玉米ZmPP6C基因的克隆及其響應(yīng)光質(zhì)和脅迫處理的表達(dá)模式分析

原換換　孫廣華　閆　蕾　郭　林　樊曉聰,　肖　陽孟凡華　宋梅芳,4　詹克慧　楊青華,*　楊建平,,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081;4北京市輻射中心, 北京 100875

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玉米ZmPP6C基因的克隆及其響應(yīng)光質(zhì)和脅迫處理的表達(dá)模式分析

原換換1,2,**孫廣華1,2,**閆蕾2郭林2樊曉聰1,2肖陽3孟凡華2宋梅芳2,4詹克慧1楊青華1,*楊建平1,2,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院, 北京 100081;4北京市輻射中心, 北京 100875

摘要:絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶6亞基(catalytic subunits of Ser/Thr protein phosphatase 6, PP6C)是PP6全酶的催化亞基。在模式植物擬南芥中的研究表明, PP6C參與生長素極性運(yùn)輸、脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的開花調(diào)控。為了明確玉米絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶6亞基(ZmPP6C)的蛋白結(jié)構(gòu)特征與同源蛋白間的進(jìn)化關(guān)系, 采用

RT-PCR方法克隆了ZmPP6C的全長基因。序列分析表明, ZmPP6C開放閱讀框?yàn)?12個核苷酸, 編碼303個氨基酸殘基, 包含PP2A的催化亞基PP2Ac結(jié)構(gòu)域; 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, PP6C蛋白在進(jìn)化上較為保守, 并且與高粱的PP6C蛋白相似性更高。對玉米自交系B73的ZmPP6C基因進(jìn)行器官特異性表達(dá)分析表明, 其表達(dá)量在成株期葉片中最高, 是根中的7.9倍; ZmPP6C能夠響應(yīng)不同光質(zhì)處理, 且受遠(yuǎn)紅光和紅光的影響較大; 也能響應(yīng)長日和短日處理,在長日條件下的光照和黑暗階段各有一個明顯的表達(dá)高峰, 在短日條件下的光照和黑暗階段分別有2個和3個表達(dá)峰值; 同時, ZmPP6C還響應(yīng)高滲透、鹽漬和淹水等脅迫處理, 出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)。結(jié)果表明, ZmPP6C在玉米光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、開花誘導(dǎo)與脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用, 其分子與生化機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

關(guān)鍵詞:玉米; 絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶; 表達(dá)模式分析; 光敏色素; 光信號途徑; 非生物脅迫

北京市自然科學(xué)基金(重點(diǎn))項(xiàng)目(6151002), 國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08010-002), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31570268, 31170267)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目的資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation (6151002), the Major Project of China on New Varieties of GMO Cultivation (2014ZX08010-002), the National Natural Science Foundation of China (31570268, 31170267) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP) of CAAS.

第一作者聯(lián)系方式: 原換換, E-mail: yuanhuanhuan111@126.com, Tel: 010-82105851; 孫廣華, E-mail: guanghuanuli@163.comm, 010-82105851

蛋白磷酸酶的作用和蛋白激酶相反, 它是催化已磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化反應(yīng)的一類酶, 與蛋白激酶相對應(yīng)存在, 共同組成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性的開關(guān)系統(tǒng)[1,2]。蛋白磷酸酶6(PP6)是一種類似于PP2A的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶[1,2], 參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、形態(tài)建成和細(xì)胞循環(huán)諸多過程[3]。PP6全酶包括催化亞基PP6C、調(diào)節(jié)亞基PP2A和結(jié)構(gòu)蛋白SAPS。而PP2A全酶包括2個調(diào)節(jié)亞基PP2Aa和PP2Ab, 以及催化亞基PP2Ac,其中催化亞基PP2Ac 類磷酸酶蛋白在逆境中發(fā)揮著重要作用[1,4-6]。在模式植物擬南芥中有AtFyPP1 和AtFyPP32個高度同源的PP6C 催化亞基基因; 二者均能與光敏色素磷酸酶2A結(jié)合, 調(diào)控植物開花[6]。AtFyPP3過量表達(dá)株系延遲開花, 而atftpp3缺失突變體則導(dǎo)致開花提前[6]。AtFyPP3的轉(zhuǎn)錄受到光照節(jié)律的調(diào)節(jié), 長日條件下AtFyPP3的表達(dá)明顯高于短日條件[6]。酵母雙雜測試證實(shí)豌豆PP6能與燕麥的phyA和擬南芥的phyB互作, 體外Pull-down實(shí)驗(yàn)表明豌豆PP6優(yōu)先結(jié)合磷酸化或者Pfr形式的phyA和phyB[7]。以上研究結(jié)果表明PP6C可能通過與光敏色素互作調(diào)節(jié)植物光形態(tài)建成。

