蕓芥果膠酸裂解酶基因的克隆及序列分析

方　彥，楊　剛，孫萬(wàn)倉(cāng)，武軍艷，劉自剛，曾秀存，李學(xué)才，董　云

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 研究測(cè)試中心，蘭州　730070；2.甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，蘭州　730070；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，蘭州　730070)

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蕓芥果膠酸裂解酶基因的克隆及序列分析

方彥1，2，楊剛2，孫萬(wàn)倉(cāng)2，武軍艷2，劉自剛2，曾秀存2，李學(xué)才2，董云3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 研究測(cè)試中心，蘭州730070；2.甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，蘭州730070；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，蘭州730070)

摘要采用RACE 技術(shù)從蕓芥自交親和系花藥中克隆出果膠酸裂解酶(Pectate lyases，PL)基因，全長(zhǎng)1 657 bp，其完整開(kāi)放閱讀框(Open Read Frame, ORF)為1 371 bp，編碼456個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量51.179 ku，等電點(diǎn)9.42。序列比對(duì)結(jié)果表明，該蛋白與其他植物的PL蛋白具有較高的同源性，因此命名為EsPL。進(jìn)化樹(shù)分析表明，蕓芥EsPL基因與十字花科蕓薹屬植物甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜的PL基因親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，EsPL在蕓芥開(kāi)花后自交親和系花藥中的表達(dá)量顯著高于自交不親和系花藥中表達(dá)量，該基因可能在蕓芥自交親和性狀調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞蕓芥；EsPL基因；RACE；序列分析

蕓芥(ErucasativeMill) 又名芝麻菜，屬十字花科芝麻菜屬，莖葉可作飼料、種子可榨油，是干旱半干旱地區(qū)的重要油料作物和節(jié)水作物。蕓芥野生性強(qiáng)，對(duì)干旱具有優(yōu)異的抵御能力，是十字花科植物抗旱育種的重要資源[1-3]，其以孢子體自交不親和的方式進(jìn)行繁殖，這種繁殖方式不利于蕓芥產(chǎn)量潛力的發(fā)揮[4]。已有研究[5-7]報(bào)道，蕓芥中存在自交親和突變體。植物的自交親和性利于自身有益基因的保留和累加，增強(qiáng)抗逆性，提高產(chǎn)量；并且利于選育優(yōu)良自交系、種質(zhì)保純，增加品種的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)種子的使用壽命[8-9]。因此，研究已發(fā)現(xiàn)的蕓芥自交親和基因資源遺傳機(jī)制以及克隆控制自交親和性的特異基因，在生物學(xué)和育種等方面具有重要意義。

