliminary Mechanism of Essential Oil fromFoeniculumvulgareMill onAlternariatenuissima

MA Jiangfeng1,2and ZENG Hong1

(1. Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin of Xinjiang Production&Construction Corps/College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang843300，China；2.General Station of Agricultural Extension of XJPCC,Urumqi830011,China)

AbstractThe objective of this study is to assess the fennel seeds essential oil (EO) against Alternaria tenuissima and its mechanism of action on A.tenuissima. The microbroth dilution method was used in the minimal inhibitory volume fraction (MIVF).The antifungal efficacy of EO from fennel seeds against A.tenuissima had been proven through in vitro (mycelial growth,spore germination and mycelium mass) and in vivo tests.The results showed EO from fennel was active in vitro against A.tenuissima and MIVF was 0.312 mL/L.Mycelial growth,mycelium biomass and spore germination were inhibited by the EO from fennel in a dose-dependent manner. The results also showed that the treatment of cells with EO from fennel,propidium iodide penetrated A.tenuissima through a lesion in its plasma membrane. Thus,the results indicated that EO from fennel could be potential source of plant-derived fungicides to control certain important A.tenuissima.

Key wordsFoeniculum vulgare Mill; Alternaria tenuissima；Anti-A.tenuissima activity；Plasma membrane

Corresponding authorZENG Hong,female,Ph.D.Research area:patherological microbiology.E-mail:zenghong0705@163.com

中圖分類號(hào)S435.621

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)03-0450-08

通信作者：曾紅，女，博士，研究方向?yàn)樗幱梦⑸铩-mail：zenghong0705@163.com

基金項(xiàng)目：塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(BRZD1205)。

收稿日期：2015-06-18修回日期：2015-07-12

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1611.036.html

第一作者：馬江鋒，男，碩士，研究方向?yàn)橹参锉Ｗo(hù)。E-mail：30768050@qq.com