研究表明擬南芥的2個PP6C同源蛋白AtFyPP1 和AtFyPP3參與生長素(auxin)的極性運(yùn)輸和ABA (abscisic acid, ABA)介導(dǎo)的脅迫響應(yīng)。生長素主要在植物頂端分生組織中合成, 然后被運(yùn)輸?shù)街参矬w的各個部位; 生長素的極性運(yùn)輸取決于生長素輸出蛋白PIN (PIN-FORMED)的磷酸化水平; 蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶PID (PROTEIN SERINE/THREONINE KINASE PINOID)能促進(jìn)PIN的磷酸化[8-12]。AtFyPP1和AtFyPP3通過負(fù)調(diào)控PID的激酶活性抑制PIN的磷酸化, 進(jìn)而阻遏生長素的極性運(yùn)輸, 導(dǎo)致植物生長發(fā)育遲緩[13]。激素ABA能夠調(diào)節(jié)植物對生物脅迫和非生物脅迫(干旱、鹽、低溫和病原菌等)的響應(yīng)[14-17]。堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子ABI5 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE5)能促進(jìn)種子萌發(fā)以及萌發(fā)后的幼苗生長, 是ABA信號途徑中重要的抑制因子[18-21]。AtFyPP1和AtFyPP3通過ABI5的脫磷酸化來加速其降解, 從而促進(jìn)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。

玉米是集口糧、飼料和工業(yè)原料為一體的重要的多用途作物[22,23], 其產(chǎn)量受光照、水分和溫度等多種環(huán)境因素的制約[23-27]。蛋白磷酸酶在植物逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、有絲分裂和細(xì)胞循環(huán)過程中具重要作用[28-30],而玉米中只有一個蛋白磷酸酶6催化亞基(ZmPP6C),其研究未見報(bào)道。本研究克隆了ZmPP6C基因, 初步分析了ZmPP6C蛋白功能結(jié)構(gòu)域, 在氨基酸水平對其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析, 并對該基因器官表達(dá)特異性及響應(yīng)光和脅迫處理的表達(dá)模式進(jìn)行了較系統(tǒng)的分析。ZmPP6C的表達(dá)能夠響應(yīng)不同光質(zhì)處理, 也能響應(yīng)長日和短日處理; 同時, ZmPP6C還響應(yīng)高滲透、鹽漬和淹水等脅迫處理, 出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)ZmPP6C在玉米光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、開花誘導(dǎo)與脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用, 該結(jié)果將為以后ZmPP6C功能研究及其在玉米分子抗逆育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及樣品處理

選用玉米自交系B73為研究材料(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李新海博士惠贈, 楊建平實(shí)驗(yàn)室繁育并保存)。(1)器官特異性表達(dá)樣品的準(zhǔn)備: 在北京地區(qū)4月下旬于花盆中播種自交系B73的種子、自然條件下生長60 d后分別取成株的葉、莖、根、幼穗、苞葉、花絲、雄花、花柄、葉鞘和葉枕。(2)各種持續(xù)光質(zhì)處理: 將玉米種子消毒殺菌后, 平放在濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中28℃催芽3 d, 挑選萌動一致的種子播種于裝有培養(yǎng)土塑料小盆(長寬高均為8.5 cm) 中, 每小盆播種9顆種子, 分別放于黑暗(Dk)、遠(yuǎn)紅光(FR, 0.5 μmol m–2s–1)、紅光(R, 22.5 μmol m–2s–1)、藍(lán)光(B, 13.0 μmol m?2s?1)和白光(WL, 17.0 μmol m–2s–1)玉米苗子均生長在22℃培養(yǎng)箱中生長。(3)黑暗轉(zhuǎn)換各種光質(zhì): 黑暗中生長13 d后分別轉(zhuǎn)入以上各種光質(zhì)條件下0.25、0.5、1、2、4、8、12和24 h, 分別取樣。(4)長日和短日處理: 玉米幼苗在22℃長日(LD, 16-h-光照/8-h-黑暗)或短日(SD, 8-h-光照/16-h-黑暗)條件下中生長13 d。(5)鹽漬(200 mmol L–1NaCl)和高滲透(20％ PEG-6000)處理: 在正常溫室條件下