自交親和性產(chǎn)生于自交不親和性，植物自交親和機(jī)制的研究是在對(duì)自交不親和機(jī)制深入理解的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。植物孢子體自交不親和的研究主要集中在蕓薹屬植物，前人對(duì)蕓薹屬植物自交不親和研究發(fā)現(xiàn)，其自交不親和性受S位點(diǎn)復(fù)等位基因控制[10-11]。Richards等[12]、Sampson[13]和Fang等[14]曾分別對(duì)Brassicacampestrisssp.oleifera、raphanusraphanistrum和SinapisalbaS等位基因的分布和遺傳做過(guò)深入研究?，F(xiàn)已分離到3類與S位點(diǎn)連鎖的基因，分別編碼位于雌蕊中的SRK(Slocus receptor kinase, S位點(diǎn)受體酶)和SLG(S-locus glycoprotein, S位點(diǎn)糖蛋白)，位于雄蕊中的SCR(S-locus cysteinrich protein，S位點(diǎn)富半胱氨酸蛋白)[15-18]。自交不親和的實(shí)質(zhì)是雌蕊細(xì)胞對(duì)同源花粉認(rèn)識(shí)或拒絕的分子過(guò)程[19]，涉及雌蕊和花粉相互識(shí)別的問(wèn)題。自交不親和植物自交親和性的產(chǎn)生不僅與S位點(diǎn)連鎖基因發(fā)生片段缺失有關(guān)[20-22]，同時(shí)還受其他因子的調(diào)控[23]。在花粉和柱頭相互作用過(guò)程中，花粉萌發(fā)后，柱頭組織就與花粉管進(jìn)行信號(hào)交流，一些負(fù)責(zé)降解果膠質(zhì)的酶具有破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、幫助花粉管伸長(zhǎng)的作用[24-25]，這些都會(huì)影響到自交親和的產(chǎn)生。 以往對(duì)蕓芥親和性的研究和探討主要集中在生理生化[5]、遺傳分析[6]和蛋白質(zhì)差異表達(dá)[26]等方面，而對(duì)蕓芥親和性相關(guān)基因的分離和表達(dá)調(diào)控途徑等方面的研究較少，目前分離和鑒定與自交親和相關(guān)基因的工作中，除陳姣榮等[7]報(bào)道木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶/水解酶基因與蕓芥自交親和性的調(diào)控相關(guān)外，未見(jiàn)其他相關(guān)報(bào)道。為獲得蕓芥自交親和相關(guān)基因的表達(dá)情況，前期的研究[27]已通過(guò)差異顯示分析技術(shù)獲得果膠酸裂解酶基因的EST片段。本文擬在此基礎(chǔ)上，采用快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，從自交親和的蕓芥花藥中克隆EsPL基因全長(zhǎng)cDNA。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量方法研究其在蕓芥自交親和系(Self-compatibility, SC)和自交不親和系(Self-incompatibility, SI)開(kāi)花前后柱頭、花藥的表達(dá)模式，并進(jìn)行序列分析，以期為蕓芥自交親和分子機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料以蕓芥自交不親和系(SI)和突變體自交親和系(SC)為試驗(yàn)材料，大田統(tǒng)一種植、管理，蕓芥現(xiàn)蕾時(shí)套袋，開(kāi)花前花蕾長(zhǎng)約5 mm時(shí)剝蕾，分別取SI和SC的花藥和柱頭；開(kāi)花后在花蕾開(kāi)放當(dāng)天分別取SI和SC的花藥和柱頭，所采樣品在液氮中速凍， -80 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2酶、試劑盒和主要化學(xué)試劑5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒購(gòu)自Clontech公司；KOD FX Neo為TOYOBO公司出品的高保真DNA聚合酶；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；普通的化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2總RNA提取及cDNA第一鏈合成

按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取蕓芥SI和SC開(kāi)花前后花藥和柱頭的總RNA，電泳檢測(cè)完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度， -80 ℃冰箱保存，備用。

RACE cDNA合成：根據(jù)Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit的操作說(shuō)明書，以蕓芥SC開(kāi)花后花藥總RNA 為模板，利用試劑盒提供的逆轉(zhuǎn)錄引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成3′-RACE Ready cDNA第一鏈；采用Invitrogen公司的5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒操作說(shuō)明書，以蕓芥SC開(kāi)花后花藥總RNA 為模板，使用SUPERSCRIPT II 反轉(zhuǎn)錄酶和引物GSP1進(jìn)行5′-RACE Ready cDNA 第一鏈的合成，并使用RNase Mix對(duì)合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理。

1.3RACE

1.3.1引物設(shè)計(jì)已知蕓芥SC開(kāi)花后花藥的EsPL基因部分序列為甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室差異顯示分析獲得[27]，利用Primer 5.0軟件根據(jù)已知的部分序列設(shè)計(jì)5′RACE特異巢式引物和3′RACE引物(表1)。