(16-h-光照/8-h-黑暗, 22℃)生長13 d后對幼苗以鹽漬(200 mmol L–1NaCl)和高滲透(20％ PEG-6000)分別處理0、1、3、6、12、24和48 h。以正常溫室條件下生長和未經(jīng)處理的苗子作為對照。(6)淹水(灌水沒根)處理: 將正常溫室條件下(22℃)生長到13 d的幼苗,帶缽體一同置水盒中, 水層高出缽體2 cm, 淹水7 d,接著恢復(fù)正常溫室條件, 分別在淹水3、4、5和7 d以及恢復(fù)正常溫室條件后3 d和7 d取樣, 每天取樣時間固定在上午10:00。對照樣品如(5)。(7)用作基因克隆的植物材料為生長在22℃黑暗條件下13 d的幼苗。將所有樣品, 迅速收獲并凍存于–80℃液氮備用。

1.2菌株和載體

大腸桿菌DH5α菌株是本實(shí)驗(yàn)室保存的, 克隆載體pEASY-Blunt-Simple和pESAY-T1 Cloning Kit購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3酶和試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的酶和試劑及購置公司為: ExTaq酶和PrimeSTAR HS酶, TaKaRa (大連)公司; Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo Scientific公司; 限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶, NEB公司; 凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒, 天根生化科技有限公司。

1.4RNA提取及cDNA合成

TRIzol (Invitrogen, USA)法提取各種處理的玉米幼苗總RNA, 經(jīng)DNase I (RNase-free, TaKaRa大連公司)處理后作為模板, 以O(shè)ligo-dT18為引物, 利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。

1.5玉米PP6C的克隆

根據(jù)NCBI 中的ZmPP6C (NM_001175500)的序列設(shè)計(jì)引物(ZmPP6C-F5′-TCTAGAATGGATGTG GATCTGTGGAT-3′)和ZmPP6C-R (5′-GGATCCTAG GAAATATGGGACTGCGG-3′), 用黑暗下13 d幼苗的cDNA為模板, 擴(kuò)增得到912 bp的片段, 克隆到pEASY-Blunt-Simple載體上, 得到pEASY-ZmPP6C。經(jīng)PCR和酶切鑒定后測序(蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司北京分公司), 測序正確后備用。

1.6玉米PP6C的基因序列比對、結(jié)構(gòu)預(yù)測與進(jìn)化樹分析

采用NCBI-Blast網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)獲得玉米(Zea mays)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、短柄草(Brachypodium distachyom)、油菜(Brassica napus)、大白菜(Brassica rapa)、棉花(Gossypium raimondii)、大豆(Giycine max)同源蛋白的氨基酸序列。使用DNAMAN Version 6軟件比對ZmPP6C與其他植物氨基酸水平的序列, 用SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析ZmPP6C的結(jié)構(gòu)域。

1.7玉米PP6C表達(dá)的實(shí)時熒光定量RT-PCR (qRT-PCR)分析

以不同處理的“B73”玉米的cDNA第1鏈為模板,玉米Tubulin基因(NM_001174192)為內(nèi)參, 測定ZmPP6C的相對表達(dá)量。根據(jù)ZmPP6C與Tubulin的序列設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物: ZmPP6C_RT-F (5′-TACAAT AGACCATCGGGACAGT-3′)和ZmPP6C_RT-R (5′-GCACGGGAACAAAATCACA-3′); Tubulin_F (5′-AC TTCATGCTTTCGTCCTACGCTCCA-3′)和Tubulin_R (5′-CTGGGAGGCTGGTAGTTGATTC-3′)。按照全式金Trans Start Green qPCR SuperMix試劑盒的說明書操作, 反應(yīng)體系為20 μL。用羅氏Light Cycler 480 II Real-Time PCR System (Roche, 瑞士)進(jìn)行qRT-PCR,按照SYBR Green熒光染料相對定量PCR方法檢測,參照基因的2–ΔΔCt法[31]計(jì)算結(jié)果。經(jīng)3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù), 并以此計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差。

2　結(jié)果與分析

2.1ZmPP6C基因的cDNA的長度為912 bp

根據(jù)NCBI中ZmPP6C的mRNA對應(yīng)cDNA序列(NM_001175500)設(shè)計(jì)引物, RT-PCR得到912 bp左右的DNA片段(圖1-A), 與預(yù)計(jì)擴(kuò)增的ZmPP6C的ORF片段大小一致。將擴(kuò)增片段回收并連接到pEASY Blunt-Simple載體上, 得到重組載體pEASY-ZmPP6C, 經(jīng)PCR鑒定后的克隆再經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切驗(yàn)證,符合要求的克隆經(jīng)酶切應(yīng)具有一條912 bp左右的目的基因條帶及一條3830 bp左右的載體條帶(圖1-B)。最后將上述符合要求的克隆測序顯示, 我們得到cDNA克隆序列與NCBI中ZmPP6C的mRNA對應(yīng)cDNA序列(NM_001175500)完全一致。

2.2PP6C基因家族在雙子葉植物和單子葉植物具有相同結(jié)構(gòu)域和較高一致性

通過PCR的方法得到ZmPP6C的全長cDNA序列, 其ORF包含912個核苷酸殘基, DNAMAN Version 6軟件推測其編碼303個氨基酸殘基、分子量為37.73 kDa的蛋白質(zhì), 等電點(diǎn)4.87 (http://web.expasy.org/

protparam)。使用SMART網(wǎng)站(http://smart.emblheidelberg.de/)對ZmPP6C的結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)ZmPP6C中包含1個PP2Ac結(jié)構(gòu)域(16～287, 絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A的催化域)(圖2), 預(yù)測其還可能包括Fmp27_SW (4～76, RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄起始保守域)、Cir_N (7～34, CBF1互作共抑制因子CIR的N末端保守域)、Metallophos (43～238, 具有水解酶活性域)、Kelch (60～109, 蛋白結(jié)合活性域)、ZnF_UBR1 (137～ 193, 鋅指蛋白N末端底物識別域)和 Costars domain (192～254, 結(jié)合肌動蛋白并調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞運(yùn)動)。同時運(yùn)用DNAMAN Version 6軟件將ZmPP6C與水稻、高粱和擬南芥的PP6C進(jìn)行了氨基酸水平的序列比對, ZmPP6C與擬南芥AtPyPP1和AtPyPP3的一致性均高達(dá)91.09％, 與水稻的一致性達(dá)96.04％, 與高粱的一致性更高達(dá)99.67％。利用 DNAMAN Version 6軟件將該蛋白與來自擬南芥、水稻、高粱、谷子、小麥、大麥、短柄草、油菜、大白菜、棉花、大豆等不同種屬的PP6C蛋白進(jìn)行氨基酸序列水平的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明, PP6C在玉米和高粱中具有高度一致性, 且無論是單子葉還是雙子葉植物, 其PP6C蛋白一致性均較高(圖3)。PP6C基因家族在植物進(jìn)化中的高度一致性, 暗示其功能的高度保守。

圖1　ZmPP6C的ORF的cDNA片段的RT-PCR擴(kuò)增及其克隆pEASY-ZmPP6C的雙酶切鑒定Fig. 1　RT-PCR fragment of ZmPP6C and double digestion of pEASY-ZmPP6C using Xba I and BamH I

圖2　玉米與擬南芥、水稻和高粱蛋白磷酸酶6亞基的氨基酸序列比對和結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2　Multiple sequence alignments and function domains of PP6Cs from Zea mays, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, and Sorghum bicolor

圖3　玉米PP6C與其他植物PP6C的氨基酸水平的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3　Phylogenetic analysis of amino acid sequences of ZmPP6C and other related PP6C