表1　 5′RACE和 3′RACE引物序列

1.3.2EsPL基因 5′端序列的獲得5′RACE 根據(jù)Invitrogen 公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0試劑盒步驟操作，以5′-RACE Ready cDNA為模板，用引物GSP2和試劑盒附帶的橋連鉚釘引物AAP對(duì)已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行1擴(kuò)PCR，以1擴(kuò)PCR產(chǎn)物為模板，用引物GSP3和試劑盒附帶的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行2擴(kuò)PCR，將第2輪PCR產(chǎn)物電泳，并將目的條帶切膠回收，連接pMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3EsPL基因3′端序列的獲得3′RACE 根據(jù)Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒步驟進(jìn)行，以3′-RACE Ready cDNA 為模板，用引物3′604-1和引物UPM進(jìn)行1擴(kuò)PCR，以1擴(kuò)PCR 產(chǎn)物為模板，用引物3′604-2和引物UPM進(jìn)行2擴(kuò)PCR，將第2輪PCR產(chǎn)物電泳，并將目的條帶切膠回收，連接pMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.3.4全長(zhǎng)cDNA序列的拼接、編碼區(qū)(CDS)的克隆與序列分析使用DNAMAN軟件將DDRT-PCR分離的差異片段、3′RACE和5′RACE拼接，分析獲得目的基因的全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)RACE擴(kuò)增獲得的EsPL基因序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)上游引物P487F ( 5′- CGCGGATCCATGGCGGTTGCTTATTCG-3′) 和下游引物P487R ( 5′- GCTCTAGAGCAGGACTTGCCTGGTTTAC-3′) , 以蕓芥SC開(kāi)花后花藥組織RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板， 進(jìn)行EsPL基因CDS序列擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性5 min； 98 ℃10 s，60 ℃30 s，68 ℃1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸5 min。將全長(zhǎng)cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列登錄到NCBI網(wǎng)站，用BLAST程序進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的生物信息學(xué)分析。

1.4蕓芥EsPL基因編碼蛋白質(zhì)功能分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析、拼接；NCBI在線氨基酸序列同源性比對(duì)；聯(lián)網(wǎng)(httP://www.nebi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找開(kāi)放閱讀框；利用ProtParam、TMHMM、Signalp和SOPMA軟件進(jìn)行理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段預(yù)測(cè)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用NCBI在線CDD進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

依據(jù)獲得的EsPL基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，分別設(shè)計(jì)正向(CAACGCGATTGATAAATGCTGG)和反向(ATGCGTCGGTGACTACGTAGAT)特異引物，Actin基因(正向：TCACCAGAGTCGAGCACA； 反向： TTCTTACCCTCAAGTATCCG)作為內(nèi)參基因，用實(shí)時(shí)熒光定量分析果膠酸裂解酶在蕓芥SI和SC開(kāi)花前后花藥和柱頭中的表達(dá)模式。試驗(yàn)操作和計(jì)算方法同文獻(xiàn)[27]。

2結(jié)果與分析

2.1蕓芥EsPL基因的RACE分析

由于EsPL基因的部分序列已經(jīng)獲得，本研究只進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE的PCR 擴(kuò)增。5′RACE 擴(kuò)增得到一個(gè)大小為1 318 bp的片段(圖1)。將此條帶切膠回收純化后與pMD18T連接，轉(zhuǎn)化后對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與差異顯示擴(kuò)增得到的蕓芥EsPL基因部分片段的重疊部分的核苷酸序列完全相同，并且該序列與白菜型油菜和甘藍(lán)型油菜等的果膠酸裂解酶基因均具有較高同源性，由此可初步判定其為蕓芥EsPL基因的一個(gè)片段。同時(shí)，在起始密碼子ATG前有103 bp的5′非翻譯區(qū)序列((5′-untranslated region,5′UTR)。

3′RACE 擴(kuò)增得到一個(gè)大小約300 bp的片段(圖2)。將此條帶切膠回收純化后與pMD18T連接，轉(zhuǎn)化后對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與差異顯示擴(kuò)增得到的蕓芥EsPL基因部分片段的重疊部分的核苷酸序列完全相同，由此可初步判定其為蕓芥EsPL基因的一個(gè)片段。同時(shí)，在終止密碼子TAG 后有183 bp 的3′非翻譯區(qū)序列(3′-untranslated region,3′UTR)，包括68 bp的polyA序列。