2.3ZmPP6C器官特異表達(dá)分析

基因在植物器官中的富集表達(dá)部位與其功能密切相關(guān), 為了研究玉米ZmPP6C的功能, 我們采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了B73成株不同器官中ZmPP6C的表達(dá)水平, 結(jié)果顯示該基因在B73的各個器官中均有表達(dá), 苞葉、葉柄和幼穗的相對表達(dá)量較高, 葉片中表達(dá)量最高, 大約是根中的8倍, 這暗示ZmPP6C可能在玉米葉片中發(fā)揮更重要的作用(圖4)。

2.4ZmPP6C響應(yīng)不同光質(zhì)處理的表達(dá)模式分析

葉片不僅是植物光合作用的主要場所, 也是感受不同光質(zhì)的主要器官。器官特異性表達(dá)分析顯示ZmPP6C在葉片中表達(dá)量最高, 暗示著ZmPP6C很可能參與植物對光的響應(yīng)。為了明確ZmPP6C對不同光質(zhì)的響應(yīng), 我們檢測了玉米自交系B73幼苗在黑暗和遠(yuǎn)紅光(FRc)、紅光(Rc)、藍(lán)光(Bc)和白光(WLc)條件下ZmPP6C的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示ZmPP6C在紅光和遠(yuǎn)紅光條件下表達(dá)豐度相似, 均為黑暗條件下的2倍(圖5); 其白光和藍(lán)光下的表達(dá)豐度分別是黑暗下的3.2倍和1.6倍。這表明ZmPP6C的確能夠受到光的調(diào)節(jié)。

為了進(jìn)一步了解ZmPP6C基因受光調(diào)節(jié)表達(dá)特性, 我們進(jìn)行了光質(zhì)轉(zhuǎn)換, 將黑暗中生長13 d的玉米自交系B73幼苗轉(zhuǎn)到遠(yuǎn)紅光(FR)、紅光(R)、藍(lán)光(B)和白光(WL)中, 并于0.25、0.5、1、2、4、8、12 和24 h驗(yàn)證ZmPP6C對各種光的響應(yīng)能力。在轉(zhuǎn)入遠(yuǎn)紅光、紅光和白光后, ZmPP6C表達(dá)豐度均表現(xiàn)為大幅度的升高; 其中在轉(zhuǎn)入遠(yuǎn)紅光30 min、紅光15 min和白光30 min的表達(dá)豐度達(dá)到峰值, 分別是黑暗中的15.7、9.0和3.1倍(圖6)。在轉(zhuǎn)入白光下1 h 后, ZmPP6C的表達(dá)豐度下降到黑暗的13％, 且在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定在黑暗的13％～26％水平(圖6-C)。轉(zhuǎn)入遠(yuǎn)紅光與轉(zhuǎn)入白光類似, 但其表達(dá)豐度高于轉(zhuǎn)入白光中(圖6-A)。在轉(zhuǎn)到紅光下30分鐘后, ZmPP6C的表達(dá)豐度急劇下降到黑暗的3.9％, 在1 h和4 h時2次小的回升, 分別是黑暗的0.8倍和2.2倍; 從8 h后穩(wěn)步上升, 直到24 h達(dá)到黑暗的7.2倍(圖6-B)。從黑暗轉(zhuǎn)藍(lán)光后, ZmPP6C豐度上下波動較小, 推測ZmPP6C響應(yīng)藍(lán)光的能力不強(qiáng)(圖6-D)。

2.5ZmPP6C的表達(dá)對長日和短日處理的響應(yīng)

為了更全面地了解ZmPP6C對光處理的反應(yīng)能力, 我們檢測了ZmPP6C的表達(dá)對長日和短日處理的響應(yīng)。在長日條件下, ZmPP6C的表達(dá)在光照和黑暗階段, 各有一個明顯的表達(dá)高峰, 分別出現(xiàn)在光下10 h時和轉(zhuǎn)入黑暗3 h時, 且是黑暗結(jié)束時的4.8倍和3.1倍。短日處理下, ZmPP6C表達(dá)調(diào)控模式較為復(fù)雜, 在光照和黑暗階段分別有2個和3個表達(dá)峰值(圖7)。光照階段的表達(dá)峰值出現(xiàn)在光照后2 h 和8 h, 分別達(dá)到黑暗結(jié)束時的1.9倍和5.5倍(圖7-A); 黑暗階段的表達(dá)峰值出現(xiàn)在進(jìn)入黑暗后6、10 和14 h, 分別達(dá)到黑暗結(jié)束時的2.5、9.9和3.0倍(圖7-B)?？梢奪mPP6C的表達(dá)能響應(yīng)長日和短日處理。

2.6ZmPP6C的表達(dá)對脅迫處理的響應(yīng)

由于擬南芥中PP6通過ABA信號途徑, 來參與對脅迫的調(diào)控[4], 為了進(jìn)一步了解ZmPP6C對脅迫

的響應(yīng), 我們檢測了ZmPP6C的表達(dá)對鹽漬(200 mmol L?1NaCl)、高滲透(20％ PEG-6000)和淹水(灌水沒根)處理的響應(yīng)。結(jié)果表明, 在0～3 h, 無論是否鹽漬處理ZmPP6C的表達(dá)變化不明顯, 維持在處理前的0.9～1.2倍(圖8-A); 在6 h, 非鹽漬處理樣品ZmPP6C的表達(dá)水平上升到處理前的2倍, 而鹽漬處理的表達(dá)仍未見明顯變化; 在12 h, 非鹽漬處理樣品ZmPP6C的表達(dá)下降, 而鹽漬處理表達(dá)上升,二曲線的交叉點(diǎn)出現(xiàn)在處理前的0.8倍; 在24 h和48 h, 非鹽漬處理樣品ZmPP6C的表達(dá)水平繼續(xù)到處理前的0.4倍, 而鹽漬處理表達(dá)繼續(xù)上升1.1倍(24 h)和2.6倍(48 h)。20％ PEG-6000處理類似于200 mmol L?1NaCl, 只是20％ PEG-6000處理1 h, ZmPP6C的表達(dá)量迅速下降, 并且ZmPP6C的較低表達(dá)水平(處理前的0.2～0.6倍), 一直維持到24 h; 而20％ PEG-6000處理48 h, ZmPP6C的表達(dá)水平上升到處理前的4.5倍(圖8-B)。淹水(灌水沒根)處理3～4 d, ZmPP6C的表達(dá)下降到未處理的20％～30％;處理5 d和7 d, ZmPP6C的表達(dá)上升到未處理的1.3倍和4.1倍; 隨著恢復(fù)正常溫室生長條件3 d和7 d, ZmPP6C的表達(dá)上升到未處理的3.0倍和6.9倍(圖8-C)?？梢? 與非脅迫處理相比, 鹽漬和高滲透處理抑制6 h ZmPP6C的表達(dá); ZmPP6C的表達(dá)對200 mmol L?1NaCl處理的響應(yīng)早于對20％ PEG-6000處理; 鹽漬、高滲透和淹水處理均導(dǎo)致ZmPP6C的表達(dá)顯著上調(diào)。

圖4　ZmPP6C的器官特異性表達(dá)的定量RT-PCR分析Fig. 4　qRT-PCR assays of ZmPP6C in different organs of maize

圖5　各種持續(xù)光質(zhì)條件下ZmPP6C轉(zhuǎn)錄表達(dá)的定量RT-PCR分析Fig. 5　qRT-PCR assays of ZmPP6C expression under different continuous light conditions

3　討論

PP6C是光敏色素蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的催化亞基[22,32], 催化磷酸化的蛋白質(zhì)分子去磷酸化反應(yīng), 在光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用[1,2,7]。光是影響植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因素之一, 首先光是能量物質(zhì), 光提供了植物光合作用的能量[33-35], 光合作用是植物生命活動過程中的重要組成部分, 是作物產(chǎn)量和品質(zhì)的基礎(chǔ); 缺乏光照會導(dǎo)致植株生長