1.巢式PCR擴(kuò)增EsPL基因的5′末端結(jié)果Result of 5′RACE Nest PCR；M.DL2000 Marker

圖1巢式PCR擴(kuò)增EsPL基因的5′末端結(jié)果

Fig.1Nest PCR analysis for theEsPL5′RACE

1.巢式PCR擴(kuò)增EsPL基因的3′末端結(jié)果Result of 3′RACE Nest PCR； M.DL2000 Marker

圖2巢式PCR擴(kuò)增EsPL基因的3′末端結(jié)果

Fig.2Nest PCR analysis for theEsPL3′RACE

2.2全長(zhǎng)cDNA序列的拼接與編碼區(qū)(CDS)片段的獲得

將DDRT-PCR分離得到的中間片段、5′RACE和3′RACE擴(kuò)增得到的序列進(jìn)行分析拼接后，得到一條1 657 bp的序列，包含1個(gè)長(zhǎng)1 371 bp的完整開(kāi)放閱讀框(圖3)，起始密碼子位于104位，終止密碼子在1 474位，編碼456個(gè)氨基酸，5′非編碼區(qū)長(zhǎng)103 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)183 bp，在3′非編碼區(qū)存在l個(gè)mRNA的加尾信號(hào)AATAAA。

方框?yàn)槠鹗济艽a子ATGATG is indicated in box； *為終止密碼子TGATGA is marked by sterisk

圖3EsPL基因的核酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列

Fig.3Nucleotide sequence and deduced amino a

cid sequence ofEsPLgene

為進(jìn)一步確證蕓芥EsPL基因拼接正確與否，根據(jù)拼接所得果膠酸裂解酶全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增基因的編碼區(qū)，序列全長(zhǎng)約1 380 bp(圖4)，回收目的片段，與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化后，對(duì)質(zhì)粒pMD18-T-EsPL進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，結(jié)果表明，質(zhì)粒PCR條帶為1 529 bp，酶切條帶約為1 378 bp，對(duì)質(zhì)粒pMD18-T-EsPL測(cè)序驗(yàn)證，序列長(zhǎng)1 380 bp，與NCBIgenbank中同源基因及其RACE全長(zhǎng)序列比對(duì)結(jié)果一致，將該序列命名為EsPL基因，并提交 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KP064392。

1～2.EsPL基因全長(zhǎng)cDNA 序列擴(kuò)增產(chǎn)物Product of the complete cDNA sequence ofEsPL；M.DL2000 Marker

圖4EsPL基因全長(zhǎng)cDNA電泳檢測(cè)

Fig.4Complete cDNA ofEsPLgene

2.3蕓芥EsPL基因預(yù)測(cè)蛋白的生物信息學(xué)分析

EsPL基因編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為51.179 ku，理論等電點(diǎn)為9.42，蕓芥EsPL基因編碼蛋白由20種氨基酸組成，其中以Gly所占比例最高，為9.0%；含有55個(gè)堿性氨基酸(K、R)，39個(gè)酸性氨基酸(D、E)，144 個(gè)疏水氨基酸(A、F、I、L、V、W)，133個(gè)極性氨基酸(C、N、Q、S、T、Y)，131個(gè)帶電荷的氨基酸(C、D、E、H、K、R、Y)；預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)為31，是一個(gè)穩(wěn)定蛋白(穩(wěn)定系數(shù)<40時(shí)穩(wěn)定)；脂肪系數(shù)為75.26%，總平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity，GRAVY)為-0.406，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白。

疏水性分析表明(圖5)，EsPL編碼的蛋白質(zhì)是親水性蛋白。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，蕓芥EsPL基因編碼的蛋白存在信號(hào)肽，信號(hào)肽剪切位點(diǎn)位于第28與第29位氨基酸殘基之間，是分泌蛋白。用TMHMM在線軟件預(yù)測(cè)EsPL蛋白跨膜曲線可以更直觀的反映跨膜蛋白情況，發(fā)現(xiàn)N端有一個(gè)跨膜蛋白(圖6)。EsPL蛋白含有約24.56%的α-螺旋(α-helix)，29.61%的延伸鏈(extended strand )，13.16%的β-轉(zhuǎn)角(beta turn)和32.68%的無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)(圖7)。