受阻、株高增加、葉面積減少、葉片變黃[36-37]。再者, 光是信號物質(zhì), 植物通過光線提供的信息(光照節(jié)律、光照強(qiáng)度和光質(zhì)比例等)來及時調(diào)控其生長和發(fā)育進(jìn)程, 包括種子萌發(fā)、莖節(jié)伸長、向光性、避蔭性(shade avoidance)和開花期, 還包括作物的產(chǎn)量和品質(zhì)等[38-41]。本研究表明ZmPP6C在玉米的葉片中表達(dá)量最高(圖4), 同時ZmPP6C的表達(dá)響應(yīng)不同光質(zhì)處理(圖5)、黑暗到光的轉(zhuǎn)換(圖6), 以及長日和短日處理(圖7)等。ZmPP6C的表達(dá)響應(yīng)遠(yuǎn)紅光和紅光處理, 但受兩種光的表達(dá)模式差異較大, 轉(zhuǎn)入遠(yuǎn)紅光30分鐘達(dá)到峰值, 然后迅速下降, 直到24 h一直保持較低的水平(圖6-A); 轉(zhuǎn)入紅光15 min達(dá)到峰值, 迅速下降后表現(xiàn)迂回上升, 直到24 h達(dá)到黑暗的7.2倍(圖6-B)。擬南芥、水稻和玉米中的研究表明, 光敏色素B (phyB)是紅光的最主要受體, 而光敏色素A (phyA)主要是負(fù)責(zé)植物對遠(yuǎn)紅光的反應(yīng),它們與植物光形態(tài)建成、避蔭性以及生物產(chǎn)量等性狀密切相關(guān)[38,41]。另外, PHYA的過量表達(dá)或者PHYB缺失突變體能顯著地引起提早開花[34]; PHYA和PHYB轉(zhuǎn)基因的植株導(dǎo)致節(jié)間縮短、株高降低、株型緊湊、光合作用提高、促進(jìn)增產(chǎn)[41-46]。研究表明豌豆PP6能夠與擬南芥中光敏色素A (phyA)和光敏色素B (phyB)互作; 豌豆PP6基因在擬南芥中異源轉(zhuǎn)基因?qū)е麻_花延遲, 而擬南芥的2個PP6C同源基因AtFyPP1和AtFyPP3表達(dá)的下調(diào)卻引起開花提前[2]。盡管對光敏色素的激酶活性還沒有完全了解, 但業(yè)已證明它們磷酸化與其活性密切相關(guān)[38]; 很可能AtFyPP1和AtFyPP3通過與phyA和phyB的互作,導(dǎo)致它們磷酸化的喪失, 從而影響其活性。由于玉米僅有一個ZmPP6C基因, 而玉米PHYA和PHYB基因各有2個拷貝, ZmPP6C與ZmphyA1、ZmphyA2, ZmphyB1和ZmphyB2的互作模式, 以及在互作與它們活性之間的關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6　黑暗轉(zhuǎn)入不同光質(zhì)條件下ZmPP6C轉(zhuǎn)錄表達(dá)的定量RT-PCR分析Fig. 6　qRT-PCR assays of ZmPP6C expression during transition from darkness to different light conditions

圖7　長日和短日條件下ZmPP6C轉(zhuǎn)錄表達(dá)的定量RT-PCR分析Fig. 7　qRT-PCR assays of ZmPP6C under long day and short day conditions

模式植物擬南芥中的研究表明, 高等植物開花的光周期調(diào)控是由光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因與開花相關(guān)的生物鐘途徑(circadian clock)相關(guān)基因如GI (GIGANTEA)、CO (CONSTANS)和FT (FLOWERING LOCUS T)共同完成的[47-50]。在光周期敏感自交系CML288中, CO的同源基因ZmCOL的表達(dá)在長短日照條件下均有2個峰值[51,52]。本研究表明玉米ZmPP6C的表達(dá)響應(yīng)長日和短日處理(圖7), ZmPP6C在長日下的第1個高峰是光照后10 h, 低谷是進(jìn)入黑暗之前(圖7), 這與光周期敏感自交系CML288的ZmCOL完全一致[51,52]; 我們還發(fā)現(xiàn), 在短日照下ZmPP6C表達(dá)高峰發(fā)生的時間都提前于長日照, 前人對ZmGI研究也有著同樣的現(xiàn)象[51,52]。ZmPP6C與開花調(diào)控基因ZmGI、ZmCOL和ZmFT之間是否存在關(guān)聯(lián), 能否利用RNAi或轉(zhuǎn)基因技術(shù)修飾ZmPP6C基因進(jìn)行開花性狀的改良, 值得探討。此外, 水稻基因組中含有5個PP2Ac類磷酸酶基因, 在鹽敏感水稻品種9311中OsPP2Ac-2、OsPP2Ac-3和OsPP2Ac-5的表達(dá)上調(diào)、OsPP2Ac-4的表達(dá)下調(diào); 在耐鹽水稻品種“蘭勝”中OsPP2Ac-4的表達(dá)上調(diào)[5,53]; 并且小麥TaPP2Ac-1基因的表達(dá)受高鹽、ABA和低溫誘導(dǎo)[25]。本研究表明ZmPP6C不但包含1個PP2Ac結(jié)構(gòu)域,同時ZmPP6C的表達(dá)響應(yīng)鹽漬、高滲透和淹水脅迫處理, 表明玉米ZmPP6C參與了植株對脅迫的應(yīng)答,但其作用機(jī)制需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖8　非生物脅迫條件下ZmPP6C轉(zhuǎn)錄表達(dá)的定量RT-PCR分析Fig. 8　qRT-PCR assays of ZmPP6C under different abiotic stress conditions

4　結(jié)論

ZmPP6C與高粱和擬南芥的PP6C具有高度同源性, 具有PP2Ac結(jié)構(gòu)域; ZmPP6C在玉米葉片中高表達(dá), 能受到不同光質(zhì)的影響, 特別響應(yīng)遠(yuǎn)紅光和紅光處理; 也對長日和短日處理響應(yīng), 其表達(dá)在長日條件下的光照和黑暗階段各有1個明顯的表達(dá)高峰, 在短日條件下的光照和黑暗階段分別有2個和3個表達(dá)峰值; 同時, ZmPP6C還響應(yīng)高滲透、鹽漬和淹水等脅迫處理, 出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)。ZmPP6C在玉米光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、開花與脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用, 其分子與生化機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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Molecular Cloning of ZmPP6C Gene and Its Expression Patterns in Response to Light and Stress Treatments in Maize (Zea mays L.)

YUAN Huan-Huan1,2,**, SUN Guang-Hua1,2,**, YAN Lei2, GUO Lin2, FAN Xiao-Cong1,2, XIAO Yang3, MENG Fan-Hua2, SONG Mei-Fang2,4, ZHAN Ke-Hui1, YANG Qing-Hua1,*, and YANG Jian-Ping1,2,*
1College of Agronomy, Henan Agricultural University / Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Zhengzhou 450002, China;2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;4Beijing Radiation Center, Beijing 100875, China

Abstract:PP6C is the catalytic subunits of Ser/Thr protein phosphatase 6 (PP6) gene, which plays important roles in auxin transport polarity, ABA (abscisic acid) signal transduction, flowering time control though light signaling pathway. To clarify structural characteristics of PP6C protein and the evolution relationships among plant PP6C homologs, we cloned ZmPP6C gene by RT-PCR. The open reading frame (ORF) of ZmPP6C possesses 912 nucleotides and encodes 303 amino acid residues with one PP2Ac domain (the catalytic subunits of Ser/Thr protein phosphatase 2A). Phylogenetic analysis indicated that ZmPP6C belongs to the same branch with the PP6C of Sorghum bicolor, and shows high similarity to all PP6C proteins from other monocotyledons and dicotyledons. Further quantitative RT-PCR (qRT-PCR) assays indicated that ZmPP6C was highly expressed in leaf and lowly

in stem, stamen, pulvinus, sheath, and pedical. ZmPP6C transcription abundances could respond to different light and circadian treatments (both long-day and short-day conditions), especially to the light transitions from the dark to far-red or red light condition. In addition, ZmPP6C transcription abundances were up-regulated by high osmosis, high salt and water logging. Our results suggested that ZmPP6C may be involved in light signaling pathway, flowering time control, and abiotic stress response in maize, and its roles in crop improvement are worthy of more exploration in the future.

Keywords:Zea mays; ZmPP6C; Expression patterns; Phytochrome; Light signaling pathway; Abiotic stress

收稿日期Received(): 2015-08-27; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2015-12-07.

通訊作者*(Corresponding authors): 楊青華, E-mail: yangqh2000@163.com, Tel: 0371-63555778; 楊建平, E-mail: yangjianping02@caas.cn, Tel: 010-82105859**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

DOI:10.3724/SP.J.1006.2016.00170