圖5　蕓芥EsPL蛋白的親水性與疏水性預(yù)測(cè)

圖6　蕓芥EsPL蛋白跨膜區(qū)段的預(yù)測(cè)分析

藍(lán)色.α-螺旋Blue.α-helix； 紫色.無(wú)規(guī)則卷曲Purple.Random coil；紅色.延伸鏈Red.Extended strand；綠色.β-轉(zhuǎn)角Green.β-turn

圖7 蕓芥EsPL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Fig.7Predicted second structure of EsPL protein

對(duì)蕓芥EsPL基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域功能分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有2個(gè)PL家族特有的保守結(jié)構(gòu)域，分別為N端第29～84位氨基酸之間的Pec-lyase-N 結(jié)構(gòu)域和C端第177～371位氨基酸之間的Amb-all結(jié)構(gòu)域，其中Pec-lyase-N 結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠z酸裂解酶N家族，Amb-all結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠z酸裂解酶C家族，該家族酶具有一個(gè)右手β-螺旋結(jié)構(gòu)(圖8)。

2.4蕓芥EsPL基因編碼蛋白的同源性及進(jìn)化樹(shù)分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇7個(gè)其他十字花科植物的PL基因序列，用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，結(jié)果顯示，蕓芥EsPL基因與其他植物的PL基因具有較高的同源性。蕓芥EsPL與甘藍(lán)型油菜(CDY09356.1 )的同源性為90.0% ；與白菜型油菜(XP_009129128.1)同源性為90% ；與甘藍(lán)型油菜(CDY41679.1)同源性為90%；與擬南芥(NP_178375.1)同源性為82%；與琴葉擬南芥(XP_002875142.1)同源性81%(圖9)。構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)(圖10)進(jìn)一步證實(shí)蕓芥EsPL基因編碼蛋白與十字花科蕓薹屬植物甘藍(lán)型油菜(CDY09356.1 )、白菜型油菜(XP_009129128.1)的PL蛋白親緣關(guān)系更近。

圖8　蕓芥EsPL蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

1.蕓芥Erucasativa；2.甘藍(lán)型油菜Brassicanapus(CDY09356.1)；3.白菜型油菜Brassicarapa(XP_009129128.1)；4.甘藍(lán)型油菜Brassicanapus(CDY41679.1)；5.擬南芥Arabidopsisthaliana(4NP_178375.1)；6.琴葉擬南芥Arabidopsislyratasubsp.lyrata(XP_002875142.1)；7.白菜型油菜Brassicarapa(XP_009101245.1)；8.擬南芥Arabidopsisthaliana(NP_172894.1)

圖9EsPL與同源蛋白序列多重比對(duì)

Fig.9The multiple sequence alignment of EsPL with homologous proteins

2.5果膠酸裂解酶基因在蕓芥SI和SC開(kāi)花前后的表達(dá)分析

以蕓芥的SI開(kāi)花前花藥、SC開(kāi)花前花藥、SI開(kāi)花后花藥、SC開(kāi)花后花藥、SI開(kāi)花前柱頭、SC開(kāi)花前柱頭、SI開(kāi)花后柱頭和SC開(kāi)花后柱頭為分析對(duì)象，Actin作為內(nèi)參基因，對(duì)上述不同組織部位中EsPL基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：EsPL基因在SC開(kāi)花后花藥中的表達(dá)量最高(圖11)，其次為SC開(kāi)花后柱頭中和SC開(kāi)花前花藥中。開(kāi)花前與開(kāi)花后SC花藥中EsPL基因表達(dá)量均顯著高于SI花藥中表達(dá)量，為SI開(kāi)花前花藥中的26.18倍、SI開(kāi)花后花藥中的62.82倍。SC開(kāi)花后柱頭中PL基因表達(dá)量是SI開(kāi)花后柱頭中的5.68倍。

圖10　十字花科植物PL氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

1.SI開(kāi)花前花藥Anther of SI pre-bloom;2.SC開(kāi)花前花藥Anther of SC pre-bloom;3.SI開(kāi)花后花藥Anther of SI after flowering;4.SC開(kāi)花后花藥Anther of SC after flowering;5.SI開(kāi)花前柱頭Stigma of SI pre-bloom;6.SC開(kāi)花前柱頭Stigma of SC pre-bloom;7.SI開(kāi)花后柱頭Stigma of SI after flowering;8.SC開(kāi)花后柱頭 Stigma of SC after flowering

柱狀圖上的不同字母代表差異達(dá)到顯著水平(P<0.05) Histograms capped with different letters indicate significant difference atP<0.05

圖11果膠酸裂解酶基因在蕓芥花藥和柱頭的差異表達(dá)

Fig.11Differential expression of pectate

lyase gene in anther and stigma

3討 論

果膠酸裂解酶是一種能降解植物細(xì)胞壁、導(dǎo)致植物組織軟化的解聚酶[28]。它主要通過(guò)β-轉(zhuǎn)移和消除機(jī)制等作用于果膠物質(zhì)。果膠主要存在于植物的初生細(xì)胞壁中，參與植物花粉發(fā)育的多個(gè)過(guò)程。對(duì)果膠酸裂解酶的相關(guān)功能研究發(fā)現(xiàn)，在植物花粉管萌發(fā)和延伸過(guò)程中，花粉壁中的果膠酸裂解酶具有能夠促進(jìn)花粉管萌發(fā)、伸長(zhǎng)，破壞花柱轉(zhuǎn)導(dǎo)組織細(xì)胞壁、降解柱頭表面的角質(zhì)膜，使花粉管順利到達(dá)胚囊[29-30]的作用。這主要通過(guò)果膠酸裂解酶降解花粉內(nèi)壁果膠后促進(jìn)植物花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)。另外，果膠酸裂解酶也可能通過(guò)其他途徑促進(jìn)花粉管伸長(zhǎng)，這一過(guò)程主要是通過(guò)降解傳遞系統(tǒng)的果膠物，利用降解產(chǎn)物作為花粉管形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，不斷促進(jìn)其持續(xù)伸長(zhǎng)。有研究[31-32]表明，適宜濃度的外源微生物果膠酶對(duì)番茄花粉管伸長(zhǎng)具有顯著的促進(jìn)作用 。蔣晶晶[33]采用同源克隆的方法獲得白菜類果膠酸裂解酶基因 BcPLL9，對(duì) BcPLL9的表達(dá)進(jìn)行反義RNA抑制后，花粉管生長(zhǎng)無(wú)力且長(zhǎng)度變短，到達(dá)胚珠的花粉管比例降低，植株結(jié)籽數(shù)明顯減少。

孢子體型自交不親和性在細(xì)胞學(xué)上表現(xiàn)為自花的花粉不能在自己的柱頭上正常萌發(fā)，或萌發(fā)后在柱頭乳突細(xì)胞上纏繞而無(wú)法進(jìn)入柱頭，花粉和雌蕊之間表現(xiàn)為相互抑制的作用[34]。對(duì)蕓薹屬植物親和研究發(fā)現(xiàn)，花粉和柱頭的識(shí)別要經(jīng)歷接觸、花粉水化、花粉壁滲出蛋白質(zhì)、花粉活化萌發(fā)和角質(zhì)被穿透花粉管伸入等5個(gè)階段。在此過(guò)程中，最關(guān)鍵的是柱頭表膜接受到花粉壁蛋白信號(hào)后的識(shí)別過(guò)程，把關(guān)的是柱頭角質(zhì)層。如果是親和花粉，釋放出的壁蛋白中含有角質(zhì)酶，經(jīng)過(guò)表膜活化后，可分解表膜下的角質(zhì)層，使花粉管伸入柱頭[35]。蕓芥屬于孢子體型自交不親和植物，自交授粉后花粉萌發(fā)數(shù)較少，柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)有胼胝質(zhì)沉積反應(yīng)，且只有少量花粉管能穿入柱頭[36]。本研究中果膠酸裂解酶是在蕓芥SC開(kāi)花后花藥中分離出的差異表達(dá)基因，熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，它在蕓芥開(kāi)花后SC花藥中的表達(dá)量顯著高于SI花藥中表達(dá)量，因此它可能是主要負(fù)責(zé)降解果膠質(zhì)的酶，通過(guò)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)促進(jìn)花粉管伸長(zhǎng)，同時(shí)降解花粉壁胼胝質(zhì)的沉積，促進(jìn)花粉從柱頭吸水，這樣花粉內(nèi)壁就會(huì)被柱頭上的蛋白質(zhì)溶解，并開(kāi)始萌發(fā)使花粉管進(jìn)入柱頭，蕓芥表現(xiàn)為自交親和。

4結(jié) 論

本研究通過(guò)RACE 方法從蕓芥自交親和系開(kāi)花后花藥中克隆得到EsPL基因全長(zhǎng)cDNA。該基因具有完整的開(kāi)放閱讀框，編碼456 個(gè)氨基酸，其編碼的蛋白質(zhì)5′端具有信號(hào)肽和跨膜區(qū)；實(shí)時(shí)熒光定量分析表明，EsPL在蕓芥開(kāi)花后SC花藥中的表達(dá)量顯著高于SI花藥中表達(dá)量，初步說(shuō)明EsPL基因在蕓芥SI和SC性狀調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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Received 2015-06-29Returned2015-07-22

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No.30960199，No.31260334); China Agriculture Research System (No.CARS-13); Gansu Provincial Engineering Research Center of Rapeseed (No.1306NTGA022); Gansu Provincial Natural Science Foundation((No.1308RJZA205).

First authorFANG Yan,female,Ph.D,associate research fellow.Research area:plant genetics and breeding.E-mail:ffyv@163.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Cloning,Sequence Analysis ofEsPLGene fromErucasativeMill

FANG Yan1,2，YANG Gang2， SUN Wancang2， WU Junyan2，LIU Zigang2， ZENG Xiucun2， LI Xuecai2and DONG Yun3

(1.Instrumental Research and Analysis Center of Gansu Agricultural University, Lanzhou730070,China;2.Rape Engineering and Technology Research Center of Gansu,Lanzhou730070,China;3.Crop Institute of Gansu Agricultural Academy, Lanzhou730070,China)

AbstractThe full-length cDNA of EsPL was obtained by the technology of rapid amplification of cDNA ends (RACE).The full-length cDNA was 1 657 bp, containing a 1 371 bp opening reading frame(ORF).The deduced protein was 456 amino acids with molecular mass 51.179 ku and isoelectric point 9.42.The sequence aligment demonstrated that EsPL was high identity with other PL proteins from other species.So it was named the EsPL.Phylogram tree showes that there were closest evolutionary relationship of Brassica napus, Brassica rapa and Eruca sative Mill gene.Analysis by real-time PCR indicated that EsPL gene expression levels in SC anther is significant higher than SI anther after flowering,which suggested that EsPL played an important role in SI and SC characteristics of regulation of Eruca sative Mill.

Key wordsEruca sative Mill; EsPL gene; RACE;Sequence analysis

Corresponding authorSUN Wancang, male,Ph.D,professor.Research area:rapeseed breeding and cruciferae germplasm resources research.E-mail:18293121851@163.com

中圖分類號(hào)Q781

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)03-0386-10

通信作者：孫萬(wàn)倉(cāng)，男，博士，教授，研究方向?yàn)橛筒擞N及十字花科種質(zhì)資源。E-mail:18293121851@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(30960199，31260334)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13)；甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心(1306NTGA022)；甘肅省自然科學(xué)基金(1308RJZA205)。

收稿日期：2015-06-29修回日期：2015-07-22

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.018.html

第一作者：方彥，女，博士，副研究員，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail:ffyv@163.com